막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구<em&gt; 생체</em

요약

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

초록

막 단백질은 세포 생존에 필수적이며, 따라서 중요한 치료 표적 ^1-3이다. 그들은 단지 ^4에서 작동하기 때문에, 상호 작용을 파악하고 특징 짓는 방법은 ⁵ 필요합니다. 이를 위해, 우리는 막 척추 ^6라고 불리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용의 실험을 개발했다. 이 기술은 연쇄상 태깅 막 미끼 단백질의 친화도 정제하여 리버시블 가교제 포름 알데히드를 사용하여 가교 생체 내에서 결합한다. 절차 중에 가교 먹이 단백질은 막 단백질을 미끼로 공동 정제이어서 비등에 의해 분리된다. 막 등뼈를 사용하여 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)를 분석 할 때 따라서, 두 가지 주요 작업을 실행할 수 있습니다 : 첫 번째, 면역 블, 그리고에 의해 제안 된 상호 작용 파트너의 확인 번째, 질량 분석 분석에 의해 새로운 상호 작용 파트너의 식별 . 또한,도 L친화력 아야, 과도 프로톤 펌프 억제제는이 기술에 의해 감지됩니다. 마지막으로, 막 척추는 막 단백질의 프로톤 펌프 억제제를 식별 할 수있는 강력한 검사 도구로 적용하고, 거의 모든 세포 유형에 적응할 수있다.

서문

단백질의 기능을 이해하기 위해 그것의 파트너 상호 작용을 아​​는 것이 필수적이다. 여러 고전적인 기술은 수용성 단백질의 상호 작용 파트너의 ID를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 소수성 ^4에 의한 막 단백질을 쉽게 양도 할 수 없습니다. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용 실험 (막 척추) ^6을 개발했습니다. 그것은 수용성 단백질 ⁷ 만 적합한 척추 방법을 기반으로합니다.

가교제의 포름 알데히드의 두 가지 장점에서 막 척추의 장점은 첫째, 포름 알데히드는 쉽게 세포막을 통과하기 때문에 살아있는 세포 ⁸ interactome의 정확한 스냅 샷을 생성 할 수 있습니다. 둘째, 포름 알데히드 상호 링크는 ^{9 끓는으로} 되돌릴 수 있습니다. 여기서, 이러한 두 가지 이점은 멤브레인 PROTE 영구 아니라 과도 프로톤 펌프 억제제뿐만를 식별하는 데 사용기능 ^6.

요컨데, 패 혈성-태그가 일체형 멤브레인 미끼 단백질의 C-말단에 융합된다. 막 미끼 단백질을 발현하는 세포는 간 링크가 막 미끼 단백질로 단백질을 먹이로 포름 알데히드 (그림 1)와 함께 배양된다. 먹이 단백질의 수정은 필요하지 않습니다. 다음에, 막 분획을 제조하다. 따라서, 막 단백질은 단백질이 친화력 정화를 먹이 단백질과 공동으로 정제되어 세제 처리 및 미끼에 의해 용해된다. 이어서, 가교가 비등하여 반전되고, 미끼 및 그 공동 용출 먹이 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 마지막으로, 먹이 단백질은 면역 블롯 분석 또는 질량 분석법에 의해 확인 될 수있다.

프로토콜

참고 : 프로토콜에 표시된 버퍼에 대한 자세한 정보는 표 1에서 사용할 수 있습니다.

1. 포름 알데히드는 살아있는 세포 간 연결하여 단백질 - 단백질 상호 작용의 고정

1. 성장 미디어, 주식 솔루션 및 버퍼 P1을 준비 시작하려면
   1. 500 ㎖의 배지를 준비 매체 막 미끼 단백질과 먹이 단백질 간의 상호 작용을 지원하는 조건을 제공한다. 또, 하나의 실험에서는 어떠한 상호 작용 (가교없이 예) 예상되는 조건 하에서 수행되어야한다.
      참고 : 우리는 스트레스가 아닌 스트레스를 박테리아의 단백질 - 단백질 상호 작용을 비교합니다. 따라서, 우리는 우리가 2 L 삼각 플라스크에 스트레스 유도제 (예를 들어, 0.5 M의 NaCl)으로 보완 500 ㎖의 루리아 베르 타니 (LB) 배지 (표 1)를 준비하고 있습니다. 제어를 위해, 우리는 0.17 M 염화나트륨 (산도 7.0)와 일반 LB 매체를 사용합니다.
   2. 트리스 버퍼를 준비합니다 (20 mM 트리스-HCL;의 pH 8.0) 및 0.1 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), pH를 8.0 원액 (표 1).
   3. 버퍼 P1을 준비합니다. 트리스 완충액에서 0.5 M의 최종 농도에 자당을 용해. 여과에 의해 버퍼 P1을 소독하고 4 ℃에서 저장
2. 벡터에서 C-말단 패 혈성 태그 융합으로 막 미끼 단백질을 발현하는 세포를 성장. 충분한 시간 동안 멤브레인 미끼 단백질의 발현을 유도한다.
   참고 : 우리는 500 ml의 매체에 250 ㎕의 1 M 이소 프로필-β-D-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 초기 로그 단계 (A ₆₀₀ = 0.3)에서 (최종 농도 : 0.5 mm)를 세균의 막 미끼 단백질의 발현을 유도 . 충분히 식을 수 있도록하기 위해, 우리는 늦은 로그 단계 (A ₆₀₀ = 1.2) 때까지 박테리아를 배양한다.
3. 300 ㎖의 각각의 최소 볼륨 각 문화 두 개의 원심 분리기 비커를 준비하고 얼음에 배치합니다.
4. 포름 알데히드 가교를 수행합니다.
   CAUTION : 포름 알데히드는 독성이 강한 우리가 안전 흄 후드에서 작업하는 것이 좋습니다..
   1. 안전 흄 후드에서 배양 용기를 전송합니다. (- X)와 가교 포름 알데히드 (+ X)를 포함하여 한 두 개의 샘플, 가교를 생략 하나에 각각의 샘플을 분할합니다. 0.6 %의 최종 농도에 도달하기 위해 250 ㎖의 배양을 4 ml의 37 % 포름 알데히드 용액을 추가.
5. 다시 문화 혈관을 전송하고 이전과 추가 20 분 동안 세포를 성장.
6. 안전 흄 후드 아래에 원심 분리기 튜브로 문화를 기입하십시오. 30 분 3,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다.
7. 신중하게 안전 연기 후드 아래에 그것을 피펫으로 상층 액을 버린다. 독성 포름 알데히드 함유 상층 액을 수집하고 적절하게 처리하십시오.
8. 막 단백질의 준비 기간 동안 최적의 수율에 도달하기 위해 먼저 spheroplasts를 준비합니다. 여기, 우리는 그람 음성 박테리아의 스페 형성을위한 프로토콜을 제공 :
   1. Prepar전자 버퍼 P2 (표 1) 동결 건조 분말. 부드럽게 1.5 ML 튜브에, 0.1 M EDTA, pH가 8에서 2 밀리그램의 라이소자임을 녹입니다. 항상 실험의 하루 갓 버퍼 P2를 준비합니다.
   2. 단백질 분해 효소 억제제 (버퍼 P3)과 트리스 버퍼를 준비합니다. 트리스 완충액 10 ㎖로, 10 mM의 최종 농도로 0.1 ㎖의 1 M 페닐 메틸 (PMSF) (표 1)을 추가한다. 프로테아제 억제제 PMSF의 기능이 제대로 동작하는지 확인하기 위해 즉시 버퍼를 사용합니다.
   3. 단백질 분해 효소 억제제와 15 ML 원뿔 튜브로 전송 솔루션 10 ㎖ 트리스 버퍼를 Resuspend 세포 펠렛.
   4. 1 ㎖ 버퍼 P2를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어.
   5. 30 분 3,000 XG에서 원심 분리하여 spheroplasts를 수집하고 조심스럽게 상층 액을 버린다.
9. -20 ℃에서 하룻밤 스페 펠렛을 품어

2. 패 혈성 태그의 막 단백질의 정제 (미끼)

1. 얼음에 스페 펠렛을 놓습니다.
2. 스페 펠렛은 얼음에 해동 시간 동안 각 스페 준비를 위해 10 ㎖ 버퍼 P3를 준비합니다. 조심스럽게 10 ML 트리스 버퍼에 1 mg의 DNaseI을 녹입니다. 사용 직전에 0.1 ㎖의 1 M의 PMSF를 추가합니다.
3. 6 ㎖를 새로 제조 P3에서 펠렛을 재현 탁. spheroplasts을 방해하기 위해, 각 버스트 사이에 1 분의 일시 정지와 얼음에 지속적으로 1 분 동안 샘플 네 번 초음파 처리.
4. 수확 된 세포 파편을 10 분 동안 10,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 초원 심 분리기 튜브에 피펫을 사용하여 상층 액을 전송합니다.
5. 30 분 동안 100,000 XG에서 막 분획을 펠렛. 를 용해하지 않고 트리스 버퍼에 조심스럽게 펠렛을 씻으십시오. 종이 조직 (예를 들면 휴지)와 튜브를 건조. 언제든지 펠​​렛을 방해 피한다.
6. 1 ㎖ 트리스 버퍼에 조심스럽게 펠렛 (= 세포막을)를 Resuspend. 예 BCA 분석하여 단백질 농도를 결정하기 위해 20 μL 나누어지는을 사용합니다. 이 단계에서, 멤브레인은 충격에 리 얼 수pond 지폐 질소 -80 ° C.에 저장

3. 패 혈성 태그 막 미끼 단백질 및 SDS-PAGE의 정화

1. 트리스 완충액으로 5 ㎎ / ㎖로 막 분획의 단백질 농도를 정상화. 초 원심 분리기 튜브에 2.5 ml의 막 분획 (5 ㎎ / ㎖)를 취하여 막 단백질을 가용화하기 위해, 2 %의 최종 농도에 도달하기 위해 20 % 트리톤 X-100의 0.25 mL를 넣고. 마이크로 자석 막대를 추가하고 1 시간 동안 얼음에 저어.
   참고 : 일반적으로 우리는 세제로 트리톤 X-100을 사용하여 좋은 결과를 가지고 있지만, 그것은 최적화를위한 세제를 변경하는 것이 유용 할 수 있습니다. 이러한 관점에서, 우리는 각각의 멤브레인 미끼 단백질의 기능적 정제에 사용되는 세제 최상의 결과가있다.
2. 3.1 단계를 수행하는 동안, 50 ㎖는 (표 1)에서 W와 5 ㎖ 버퍼 E 버퍼 준비합니다. 10 ㎖ 5 배 버퍼 W 농축 ML 50을 입력하고 150 ㎕의 20 % 트리톤 (Triton) X-100을 추가합니다.
   1. 1 ㎖ 배 buffe를 기입R의 E의 10 ㎖로 농축하고 30 ㎕의 20 % 트리톤 (Triton) X-100을 추가합니다. 8 ㎖의 버퍼 W.와 1 ㎖ 패 혈성-Tactin superflow 중력 흐름 열 평형
      주 : 정제 절차 중에 어떤 버퍼 내의 임계 미셀 농도 (CMC) 이상의 농도의 10 배에서의 가용화에 사용되는 세제를 추가하는 것이 필수적이다.
3. 불용성 막 분획을 펠렛 30 분 동안 100,000 XG에서 가용화 샘플 및 초 원심 분리기에서 마이크로 자기 막대를 제거한다. 추가의 정제를위한 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다.
4. 열을 뜨는을로드합니다. 중력의 흐름에 열을 실행합니다. 이 세척 단계 배를 반복하여 5 ㎖ 버퍼 W.에 열을 씻으십시오.
5. 이 용출 단계 반복 배속 1 ㎖ 버퍼 E.으로 막 미끼 단백질을 용출.
6. 원심 분리 필터 장치로 용출 분획 2, 3 및 4-300 μl를 집중한다.
7. 50 ㎕의 5 배 SDS-PAG 각 샘플의 200 μl를 혼합E 로딩 염료. 125 μL 씩 분주 각 준비를 분할합니다. 포름 알데히드 상호 링크를 반대하는, 95 ° C에서 20 분 동안 각각 준비 하나 나누어지는 끓인다. 샘플 벤치 위에 적어도 10 분 동안 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
8. 면역 블롯에 적합한 폴리 아크릴 아마이드 겔의 하나의 레인에로드 각 시료 30 μl를. 가장 좋은 방향으로의 prestained 분자량 마커를 사용하여 SDS-PAGE ^(10)을 실행합니다.

4. 면역 블롯 분석 상호 작용 파트너를 확인하려면

1. 일단 7.6이 예 반 건조하여 니트로 셀룰로오스 막에 전사 단백질을 완료 단계.
2. 비특이적 라벨링을 방지하는 멤브레인을 차단. 0.05 % 트윈 -20 (TBS-T)의 최종 농도로 보충 트리스 - 완충 식염수 부피 당 3 중량 %를 달성하기 위해 소 혈청 알부민 (BSA)을 계량하여 차단 완충액 준비한다. 멤브레인을 포함하는 버퍼를 차단하는 충분한 양을 사용합니다. 실온에서 1 시간 동안 멤브레인을 차단합니다.
3. 희석ND 평소와 같이 먹이 단백질 특정 첫 번째 항체를 배양한다. 두 번째 항체로 HRP 결합 된 항체를 사용합니다.
4. 고감도 화학 발광 검출 키트를 사용하여 면역 블롯을 개발한다. 고전 막 처리 절차 또는 디지털 촬영 장비를 사용하여 신호를 모니터한다.

5. 상호 작용 파트너를 식별하는 NanoLC-ESI-MS/MS 높은 해상도 실험

1. 확인되어야한다 특정 항체가 먹이 단백질 또는 알 수없는 상호 작용 파트너를 사용할 수없는 경우, 식별을위한 질량 분석 (MS)를 사용합니다. 각질 오염을 방지하기 위해서, 단백질 분리를위한 precasted 겔을 사용한다.
2. 실버는 제조자의 프로토콜에 따라 MS 호환 염색 키트를 사용하여 SDS-PAGE 얼룩. 유리 탱크에있는 염색 및 세척 단계를 수행합니다.
3. 소비세 각 밴드와는 고해상도 LC / MS ^(9)에 의해 이들을 분석한다.

결과

멤브레인 척추 분석은 막 단백질의 공동 정화 및 일시적으로 상호 작용 단백질 파트너를 허용한다. 공동 정제는 가교제 포름 알데히드를 사용함으로써 달성된다. 포름 알데히드 농도 및 가교 시간 : 두 매개 변수는 비특이적 교차 결합을 방지하기 위해 중요하다. 포름 알데히드의 과도한 충분하지만, 사용하지 않는 간단 면역 블 롯팅에 의해 제어 될 수있다. 포름 알데히드 가교 결합 된 단백질 복...

토론

막 척추 분석을 확인하고 막 단백질의이 시점 알 수없는 상호 작용 파트너 식별을 가능하게하는 생화학 적 방법입니다. 막 척추 연쇄상 구균 태그가 막 미끼 단백질의 정제와 포름 알데히드에 의해 생체 내 가교에 결합한다. 면역 블로와의 조합은 예상 상호 작용 파트너의 확인 (그림 2)을 용이하게한다. 또한, MS의 분석과 함께 알 수없는 상호 작용 파트너의 식별 (그림 3)?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge