Membrana-COLUMNA: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de Proteínas de la Membrana<em&gt; En Vivo</em

Resumen

Un enfoque bioquímico se describe para identificar in vivo interacciones proteína-proteína (PPI) de proteínas de membrana. El método combina la reticulación de proteínas, purificación por afinidad y espectrometría de masas, y es adaptable a casi cualquier tipo de célula u organismo. Con este enfoque, incluso la identificación de los IBP transitorios se hace posible.

Resumen

Las proteínas de membrana son esenciales para la viabilidad celular y son, por tanto, importantes objetivos terapéuticos ^1-3. Desde que funcionan en los complejos ^4, los métodos para identificar y caracterizar sus interacciones son necesarias ^5. Con este fin, hemos desarrollado el Strep-proteína de membrana experimento de interacción, denominada membrana-COLUMNA ^6. Esta técnica combina en vivo entrecruzamiento reversible mediante el formaldehído reticulante con la purificación por afinidad de una proteína de membrana de cebo-Strep etiquetado. Durante el procedimiento, las proteínas presa reticulados son co-purificadas con la proteína cebo membrana y posteriormente separados por ebullición. Por lo tanto, dos grandes tareas se pueden ejecutar en el análisis de las interacciones proteína-proteína (PPI) de las proteínas de membrana mediante membrana-COLUMNA: en primer lugar, la confirmación de un compañero de interacción propuesto por inmunotransferencia, y en segundo lugar, la identificación de nuevos socios de la interacción mediante el análisis de espectrometría de masas . Además, incluso lOW afinidad, IBP transitorios son detectables por esta técnica. Por último, la Membrana-ESPINA es adaptable a casi cualquier tipo de célula, por lo que es aplicable como herramienta de detección de gran alcance para identificar los IBP de proteínas de membrana.

Introducción

Para entender la función de una proteína que es esencial conocer sus compañeros de interacción. Varias técnicas clásicas están disponibles para la identificación de parejas de interacción de proteínas solubles. Sin embargo, estas técnicas no son fácilmente transferibles a proteínas de la membrana debido a su naturaleza hidrófoba ^4. Para superar esta limitación, hemos desarrollado la membrana Strep-proteína interacción experimento (Membrana-COLUMNA) ^6. Se basa en el método de columna vertebral, que era sólo es adecuado para proteínas solubles ^7.

Beneficios de membrana-espina dorsal de dos ventajas de la formaldehído agente de reticulación: primero, el formaldehído pueden penetrar fácilmente las membranas y por lo tanto genera una instantánea precisa de la interactoma de una célula viva ^8. En segundo lugar, formaldehído enlaces cruzados pueden revertirse mediante ebullición ^9. Aquí, estas dos ventajas se utilizan para identificar no sólo los IBP permanentes pero también transitorios de prot membranains ^6.

En breve, un Strep-etiqueta se fusiona al C-terminal de la proteína cebo integral de membrana. Las células que expresan la proteína cebo de membrana se incuban con formaldehído que los enlaces cruzados se aprovechan de las proteínas a la proteína cebo membrana (Figura 1). No son necesarias modificaciones de las proteínas de la presa. A continuación, la fracción de membrana se prepara. Por lo tanto, las proteínas de membrana se solubilizan por tratamiento con detergente y cebo proteínas son co-purificadas con sus proteínas presa utilizando la purificación por afinidad. Posteriormente, la reticulación se invierte por ebullición, y el cebo y sus proteínas presa co-eluidos se separan por SDS-PAGE. Finalmente, las proteínas presa pueden ser identificados por análisis de inmunotransferencia o espectrometría de masas.

Protocolo

Nota: La información detallada sobre los buffers que fija el Protocolo se encuentra disponible en la Tabla 1.

1. La fijación de las interacciones proteína-proteína por formaldehído entrecruzamiento en células vivas

1. Para comenzar a preparar los medios de crecimiento, las soluciones madre y tampón P1
   1. Preparar medio 500 ml: El medio debe ofrecer condiciones que apoyan la interacción entre la proteína cebo membrana y las proteínas de la presa. Además, un experimento debe realizarse en condiciones en que no se espera interacción (por ejemplo, sin entrecruzamiento).
      Nota: Se comparan las interacciones proteína-proteína en bacterias estresadas y no estresadas. Por lo tanto, preparamos 500 ml de medio Luria Bertani (LB) (Tabla 1) que complementamos con un agente de inducción de estrés (por ejemplo, NaCl 0,5 M) en un matraz Erlenmeyer de 2 l. Para el control, se utiliza medio normal LB con NaCl 0,17 M (pH 7,0).
   2. Preparar tampón Tris (20 mM de Tris-HCl, pH 8,0) y 0,1 M de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), pH de la solución de stock 8,0 (Tabla 1).
   3. Prepare el tampón P1. Disolver la sacarosa a una concentración final de 0,5 M en tampón Tris. Esterilizar tampón P1 por filtración y almacenarlo a 4 ° C.
2. Se cultivan las células que expresan la proteína cebo membrana con un Strep-tag de fusión C-terminal de un vector. Inducir la expresión de proteínas de cebo de la membrana durante un tiempo suficiente.
   Nota: Se inducen la expresión de proteínas cebo membrana bacteriana en la fase temprana-log (a ₆₀₀ = 0,3) mediante la adición de 250 l 1 M isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a 500 ml de medio (concentración final: 0,5 mM) . Para permitir una expresión suficiente, nos Incubar las bacterias hasta que la última fase-log (A ₆₀₀ = 1,2).
3. Preparar para cada cultura dos vasos de centrífuga con un volumen mínimo de 300 ml cada uno y colocarlos en hielo.
4. Realice formaldehído entrecruzamiento.
   CAUCIÓN: El formaldehído es altamente tóxico Recomendamos trabajar bajo una campana de seguridad..
   1. Transferir el recipiente de cultivo bajo una campana de seguridad. Dividir cada muestra en dos muestras, una omisión de reticulación (- X) y uno incluyendo el formaldehído de reticulación (X +). Añadir 4 ml de solución de formaldehído al 37% a la cultura de 250 ml hasta alcanzar una concentración final de 0,6%.
5. La transferencia de los recipientes de cultivo de vuelta y hacer crecer las células durante 20 minutos más que antes.
6. Llene sus culturas en los tubos de centrifugación bajo una campana de humos seguridad. Recoger las células por centrifugación a 3000 xg durante 30 min.
7. Desechar el sobrenadante con la pipeta cuidadosamente bajo una campana de humos seguridad. Recoger tóxico sobrenadante que contiene formaldehído y disponer de ella adecuadamente.
8. Con el fin de alcanzar un rendimiento óptimo durante la preparación de proteína de membrana, preparar esferoplastos primero. Aquí, proporcionamos un protocolo para la formación de esferoplastos de bacterias Gram-negativos:
   1. Prepartampón E P2 (Tabla 1) a partir de polvo liofilizado. Disolver suavemente 2 mg de lisozima en 0,1 M EDTA, pH 8, en un tubo de 1,5 ml. Siempre prepare tampón P2 recién para el día del experimento.
   2. Preparar tampón Tris con inhibidor de la proteasa (tampón P3). Para 10 ml de tampón Tris, añadir 0,1 ml de 1 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (Tabla 1) a una concentración final de 10 mM. Utilice el tampón de inmediato, para garantizar el funcionamiento correcto de PMSF como inhibidor de la proteasa.
   3. Resuspender los sedimentos celulares en 10 ml de Tris-tampón con inhibidor de la proteasa y la solución de la transferencia a un tubo cónico de 15 ml.
   4. Añadir 1 ml de tampón P2 e incubar en hielo durante 30 min.
   5. Recoger esferoplastos por centrifugación a 3000 xg durante 30 min y desechar el sobrenadante cuidadosamente.
9. Incubar los pellets esferoplastos noche a -20 ° C.

2. Purificación de Strep-tag de proteínas de membrana (Bait)

1. Coloque pellet esferoplasto en hielo.
2. Durante el tiempo de los pellets de esferoplastos se descongelan en hielo, preparar 10 ml de tampón P3 para cada preparación de esferoplastos. Disolver suavemente 1 mg de ADNasa I en 10 ml de tampón Tris. Añadir 0,1 ml de 1 M PMSF justo antes del uso.
3. Resuspender el sedimento en 6 ml de P3 recién preparada. Sonicar la muestra cuatro veces durante 1 min en hielo continuamente con 1 min de pausa entre cada ráfaga, con el fin de interrumpir esferoplastos.
4. Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 10 min a restos celulares de la cosecha. Transferir el sobrenadante con una pipeta a un tubo de ultracentrífuga.
5. Pellet la fracción de membrana a 100.000 xg durante 30 min. Lavar el sedimento cuidadosamente en tampón Tris sin disolverla. Secar el tubo con un tejido de papel (por ejemplo pañuelos de papel). Evitar alterar el sedimento en cualquier momento.
6. Resuspender el sedimento (= membranas) con cuidado en 1 ml de tampón Tris. Utilice una alícuota de 20 l para determinar la concentración de proteína mediante el ensayo de BCA por ejemplo. En este paso, las membranas se pueden choque congelados en lilibras de nitrógeno y se almacenó a -80 ° C.

3. Purificación de Strep-tag Membrana Bait proteínas y SDS-PAGE

1. Normalizar la concentración de proteína de la fracción de membrana a 5 mg / ml con tampón Tris. Tomar 2,5 ml de fracción de membrana (5 mg / ml) en un tubo de ultracentrífuga y añadir 0,25 ml de 20% de Triton X-100 para llegar a una concentración final de 2%, con el fin de solubilizar las proteínas de la membrana. Añadir una varilla de micro-magnético y se agita en hielo durante 1 h.
   Nota: Aunque en general tenemos buenos resultados utilizando Triton X-100 como detergente, puede ser útil para cambiar el detergente para la optimización. A este respecto, tenemos mejores resultados con los detergentes utilizados para la purificación funcional de la respectiva proteína cebo membrana.
2. Durante la realización de la etapa 3.1, preparar 50 ml de tampón W y 5 ml de tampón E a partir de (Tabla 1). Llenar hasta 10 ml 5x tampón W concentrado a 50 ml y añadir 150 l 20% de Triton X-100.
   1. Llenar 1 ml 5x buffeR E concentrado a 10 ml y añadir 30 l 20% de Triton X-100. Equilibrar una columna de flujo de 1 ml de Strep-Tactin gravedad SuperFlow con 8 ml de tampón de W.
      Nota: Es esencial para añadir el detergente que se usa para la solubilización en una concentración 10 veces por encima de la concentración micelar crítica (CMC) en cualquier tampón durante el procedimiento de purificación.
3. Retire la varilla de micro-magnética de la muestra de solubilización y ultracentrífuga a 100.000 xg durante 30 min, para sedimentar la fracción de membrana insolubles. Eliminar el sobrenadante con una pipeta para su posterior purificación.
4. Cargar el sobrenadante a la columna. Ejecute la columna sólo con flujo por gravedad. Lavar la columna con 5 ml de tampón de W. Repita este paso de lavado 5x.
5. Eluir cebo proteínas de membrana con 1 ml de tampón E. Repita este paso de elución de 4x.
6. Concentrar las fracciones de elución 2, 3, y de 4 a 300 L con una unidad de filtro centrífugo.
7. Mezclar 200 l de cada muestra con 50 l 5x de SDS-PAGCarga de colorante E. Dividir cada preparado en 125 ml de alícuotas. Hervir una alícuota de cada preparación durante 20 min a 95 ° C, para revertir formaldehído enlaces cruzados. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos en el banco superior.
8. De carga 30 l de cada muestra a un solo carril de un gel de poliacrilamida-adecuado para inmunotransferencia. Use un marcador prestained peso molecular para la mejor orientación y ejecutar SDS-PAGE ^10.

4. Análisis de inmunotransferencia para confirmar los compañeros de interacción

1. Una vez paso 3.8 se completa, proteínas de transferencia a una membrana de nitrocelulosa por ejemplo semiseco.
2. Bloquear la membrana para evitar que el etiquetado no específica. Preparar tampón de bloqueo mediante el pesaje de albúmina de suero bovino (BSA) para lograr 3% en peso por volumen en solución salina tamponada con Tris suplementado con una concentración final de 0,05% de Tween-20 (TBS-T). Utilice un volumen suficiente de tampón de bloqueo para cubrir la membrana. Bloquear la membrana durante 1 hora a TA.
3. Diluir unand incubar el primer anticuerpo específico presa de proteínas como de costumbre. Utilice un anticuerpo unido a HRP como el segundo anticuerpo.
4. Desarrollar el inmunoblot utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia con una alta sensibilidad. Supervisar la señal utilizando un procedimiento de procesamiento de películas clásicas o equipos de imagen digital.

5. Los experimentos de alta resolución NanoLC-ESI-MS/MS identificar a los socios de interacción

1. En caso de que ningún anticuerpo específico disponible para la presa de proteínas o compañeros de interacción desconocidos se debe identificar, utilizar la espectrometría de masas (MS) para la identificación. Con el fin de evitar la contaminación de la queratina, utilizar geles PREFABRICADOS DE HORMIGON para la separación de proteínas.
2. Silver Stain la SDS-PAGE usando un kit de tinción compatibles-MS de acuerdo con el protocolo del fabricante. Realice todos los pasos de tinción y lavado de tanques de vidrio.
3. Impuestos Especiales respectivas bandas y analizar estos por alta resolución LC / MS ^9.

Resultados

Análisis COLUMNA membrana permite la co-purificación de proteínas de membrana y proteínas asociados transitoriamente interactúan. El co-purificación se logra mediante el uso de la formaldehído agente de reticulación. Dos parámetros son fundamentales para evitar inespecíficos enlaces cruzados: la concentración de formaldehído y el tiempo de reticulación. El uso suficiente, pero no excesiva de formaldehído puede ser fácilmente controlado por inmunotransferencia. Complejos de proteínas reticuladas-formaldeh...

Discusión

Análisis COLUMNA membrana es un enfoque bioquímico que permite a uno para confirmar e identificar a este punto desconocidos compañeros de interacción de proteínas de membrana. COLUMNA membrana combina in vivo reticulación por formaldehído con la purificación de una proteína cebo membrana-Strep etiquetado. La combinación con inmunotransferencia facilita la confirmación de parejas de interacción predichas (Figura 2). Además, la combinación con el análisis de MS permite la identific...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge