Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em&gt; In Vivo</em

Zusammenfassung

Eine biochemische Ansatz beschrieben, um die in vivo-Protein-Protein-Interaktionen (PPI) der Membranproteine ​​zu identifizieren. Das Verfahren kombiniert Proteinvernetzung, Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie, und ist an fast jedem Zelltyp oder Organismus. Mit diesem Ansatz wird auch die Identifizierung der transienten PPI möglich.

Zusammenfassung

Membranproteine ​​sind essentiell für die Lebensfähigkeit der Zellen und sind daher wichtige therapeutische Ziele ^3.1. Da sie in den Komplexen ⁴ funktionieren, sind Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung ihrer Wechselwirkungen notwendig ^5. Zu diesem Zweck haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment genannt Membran-Dorn ^6. Diese Technik kombiniert in vivo Vernetzen unter Verwendung des reversiblen Vernetzungsmittel Formaldehyd mit Affinitätsreinigung von Strep-tag eine Membran Köderprotein. Während des Verfahrens sind vernetzte Beuteproteine ​​mit der Membran Köderprotein co-gereinigt und anschließend durch Kochen getrennt. Daher können zwei wichtige Aufgaben bei der Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) von Membranproteinen mit Membran-Dorn ausgeführt werden: erstens die Bestätigung einer vorgeschlagenen Interaktionspartner durch Immunoblotting, und zweitens die Identifizierung neuer Interaktionspartner von Massenspektrometrie-Analyse . Außerdem, selbst low Affinität, sind vorübergehende PPI durch diese Technik nachweisbar. Schließlich ist Membran-SPINE anpassungsfähig an nahezu jeden Zelltyp, so dass es zutreffend als ein leistungsfähiges Werkzeug, um Screening PPI von Membranproteinen zu identifizieren.

Einleitung

Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seinen Interaktionspartnern kennen. Mehreren klassischen Techniken zur Identifizierung von Interaktionspartnern von löslichen Proteinen zur Verfügung. Jedoch sind diese Techniken nicht ohne weiteres übertragbar, um Proteine ​​aufgrund ihrer hydrophoben Natur ⁴ Membran. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir die Membran Strep-Protein-Wechselwirkung Experiment (Membran-spine) ⁶ entwickelt. Es basiert auf der Methode DORN, die nur für lösliche Proteine ​​geeignet war ⁷ basiert.

Membran-SPINE profitiert von zwei Vorteile des Vernetzungsmittels Formaldehyd: erste Formaldehyd kann leicht durchdringen Membranen und erzeugt eine genaue Momentaufnahme der Interaktom einer lebenden Zelle ⁸ daher. Zweitens kann Formaldehyd vernetzt durch Kochen ⁹ umgekehrt werden. Hier werden diese beiden Vorteile verwendet, um nicht nur dauerhaft, sondern auch vorübergehende PPI Membran Prote identifizierenIns ^6.

Kurz gesagt, ein Strep-Tag an den C-Terminus des integralen Membranköderprotein fusioniert ist. Zellen, die den Membranköderprotein exprimieren, werden mit Formaldehyd vernetzt Beute-Proteine ​​an die Membran Köder-Protein (Fig. 1) inkubiert. Modifikationen der Beuteproteine ​​sind nicht erforderlich. Als nächstes wird die Membranfraktion bereit. Daher sind Membranproteine ​​durch Detergens-Behandlung und Köder-Proteine ​​sind mit ihrer Beute Proteinen unter Verwendung von Affinitätsreinigung gereinigt Zusammenarbeit gelöst. Anschließend wird die Vernetzung durch Kochen umgekehrt, und der Köder und deren koeluierte Beute-Proteine ​​werden durch SDS-PAGE getrennt. Schließlich kann Beuteproteine ​​durch Immunoblot-Analyse bzw. Massenspektroskopie identifiziert werden.

Protokoll

Hinweis: Detaillierte Informationen zur Puffer im Protokoll angegeben ist in Tabelle 1 verfügbar.

1. Fixierung von Protein-Protein-Interaktionen durch Formaldehyd-Vernetzungs in lebenden Zellen

1. Um zu beginnen vorzubereiten Wachstumsmedien, Stammlösungen und Puffer P1
   1. Bereiten 500 ml Medium: Das Medium sollte Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen Membran Köderprotein und Beuteproteine ​​unterstützen. Darüber hinaus sollte ein Versuch unter Bedingungen, bei denen keine Wechselwirkung zu erwarten ist (z. B. ohne Vernetzung) durchgeführt werden.
      Anmerkung: Wir vergleichen Protein-Protein-Wechselwirkungen bei gestressten und nicht gestressten Bakterien. Daher bereiten wir 500 ml Luria Bertani (LB)-Medium (Tabelle 1), die wir mit einem Stress-Induktionsmittel (zB 0,5 M NaCl) in einem 2 l-Erlenmeyerkolben zu ergänzen. Zur Steuerung verwenden wir normale LB-Medium mit 0,17 M NaCl (pH 7,0).
   2. Vorbereitung Tris-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) und 0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH-Wert 8,0-Stammlösung (Tabelle 1).
   3. Bereiten Puffer P1. Auflösen Saccharose auf eine Endkonzentration von 0,5 M Tris-Puffer. Sterilisieren Puffer P1 durch Filtration und speichern sie bei 4 ° C
2. Wachsen Zellen, die den Membranköderprotein mit einem C-terminalen Strep-tag-Fusions von einem Vektor exprimiert. Induzieren die Expression von Membranproteinen Köder für eine ausreichende Zeit.
   Anmerkung: Wir induzieren die Expression der bakteriellen Membran Köderproteine ​​in einem frühen logarithmischen Phase (A ₆₀₀ = 0,3) durch Zugabe von 250 ul 1 M isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu 500 ml Medium (Endkonzentration: 0,5 mM) . Um eine ausreichende Expression zu ermöglichen, Inkubation wir die Bakterien bis in die späten Log-Phase (A ₆₀₀ = 1.2).
3. Bereiten Sie für jede Kultur zwei Zentrifugenbecher mit einem Mindestvolumen von jeweils 300 ml und legen sie auf Eis.
4. Führen Formaldehyd-Vernetzung.
   CAUTION: Formaldehyd ist giftig Wir empfehlen unter einem Sicherheits Abzug arbeiten..
   1. Übertragen Sie das Kulturgefäß unter einer Abzugshaube Sicherheit. Aufgeteilt jede Probe in zwei Proben, eine Auslassung Vernetzungs (- X) und eine darunter Formaldehydvernetzungs (X +). 4 ml 37% ige Formaldehydlösung und 250 ml Kultur bis zu einer Endkonzentration von 0,6% zu erreichen.
5. Übertragen Sie die Kulturgefäße zurück und wachsen Zellen für weitere 20 min wie zuvor.
6. Füllen Sie Ihre Kulturen in die Zentrifugenröhrchen unter einem Sicherheits Abzug. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 × g für 30 min.
7. Überstand verwerfen durch vorsichtiges Pipettieren es unter einer Abzugshaube Sicherheit. Sammeln giftige Formaldehyd-haltigen Überstand und entsorgen Sie es ordnungsgemäß.
8. Um eine optimale Ausbeute bei der Membranproteinpräparat zu erreichen, bereiten erste Spheroplasten. Hier stellen wir ein Protokoll für Sphäroblastenbildung von Gram-negativen Bakterien:
   1. Prepare Puffer P2 (Tabelle 1) von lyophilisierten Pulvers. Leicht auflösen 2 mg Lysozym in 0,1 M EDTA, pH 8, in einem 1,5-ml-Röhrchen. Immer frisch zubereiten Puffer P2 für den Tag des Experiments.
   2. Vorbereitung Tris-Puffer mit Protease-Inhibitor (Puffer P3). Zu 10 ml Tris-Puffer, 0,1 ml 1 M Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Tabelle 1) bis zu einer Endkonzentration von 10 mM. Verwenden Sie die Puffer sofort, um die ordnungsgemäße Funktion der PMSF als Protease-Inhibitor zu gewährleisten.
   3. Resuspendieren Zellpellets in 10 ml Tris-Puffer mit Protease-Inhibitor und Transferlösung in ein 15 ml konischen Röhrchen.
   4. 1 ml Puffer P2 und Inkubation auf Eis für 30 min.
   5. Sammeln Spheroplasten durch Zentrifugation bei 3000 × g für 30 min und Überstand verwerfen sorgfältig.
9. Sphäroplast die Pellets über Nacht bei -20 ° C inkubieren

2. Reinigung von Strep-Tag Membrane Protein (Bait)

1. Zeigen Sphäroplast Pellet auf Eis.
2. Während der Zeit, die Sphäroplast Pellets auf Eis auftauen, bereiten 10 ml Puffer P3 für jeden Spheroplastenpräparation. Vorsichtig lösen 1 mg DNaseI in 10 ml Tris-Puffer. 0,1 ml 1 M PMSF kurz vor der Verwendung.
3. Das Pellet in 6 ml frisch zubereitet P3. Beschallen die Probe viermal für 1 min kontinuierlich auf Eis mit 1 min Pause zwischen jedem Burst, um die Sphäroplasten zu stören.
4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 g für 10 min bis zur Ernte Zelltrümmer. Den Überstand mit einer Pipette, ein Ultrazentrifugenröhrchen.
5. Pellet die Membranfraktion bei 100.000 × g für 30 min. In Tris-Puffer waschen das Pellet vorsichtig, ohne dass es sich auflöst. Trocknen Sie das Rohr mit einem Papiertuch (zB Kleenex). Vermeiden Sie die Pelletjederzeit zu stören.
6. Das Pellet (= Membranen) vorsichtig in 1 ml Tris-Puffer. Verwenden ein 20 ul Aliquot der Proteinkonzentration durch zB BCA-Assay zu bestimmen. Bei diesem Schritt können die Membranen Schock li gefrorenquid Stickstoff und bei -80 ° C gelagert

3. Reinigung von Strep-Tag Membrane Protein-Köder-und SDS-PAGE

1. Normalisierung der Proteinkonzentration der Membranfraktion zu 5 mg / ml mit Tris-Puffer. Nehmen Sie 2.5 ml Membranfraktion (5 mg / ml) in ein Ultrazentrifugenröhrchen und Zugabe von 0,25 ml 20% Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 2% zu erreichen, um die Membranproteine ​​zu solubilisieren. Fügen Sie eine Mikro-Magnetstab und rühren auf Eis für 1 Stunde.
   Anmerkung: Obwohl im Allgemeinen haben wir gute Ergebnisse mit Triton X-100 als Detergens, könnte es sinnvoll, die Reinigungsmittel für die Optimierung zu ändern. In dieser Hinsicht haben wir die besten Ergebnisse mit solchen Reinigungsmitteln für die Reinigung von funktionellen jeweiligen Membran Köderprotein verwendet.
2. Während der Ausführung von Schritt 3.1, bereiten 50 ml Puffer B und 5 ml von Puffer E (Tabelle 1). Füllen Sie 10 ml 5x Puffer W Konzentrat auf 50 ml und fügen Sie 150 ul 20% Triton X-100.
   1. Füllen Sie 1 ml 5x buffer E-Konzentrat auf 10 ml und fügen Sie 30 ul 20% Triton X-100. Ins Gleichgewicht einer 1 ml Strep-Tactin Superflow Schwerkraftsäule mit 8 ml Puffer W.
      Hinweis: Es ist wichtig, um das Reinigungsmittel zur Solubilisierung in einer Konzentration 10-fach über der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) in jedem Puffer während des Reinigungsverfahrens verwendet hinzuzufügen.
3. Entfernen der mikromagnetischen Stab aus der Solubilisierung Probe und Ultrazentrifuge bei 100.000 × g für 30 min, um das unlösliche Membranfraktion zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette zur weiteren Reinigung.
4. Laden der Überstand auf die Säule. Führen Sie die Spalte nur mit Schwerkraft. Die Säule wird mit 5 ml Puffer W. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 5x.
5. Eluiere Membranproteine ​​Köder mit 1 ml Puffer E. Wiederholen Sie diesen Schritt 4x Elution.
6. Konzentrieren Elutionsfraktionen 2, 3, und 4 bis 300 ul einer Zentrifugalfiltereinheit.
7. Mischungs 200 &mgr; l jeder Probe mit 50 &mgr; l 5 × SDS-PAGE Ladefarbstoff. Split jedes Präparat in 125 ul Aliquots. Man kocht ein Aliquot von jedem Präparat 20 Minuten lang bei 95 ° C zu Formaldehyd vernetzt umkehren. Lassen Proben abkühlen auf RT für mindestens 10 Minuten auf der Bank der Spitze.
8. Last 30 ul von jeder Probe auf eine einzelne Spur einer Polyacrylamid-Gel für Immunoblotting. Verwenden Sie eine vorgefärbte Molekulargewichtsmarker für beste Orientierung und führen ^SDS-PAGE-10.

4. Immunoblot-Analyse, um Interaktionspartner bestätigen

1. Sobald der Schritt 3.8 abgeschlossen ist, die Übertragung Proteine ​​auf eine Nitrocellulose-Membran durch halbtrockenen zB.
2. Blockieren der Membran, um unspezifische Markierung zu verhindern. Vorbereitung Blockierungspuffer durch Wiegen Rinderserumalbumin (BSA) zu 3% Gewicht pro Volumen in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit einer endgültigen Konzentration von 0,05% Tween-20 (TBS-T) ergänzt erzielen. Verwenden Sie eine ausreichende Menge an Blockierungspuffer, um die Membran zu decken. Sperrung der Membran für 1 h bei RT.
3. Verdünnen Sie einnd bebrüten die Beute Protein-spezifischen ersten Antikörper wie gewohnt. Verwenden ein HRP-verknüpften Antikörper als der zweite Antikörper.
4. Entwickeln Sie die Immunoblot mit einem Chemilumineszenz-Nachweis-Kit mit hoher Empfindlichkeit. Überwachung des Signals mit einem klassischen Film Veredelung oder Digital-Imaging-Ausrüstung.

5. NanoLC-ESI-MS/MS Hohe Auflösung Experimente zur Wechselwirkung Partner identifizieren

1. Im Fall, dass keine spezifischen Antikörper für die Beuteprotein oder unbekannte Interaktionspartner verfügbar gemacht werden sollen, verwenden Sie die Massenspektrometrie (MS) zur Identifizierung. Um Keratin Kontamination zu verhindern, verwenden vorgefertigte Gele für die Protein-Trennung.
2. Silberfärbung der SDS-PAGE unter Verwendung eines MS-kompatibel Färbekit nach dem Protokoll des Herstellers. Führen Sie alle Färbe-und Waschschritte in Glastanks.
3. Verbrauch jeweiligen Bands und analysieren diese durch hochauflösende LC / ^MS-9.

Ergebnisse

Membran SPINE-Analyse erlaubt die Co-Reinigung von Membranproteinen und transient interacting protein Partnern. Die Co-Reinigung unter Verwendung der Vernetzungsmittel Formaldehyd erreicht. Zwei Parameter sind wichtig, um unspezifische Vernetzungen verhindern: die Formaldehyd-Konzentration und der Vernetzungszeit. Die ausreichende, aber nicht übermäßige Verwendung von Formaldehyd kann leicht durch Immunoblotting gesteuert werden. Formaldehyd vernetztem Protein-Komplexe durch Kochen aber nicht durch SDS-Behandlung abg...

Diskussion

Membran SPINE Analyse ist ein biochemischer Ansatz, ermöglicht ein, um zu bestätigen und um zu diesem Punkt unbekannte Interaktionspartner von Membranproteinen zu identifizieren. Membran SPINE vereint in vivo Vernetzung durch Formaldehyd mit Reinigung eines Strep-markierten Membranköderprotein. Die Kombination mit Immunoblotting erleichtert den Nachweis von vorhergesagten Wechselwirkungspartner (Fig. 2). Zusätzlich wird die Verbindung mit MS-Analyse erlaubt die Identifikation unbekannter In...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge