קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה<em&gt; בVivo</em

Summary

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

Abstract

החלבונים בממברנה הם חיוניים ליכולת קיום של תאים ולכן הם מטרות טיפוליות חשובות ^1-3. מאז הם פועלים במתחמים ^4, שיטות לזיהוי ואפיון של האינטראקציות שלהם נחוצות ^5. לשם כך, פיתחנו ניסוי ממברנה סטרפטוקוקוס חלבון האינטראקציה, הנקרא ממברנה עמוד השדרה ^6. טכניקה זו משלבת in vivo cross-linking באמצעות פורמלדהיד צולב מקשר הפיך עם טיהור זיקה של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. במהלך ההליך, חלבוני טרף צולבים הם שיתוף מטוהר עם חלבון פיתיון הקרום ולאחר מכן הופרד על ידי רתחה. לפיכך, ניתן לבצע שתי משימות עיקריות בעת ניתוח אינטראקציות בין חלבונים (-PPI) של חלבונים בממברנה באמצעות ממברנה בעמוד שדרה: ראשון, האישור של שותף אינטראקציה שהוצע על ידי immunoblotting, ושנית, זיהוי שותפי אינטראקציה חדשים על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה . יתר על כן, גם אניow זיקה, PPIs החולף הוא לגילוי על ידי טכניקה זו. לבסוף, ממברנה שדרה להתאמה כמעט לכל סוג תא, מה שהופך אותו מתאים ככלי מיון רבי עוצמה כדי לזהות-PPI של חלבונים בממברנה.

Introduction

כדי להבין את תפקידו של חלבון זה חיוני לדעת שותפי האינטראקציה שלה. כמה טכניקות קלאסיות זמינות לזיהוי שותפי אינטראקציה של חלבונים מסיסים. עם זאת, טכניקות אלה אינן ניתנות להעברה בקלות לחלבוני קרום בשל האופי ההידרופובי שלהם ^4. כדי להתגבר על מגבלה זו, פיתחנו ניסוי האינטראקציה סטרפטוקוקוס חלבון ממברנה (ממברנה-עמוד שדרה) ^6. היא מבוססת על שיטת עמוד השדרה, שהייתה מתאים רק לחלבונים מסיסים ^7.

יתרונות קרום עמוד שדרה משני יתרונות של פורמלדהיד סוכן cross-linking: ראשון, פורמלדהיד יכול לחדור בקלות ממברנות ולכן מייצר תמונת מצב מדויקת של interactome של תא חי ^8. שנית, יכולים להיות הפוכים קישורים צולבים פורמלין על ידי הרתחת ^9. הנה, שני יתרונות אלו משמשים לזיהוי לא רק-PPI קבוע, אלא גם הגנה של מחזור החולף של קרוםתוספות ^6.

בקיצור, סטרפטוקוקוס תג הוא קבע את C-הסופית של חלבון פיתיון קרום נפרד. תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום מודגרת עם פורמלדהיד אשר חוצה קישורים לטרוף חלבונים לחלבון פיתיון קרום (איור 1). שינויים של חלבוני טרף אין צורך. בשלב הבא, את החלק יחסי הקרום מוכן. לכן, חלבוני קרום solubilized על ידי טיפול בחומרי ניקוי ופיתיון חלבונים הם שיתוף מטוהר עם חלבוני הטרף שלה באמצעות טיהור זיקה. בהמשך לכך, הקישור הצולב מתהפך על ידי רותחים, ואת הפיתיון והחלבונים טרף שיתוף eluted-מופרדים על ידי-SDS. לבסוף, ניתן לזהות חלבוני טרף על ידי ניתוח immunoblot או ספקטרומטריית מסה.

Protocol

הערה: מידע מפורט לגבי מאגרים שצוינו בפרוטוקול נגיש בטבלה 1.

1. קיבוע של חלבונים אינטראקציות על ידי פורמלדהיד cross-linking בתאים חיים

1. כדי להתחיל להכין את תקשורת צמיחה, פתרונות מניות וP1 החיץ
   1. הכן 500 בינוני מיליליטר: הבינוני צריך לספק תנאים התומכים באינטראקציה בין חלבון פיתיון הממברנה וחלבונים טרף. בנוסף, ניסוי אחד צריכה להתבצע בתנאים בהם אין אינטראקציה צפויה (למשל ללא cross-linking).
      הערה: אנו משווים אינטראקציות בין חלבונים בחיידקים הדגישו ולא לחוצים. לכן, אנו מכינים 500 מיליליטר וריא Bertani בינוני (LB) (טבלת 1) שאנחנו משלימים עם סוכן וישכנע לחץ (למשל 0.5 M NaCl) בבקבוק 2 ליטר Erlenmeyer. לבקרה, אנו משתמשים במדיום LB נורמלי עם 0.17 M NaCl (pH 7.0).
   2. הכן טריס-חיץ (20 מ"מ טריס-HCl; pH 8.0) ו0.1 M חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), פתרון ה-pH 8.0 המניה (טבלת 1).
   3. הכן P1 חיץ. ממיסים סוכרוז לריכוז סופי של 0.5 M בטריס-חיץ. לעקר P1 חיץ על ידי סינון ולאחסן אותו ב 4 ° C.
2. לגדל תאים המבטאים את חלבון פיתיון הקרום עם פיוז'ן סטרפטוקוקוס תג טרמינל C-מוקטור. לגרום לביטוי של חלבוני קרום פיתיון למספיק זמן.
   הערה: אנו לגרום לביטוי של חלבוני פיתיון קרום חיידק בשלב מוקדם יומן ₍₆₀₀ = 0.3) על ידי תוספת של 250 μl M 1 איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 500 מיליליטר בינוני (ריכוז סופי: 0.5 מ"מ) . כדי לאפשר ביטוי מספיק, אנחנו דגירה החיידקים עד השלב מאוחר ביומן ₍₆₀₀ = 1.2).
3. להתכונן לכל תרבות שתי כוסות צנטריפוגות בהיקף מינימאלי של 300 מיליליטר כל אחד ומניח אותם על קרח.
4. בצע פורמלדהיד cross-linking.
   CAUTION: פורמלדהיד הוא רעיל ביותר אנו ממליצים לעבוד תחת מנדף בטיחות..
   1. העבר את כלי התרבות תחת מנדף בטיחות. פיצול כל דגימה לשתי דוגמאות, אחד השמטת cross-linking (- X) ואחד כולל פורמלדהיד cross-linking (+ X). הוסף 4 מיליליטר 37% תמיסת פורמלדהיד לתרבות מיליליטר 250 להגיע לריכוז סופי של .0.6%.
5. העבר את כלי התרבות אחורה ולגדל תאים עבור 20 דקות נוספות כמו בעבר.
6. מלא תרבויותיך לתוך צינורות צנטריפוגה תחת מנדף בטיחות. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 30 דקות.
7. בטל supernatant ידי pipetting אותה בזהירות מתחת למכסה המנוע קטר בטיחות. איסוף supernatant המכיל פורמלדהיד הרעיל ולהיפטר ממנו כמו שצריך.
8. על מנת להגיע לתשואה אופטימלית במהלך הכנת חלבון קרום, להכין spheroplasts הראשונה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול להיווצרות spheroplast של חיידקים גראם שליליים:
   1. PreparP2 חיץ דואר (טבלה 1) מאבקת lyophilized. בעדינות לפזר 2 ליזוזים מ"ג ב0.1 M EDTA, pH 8, בצינור 1.5 מיליליטר. תמיד להכין P2 חיץ טרי ליום של הניסוי.
   2. הכן טריס-חיץ עם מעכבי פרוטאז (P3 חיץ). ל10 מיליליטר של טריס-חיץ, להוסיף 0.1 מיליליטר 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (טבלת 1) לריכוז סופי של 10 מ"מ. השתמש במאגר באופן מיידי, על מנת להבטיח תפקוד תקין של PMSF כמעכב פרוטאז.
   3. כדורי תא גלול ב10 מיליליטר טריס-חיץ עם מעכבי פרוטאז ופתרון טרנספר לצינור חרוטי 15 מיליליטר.
   4. הוספת P2 חיץ מיליליטר 1 ו לדגור על קרח למשך 30 דקות.
   5. לאסוף spheroplasts ידי צנטריפוגה ב3,000 XG במשך 30 דקות וזורקים supernatant בזהירות.
9. דגירה את כדורי spheroplast הלילה ב -20 ° C.

2. טיהור של חלבון ממברנה סטרפטוקוקוס תג (פיתיון)

1. הנח גלולה spheroplast על קרח.
2. במהלך הזמן את כדורי spheroplast להפשיר על קרח, להכין 10 מיליליטר P3 חיץ עבור כל הכנת spheroplast. בעדינות לפזר מ"ג DNaseI 1 ב10 מיליליטר טריס-חיץ. הוסף 0.1 מיליליטר PMSF M 1 רק לפני השימוש.
3. Resuspend את הכדור ב 6 מיליליטר P3 מוכן טרי. Sonicate המדגם ארבע פעמים ל1 דקות ברציפות על קרח עם הפסקה 1 דקות בין כל פרץ, במטרה לשבש spheroplasts.
4. צנטריפוגה המדגם XG ב 10,000 במשך 10 דקות לפסולת תא קציר. מעביר את supernatant באמצעות פיפטה לצינור ultracentrifuge.
5. גלולה שבריר הקרום ב100,000 XG במשך 30 דקות. שטוף את הכדור בזהירות בטריס-חיץ ללא פירוקה. ייבש את הצינור עם ממחטת נייר (למשל קלינקס). הימנע מלהפריע גלולה בכל עת.
6. Resuspend את הכדור (= קרום) בזהירות ב1 מיליליטר טריס-חיץ. השתמש aliquot 20 μl כדי לקבוע את ריכוז החלבון על ידי assay BCA למשל. בשלב זה, את הקרומים ניתן הלם קפוא בliחנקן פאונד ומאוחסנים ב -80 ° C.

3. טיהור של סטרפטוקוקוס תג חלבון ממברנה פיתיון ו- SDS

1. לנרמל את ריכוז החלבון של שבריר הקרום עד 5 מ"ג / מיליליטר עם טריס-חיץ. קח 2.5 מיליליטר שבריר קרום (5 מ"ג / מיליליטר) בצינור ultracentrifuge ולהוסיף 0.25 מיליליטר של 20% טריטון X-100 להגיע לריכוז סופי של 2%, על מנת solubilize החלבונים בממברנה. הוספת מוט מיקרו מגנטי ומערבבים על קרח במשך שעה 1.
   הערה: למרות שבאופן כללי יש לנו תוצאות טובות באמצעות טריטון X-100 כחומר ניקוי, זה יכול להיות שימושי כדי לשנות את חומר הניקוי לאופטימיזציה. במובן זה, יש לנו תוצאות הטובות ביותר עם ​​אלו חומרי ניקוי המשמשים לטיהור תפקודית של חלבון פיתיון קרום בהתאמה.
2. בעת ביצוע שלב 3.1, להכין 50 מיליליטר חיץ E W ו 5 מיליליטר חיץ מ( טבלה 1). מלא את 10 מיליליטר 5x ​​להתרכז W חיץ 50 מיליליטר ולהוסיף 150 μl 20% טריטון X-100.
   1. למלא 1 מיליליטר 5x ​​buffeתרכיז r E ל10 מיליליטר ולהוסיף 30 μl 20% טריטון X-100. לאזן את זרימת עמודה הכבידה superflow סטרפטוקוקוס-Tactin 1 מיליליטר עם 8 וו מיליליטר החיץ
      שים לב: זה חיוני כדי להוסיף את חומר הניקוי המשמש לsolubilization בריכוז של פי 10 מעל הריכוז הקריטי micelle (CMC) בכל חיץ במהלך הליך הטיהור.
3. הסר את מוט המייקר מגנטי ממדגם solubilization וultracentrifuge ב100,000 XG במשך 30 דקות, עד גלולה שבריר הקרום מסיס. הסר את supernatant באמצעות פיפטה לטיהור נוספת.
4. טען את supernatant לעמודה. הפעל את העמודה רק עם זרימת כוח הכבידה. לשטוף את העמודה עם 5 מיליליטר החיץ וו חזור על שלב זה הכביסה 5x.
5. Elute חלבוני פיתיון קרום עם 1 מיליליטר חיץ א 'חזור על שלב elution זה 4x.
6. להתרכז שברים elution 2, 3, ו4-300 μl עם יחידת מסנן צנטריפוגלי.
7. מערבבים 200 μl של כל דגימה עם 50 μl 5x SDS-PAGטעינת צבע E. פיצול כל הכנה ב125 aliquots μl. מרתיחים aliquot אחד מכל הכנה ל20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, כדי להפוך קישורים צולבים פורמלדהיד. בואו דגימות להתקרר לRT לפחות 10 דקות על גבי ספסל.
8. טען 30 μl מכל מדגם לנתיב יחיד של polyacrylamide ג'ל מתאים לimmunoblotting. השתמש סמן משקל מולקולרי prestained להתמצאות הטובה ביותר ולהפעיל-SDS ^10.

4. Immunoblot ניתוח לאישור שותפי אינטראקציה

1. ברגע שצעד 3.8 הושלם, חלבוני העברה לממברנה ניטרוצלולוזה על ידי למשל semidry.
2. לחסום את הקרום כדי למנוע תיוג נוקב. הכן את חיץ חסימה על ידי שקילת אלבומין בסרום שור (BSA) כדי להשיג במשקל של 3% לכל נפח שבנאגר מלוח טריס בתוספת סופי ריכוז 0.05% 20-Tween (TBS-T). השתמש בנפח מספיק של חיץ חסימה כדי לכסות את הממברנה. לחסום את הקרום עבור שעה 1 ב RT.
3. לדללnd דגירה הנוגדן הראשון הספציפי חלבון טרף כרגיל. השתמש בנוגדן HRP צמוד כנוגדן השני.
4. לפתח immunoblot באמצעות ערכת זיהוי chemiluminescent עם רגישות גבוהה. לנטר את האות באמצעות הליך עיבוד סרט קלאסי או ציוד הדמיה דיגיטלי.

5. ניסויי NanoLC-ESI-MS/MS רזולוציה גבוהה לזהות שותפי אינטראקציה

1. במקרה שאין נוגדן ספציפי זמין עבור חלבון הטרף או שותפי אינטראקציה ידועים צריך להיות מזוהה, השתמש ספקטרומטריית מסה (MS) לצורך זיהוי. על מנת למנוע זיהום קרטין, השתמש ג'לי precasted להפרדת חלבונים.
2. כסף להכתים-SDS באמצעות ערכת צביעת MS-תואם על פי הפרוטוקול של היצרן. לבצע את כל שלבי הצביעה ושטיפה במיכלי זכוכית.
3. להקות ובהתאמה בלו לנתח אלה על ידי LC ברזולוציה גבוהה / ⁹ טרשת נפוצה.

תוצאות

ניתוח עמוד שדרת קרום מאפשר שיתוף הטיהור של חלבונים בממברנה ושותפי חלבון transiently אינטראקציה. שיתוף הטיהור מושגת על ידי השימוש בפורמלדהיד סוכן cross-linking. שני פרמטרים הם קריטיים כדי למנוע קישורים צולבים נוקבים: ריכוז הפורמלין וזמן cross-linking. השימוש מספק, אך לא מוגזם של פורמל?...

Discussion

ניתוח עמוד שדרת ממברנה הוא גישה ביוכימית, המאפשרת אחד כדי לאשר ולזהות לשותפי שלב זה לא ידוע אינטראקציה של חלבונים בממברנה. עמוד שדרת קרום משלבת in vivo cross-linking ידי פורמלדהיד עם טיהור של חלבון פיתיון קרום סטרפטוקוקוס מתויג. שילוב עם immunoblotting מאפשר האישור של שותפי אינ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge