Мембрана-SPINE: Биохимический инструмента для выявления белок-белковых взаимодействий мембранных белков<em&gt; В Vivo</em

Резюме

Биохимический подход описан обнаружить прижизненно белок-белковых взаимодействий (PPI) мембранных белков. Метод сочетает в себе белок сшивание, аффинной очистки и масс-спектрометрии, и адаптируется к почти любой тип клеток или организма. При таком подходе даже определение переходных ИПП становится возможным.

Аннотация

Мембранные белки имеют важное значение для жизнеспособности клеток и, следовательно, важные терапевтические мишени ^1-3. Поскольку они функционируют в комплексах ^4, методы выявления и характеризуют их взаимодействия необходимы ^5. С этой целью мы разработали Стрептококковое-белка эксперимент взаимодействия мембраны, называется мембраной SPINE ^6. Этот метод сочетает в естественных условиях сшивающего помощью обратимой сшивающего линкера формальдегида с аффинной очистки с Strep-меченого белка мембраны приманки. Во время процедуры сшитые добычи протеины совместно очищались с приманкой мембранного белка и затем разделяют путем кипячения. Таким образом, две основные задачи могут быть выполнены при анализе белок-белковых взаимодействий (ИЦП) мембранных белков с помощью мембранного позвоночника: во-первых, подтверждение предложенной партнером взаимодействия иммуноблоттингом, и, во-вторых, выявление новых партнеров взаимодействия с помощью масс-спектрометрического анализа . Более того, даже лой близость, переходные ИПП обнаруживаются по этой методике. Наконец, мембрана-SPINE адаптируется к почти любой тип клеток, что делает его применимым в качестве мощного инструмента скрининга для выявления ИЦП мембранных белков.

Введение

Чтобы понять функцию белка важно знать своих партнеров взаимодействия. Несколько классические методы доступны для идентификации взаимодействия партнеров растворимых белков. Однако эти методы не легко передаваться с мембранными белками из-за их гидрофобной природы ^4. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали Стрептококковое-белка взаимодействия эксперимент мембраны (мембраны позвоночника) ^6. Он основан на методе позвоночника, который был пригоден только для растворимых белков ^7.

Мембрана-ПОЗВОНОЧНИКА выгоды от двух преимуществ сшивающего агента формальдегида: во-первых, формальдегид легко проникают мембраны и, следовательно, создает точную снимок интерактома живой клетки ^8. Во-вторых, формальдегид поперечные связи может быть отменено путем кипячения ^9. Здесь, эти два преимущества используются для идентификации не только постоянные, но и переходных ИЦП мембранного защмодули ^6.

Вкратце, Strep-тег слит с С-концом интегрального мембранного белка приманки. Клетки, экспрессирующие приманки мембранный белок инкубируют с формальдегидом, который сшивает охотятся белки с белком мембраны приманки (рис. 1). Модификации хищных белков не нужны. Далее, мембранную фракцию готов. Таким образом, мембранные белки, солюбилизируются лечения моющего средства и наживки белки совместно очищались с добычей белков с использованием аффинной очистки. Впоследствии сшивки восстанавливается посредством кипячения, и приманка и его со-элюированные белки добычи разделены SDS-PAGE. Наконец, добычи протеины могут быть идентифицированы путем иммуноблот-анализа или масс-спектрометрии.

протокол

Примечание: Подробная информация о буферах, указанных в протоколе имеется в таблице 1.

1. Фиксация белок-белковых взаимодействий на Формальдегид Сшивающие в живых клетках

1. Для начала подготовить роста средств массовой информации, растворы и буфера P1
   1. Приготовления 500 мл среды: среда должна обеспечить условия, которые поддерживают взаимодействие между мембраной приманки белка и кормовых белков. Кроме того, один эксперимент следует проводить в условиях, когда никакое взаимодействие не ожидается (например, без сшивки).
      Примечание: Мы сравниваем белок-белковых взаимодействий в напряженных и не напряженных бактерий. Таким образом, мы приготовления 500 мл Luria Bertani (LB) среды (табл. 1), что мы с дополнением стрессовых агента (например, 0,5 М NaCl) в колбе Эрленмейера 2 л. Для контроля мы используем нормальную среду LB с 0,17 М NaCl (рН 7,0).
   2. Подготовка Трис-буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0) и 0,1 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), рН 8,0 раствор (табл. 1).
   3. Подготовка буфера P1. Растворить сахарозу до конечной концентрации 0,5 М в Трис-буфере. Стерилизация буфера P1 путем фильтрации и хранить его при температуре 4 ° С.
2. Расти клетки, экспрессирующие приманки мембранный белок с С-концевым Strep-метки синтеза из вектора. Индуцируют экспрессию мембранных белков приманки в течение достаточного времени.
   Примечание: Мы индуцируют экспрессию бактериальных белков мембраны приманки на стадии раннего журнала ₍₆₀₀₎ = 0,3 добавлением 250 мкл 1 М изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) до 500 мл среды (конечная концентрация: 0,5 мм) . Чтобы обеспечить достаточное выражение, не инкубировать бактерии до этапа позднего журнала ₍₆₀₀ = 1.2).
3. Подготовка к каждой культуры двух центрифуг стаканы с минимальным объемом 300 мл каждая и разместить их на льду.
4. Выполните формальдегида сшивания.
   КАУАЦИЯ: Формальдегид является высокотоксичным Мы рекомендуем работать под безопасности вытяжной шкаф..
   1. Перенести культуры судно под безопасности вытяжной шкаф. Сплит каждую пробу в двух образцах, один минуя сшивания (- X) и один в том числе формальдегид сшивания (+ X). Добавить 4 мл 37% раствора формальдегида в 250 мл культуры, чтобы достичь конечной концентрации 0,6%.
5. Перенесите культуры сосуды назад и роста клеток в течение дополнительных 20 мин, как и раньше.
6. Заполните культур в центрифужные пробирки под безопасности вытяжной шкаф. Сбор клеток путем центрифугирования при 3000 х г в течение 30 мин.
7. Удалите супернатант тщательно пипетки его под безопасности вытяжной шкаф. Сбор токсичных формальдегидсодержащего супернатант и утилизируйте его должным образом.
8. Для достижения оптимального выхода во время подготовки мембранный белок, подготовить сферопластов в первую очередь. Здесь мы обеспечиваем протокол для формирования сферопластного грамотрицательных бактерий:
   1. Подгое буфер Р2 (табл. 1) из лиофилизированного порошка. Осторожно растворить 2 мг лизоцима в 0,1 М ЭДТА, рН 8, в 1,5 мл трубки. Всегда готовьте буфера Р2 недавно на день эксперимента.
   2. Подготовка Трис-буфер с ингибитора протеазы (буфер Р3). К 10 мл Трис-буфера, добавляют 0,1 мл 1 М фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (табл. 1) до конечной концентрации 10 мМ. Немедленно использовать буфер, чтобы обеспечить надлежащее функционирование PMSF в качестве ингибитора протеазы.
   3. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл Трис-буфере с ингибитором протеаз и переноса раствора в 15 мл коническую пробирку.
   4. Добавить 1 мл буфера Р2 и инкубировать на льду в течение 30 мин.
   5. Сбор сферопластов центрифугированием при 3000 х г в течение 30 мин и осторожно отбросить супернатант.
9. Инкубируйте сферопластного гранулы в течение ночи при -20 ° С.

2. Очистка Стрептококковое-тега мембранный белок (Bait)

1. Наведите сферопластного осадок на льду.
2. В течение времени, когда гранулы сферопластного оттаивания на льду, подготовить 10 мл буфера Р3 для каждого сферопластного препарата. Осторожно растворить 1 мг ДНКазой I в 10 мл Трис-буфера. Добавить 0,1 мл 1 M PMSF непосредственно перед использованием.
3. Ресуспендируют гранул в 6 мл свежеприготовленный P3. Образец обрабатывают ультразвуком в четыре раза в течение 1 мин непрерывно на льду с 1 мин паузы между каждого пакета, чтобы нарушить сферопластов.
4. Центрифуга образца при 10000 х г в течение 10 мин до сбора мусора клеток. Передача супернатант с помощью пипетки в ультрацентрифужную пробирку.
5. Гранул мембранной фракции при 100000 х г в течение 30 мин. Тщательно Вымойте гранул в Трис-буфера без его растворения. Высушите трубку с бумажной салфеткой (например Kleenex). Избегать нарушая гранул в любое время.
6. Ресуспендируют гранул (= мембраны) тщательно в 1 мл Трис-буфера. Используйте 20 мкл аликвоты для определения концентрации белка, например, путем BCA анализом. На этом этапе, мембраны могут быть заморожены в шок Liфунтов стерлингов азота и хранили при -80 ° С.

3. Очистка Стрептококковое-тега Мембрана Bait белка и SDS-PAGE

1. Нормализация концентрации белка в мембранной фракции по 5 мг / мл с Трис-буфером. Возьмем 2,5 мл мембранной фракции (5 мг / мл) в ультрацентрифужную пробирку и добавляют 0,25 мл раствора 20% Тритона Х-100 до конечной концентрации 2%, для солюбилизации мембранных белков. Добавить микро-магнитный стержень и перемешивают на льду в течение 1 часа.
   Примечание: Хотя в целом у нас есть хорошие результаты, используя Тритон Х-100, как моющее средство, было бы полезно, чтобы изменить моющее средство для оптимизации. В этом отношении, мы имеем лучшие результаты с этими моющих средств, используемых для функционального очистки соответствующего белка мембраны приманки.
2. При выполнении шаг 3.1, подготовить 50 мл буфера W и 5 мл буфера Е из (табл. 1). Заполнение 10 мл буфера 5х W концентрат до 50 мл и добавляют 150 мкл 20% Triton X-100.
   1. Пополнить 1 мл 5x bufféR E концентрат до 10 мл и добавляют 30 мкл 20% Тритона Х-100. Равновесие стрептококковая-Tactin сверхпоток тяжести столбец 1 мл потока с 8 мл буфера W.
      Примечание: Важно, чтобы добавить моющее средство используется для растворения в концентрационном 10 раз выше критической концентрации мицеллообразования (ККМ) в любом буфере во время процедуры очистки.
3. Удалить микро-магнитный стержень из образца солюбилизации и ультрацентрифуге при 100000 х г в течение 30 мин, для осаждения нерастворимого мембранной фракции. Удалить супернатант с помощью пипетки для дальнейшей очистки.
4. Загрузить супернатанта на колонку. Запустите колонку только с самотеком. Промыть колонку 5 мл буферной W. Повторите этот этап промывки 5x.
5. Элюции мембранные приманки белки с 1 мл буфера Е. Повторите эту элюирования шаг 4x.
6. Концентрат элюированных фракций 2, 3 и 4 до 300 мкл с помощью центробежного фильтра.
7. Смешайте 200 мкл каждого образца с 50 мкл 5х SDS-PAGE загрузка краситель. Сплит каждого препарата в 125 мкл аликвоты. Варить одну аликвоту каждого препарата в течение 20 мин при 95 ° С, в обратном формальдегида поперечные связи. Пусть образцы остыть до комнатной температуры в течение не менее 10 мин на верхней скамейке.
8. Нагрузка 30 мкл из каждого образца для одной полосы из полиакриламидного гель-пригодной для иммуноблоттинга. Используйте предварительно окрашенный маркер молекулярного веса за лучший ориентации и запустить SDS-PAGE ^10.

4. Иммуноблот Анализ для подтверждения Взаимодействие партнеров

1. После того, как шаг 3.8 завершена, передачи белков на нитроцеллюлозную мембрану, например, путем полусухое.
2. Блок мембраны для предотвращения неспецифической маркировки. Подготовка блокирующем буфере путем взвешивания бычьего сывороточного альбумина (BSA), чтобы достичь 3% вес на единицу объема в Трис-буферном солевом растворе с добавлением конечного концентрации 0,05% Tween-20 (TBS-T). Использование достаточный объем блокирующем буфере для покрытия мембраны. Блок мембрану в течение 1 часа при комнатной температуре.
3. Развестий инкубировать добычей белка специфическую первое антитело, как обычно. Использование HRP-антитела, связанный качестве второго антитела.
4. Разработка иммуноблот с использованием хемилюминесцентного набора определения с высокой чувствительностью. Контролировать сигнал, используя классическую процедуру обработки пленки или цифрового оборудования обработки изображений.

5. NanoLC-ESI-MS/MS высокого разрешения Эксперименты для идентификации Взаимодействие партнеров

1. В случае, что ни специфическое антитело не доступен для белка добычи или неизвестных партнеров взаимодействия должны быть определены, использовать масс-спектрометрии (MS) для идентификации. В целях предотвращения кератина загрязнения, использовать precasted гели для разделения белков.
2. Серебряная пятно SDS-PAGE с использованием MS-совместимая окрашивания комплект в соответствии с протоколом производителя. Выполните все окрашивания и стиральные шаги в стеклянных баков.
3. Акцизные соответствующие группы и проанализировать эти побочные высокого разрешения ЖХ / МС ^9.

Результаты

Анализ Мембрана SPINE позволяет совместное очистку мембранных белков и временно взаимодействующий белок партнеров. Совместное очистка достигается с помощью сшивающего агента формальдегид. Два параметра имеют решающее значение для предотвращения неспецифических перекрестных связей: ...

Обсуждение

Анализ Мембрана позвоночник биохимический подход, который дает возможность подтвердить и определить к этой точке неизвестных партнеров взаимодействия мембранных белков. Мембрана SPINE сочетает в естественных условиях сшивки формальдегидом с очистке Strep-меченого белка мембраны п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge