Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine ​​di membrana<em&gt; In Vivo</em

Riepilogo

Un approccio biochimico è descritto per identificare in vivo interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine ​​di membrana. Il metodo combina proteina reticolazione, purificazione per affinità e spettrometria di massa, ed è adattabile a qualsiasi tipo cellula o organismo. Con questo approccio, anche l'identificazione degli IPP transitori diventa possibile.

Abstract

Le proteine ​​di membrana sono essenziali per la vitalità delle cellule e sono quindi importanti bersagli terapeutici ^1-3. Dal momento che funzionano in complessi ^4, sono necessari metodi per identificare e caratterizzare le loro interazioni ^5. A questo scopo, abbiamo sviluppato l'esperimento di interazione Strep-proteina di membrana, denominata membrana SPINE ^6. Questa tecnica combina in vivo reticolazione usando l'reversibile reticolante formaldeide con purificazione per affinità di una proteina di membrana esca Strep-tag. Durante la procedura, proteine ​​preda reticolati sono co-purificati con la proteina esca membrana e successivamente separati mediante ebollizione. Quindi, due compiti principali possono essere eseguiti quando si analizzano le interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine ​​di membrana con membrana SPINE: in primo luogo, la conferma di un partner di interazione proposto da immunoblotting, e in secondo luogo, l'individuazione di nuovi partner di interazione mediante analisi di spettrometria di massa . Inoltre, anche low affinità, PPI transitori sono rilevabili da questa tecnica. Infine, membrana SPINE è adattabile a quasi ogni tipo di cellula, che lo rende applicabile come strumento di screening potente per identificare PPI di proteine ​​di membrana.

Introduzione

Per comprendere la funzione di una proteina è fondamentale conoscere i suoi partner di interazione. Diverse tecniche classiche sono disponibili per l'identificazione di partner di interazione di proteine ​​solubili. Tuttavia, queste tecniche non sono facilmente trasferibili ad proteine ​​della membrana a causa della loro natura idrofoba ^4. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato il Strep-proteina esperimento di interazione membrana (Membrane-SPINE) ^6. Si basa sul metodo colonna vertebrale, che è adatto solo per le proteine ​​solubili ^7.

Benefici membrana e colonna vertebrale da due vantaggi della formaldeide agente reticolante: primo, formaldeide possono facilmente penetrare le membrane e quindi genera un'istantanea precisa dell'interattoma di una cellula vivente ^8. In secondo luogo, formaldeide cross-link possono essere invertite bollendo ^9. Qui, questi due vantaggi sono utilizzati per identificare non solo gli IPP permanenti, ma anche transitori di membrana proteins ^6.

In breve, un Strep-tag è fuso al C-terminale della proteina di membrana integrale esca. Cellule che esprimono la proteina esca membrane vengono incubate con formaldeide che legami incrociati preda proteine ​​alla proteina esca membrana (Figura 1). Non sono necessarie modificazioni delle proteine ​​preda. Successivamente, la frazione di membrana è disposta. Pertanto, proteine ​​di membrana vengono solubilizzati mediante trattamento detergente e esca proteine ​​sono co-purificati con le sue proteine ​​preda utilizzando purificazione per affinità. Successivamente, il cross-link è invertita mediante ebollizione, e l'esca e le sue proteine ​​preda co-eluiti sono separati mediante SDS-PAGE. Infine, le proteine ​​preda possono essere identificati mediante analisi immunoblot o spettrometria di massa.

Protocollo

Nota: Le informazioni per i buffer indicati nel protocollo è disponibile in Tabella 1.

1. Fissazione delle interazioni proteina-proteina da formaldeide Cross-linking nelle cellule viventi

1. Per iniziare a preparare i terreni di crescita, soluzioni madre e tampone P1
   1. Preparare medie 500 ml: Il mezzo deve offrire le condizioni che supportano l'interazione tra proteina di membrana esca e proteine ​​preda. Inoltre, un esperimento deve essere effettuato in condizioni in cui si prevede alcuna interazione (ad esempio, senza cross-linking).
      Nota: Confrontiamo interazioni proteina-proteina nei batteri stressati e non stressati. Pertanto, ci prepariamo 500 ml Luria Bertani (LB) medio (Tabella 1) che ci completiamo con un agente stressante (ad esempio 0,5 M NaCl) in un pallone da 2 L Erlenmeyer. Per il controllo, usiamo normale medio LB con 0,17 M NaCl (pH 7,0).
   2. Preparare Tris-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) e 0,1 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), soluzione 8,0 archivio di pH (Tabella 1).
   3. Preparare tampone P1. Sciogliere saccarosio ad una concentrazione finale di 0,5 M in tampone Tris. Sterilizzare tampone P1 per filtrazione e conservarlo a 4 ° C.
2. Crescere cellule che esprimono la proteina di membrana esca con un C-terminale Strep-tag fusion da un vettore. Indurre l'espressione di proteine ​​esca membrana per un tempo sufficiente.
   Nota: indurre l'espressione di proteine ​​di membrana esca batteriche in fase precoce-log (A ₆₀₀ = 0,3) mediante aggiunta di 250 microlitri 1 M isopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) a 500 ml di mezzo (concentrazione finale: 0,5 mM) . Per consentire l'espressione sufficiente, abbiamo incubare i batteri fino alla fase tardo-log (A ₆₀₀ = 1.2).
3. Preparare per ogni cultura due bicchieri centrifuga con un volume minimo di 300 ml ciascuno e disporli sul ghiaccio.
4. Eseguire formaldeide cross-linking.
   CAUZIONE: La formaldeide è altamente tossico Si consiglia di lavorare sotto una cappa aspirante sicurezza..
   1. Trasferire il recipiente di coltura sotto una cappa di sicurezza. Dividere ogni campione in due campioni, uno omettendo reticolazione (- X) e uno compresa la formaldeide reticolante (+ X). Aggiungere la soluzione di formaldeide 4 ml 37% a 250 ml cultura per raggiungere una concentrazione finale di 0,6%.
5. Trasferire i recipienti di coltura indietro e far crescere le cellule per ulteriori 20 minuti come prima.
6. Riempite i vostri culture nelle provette da centrifuga sotto una cappa di sicurezza. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 xg per 30 min.
7. Gettare il surnatante pipettando con cautela sotto una cappa di sicurezza. Raccogliere tossico-formaldeide contenente surnatante e smaltirla in modo appropriato.
8. Al fine di raggiungere il rendimento ottimale durante la preparazione di proteine ​​di membrana, preparare prima sferoplasti. Qui, forniamo un protocollo per la formazione spheroplast di batteri Gram-negativi:
   1. Prepae tampone P2 (Tabella 1) da polvere liofilizzata. Sciogliere delicatamente 2 mg di lisozima in 0,1 M EDTA, pH 8, in una provetta da 1,5 ml. Sempre preparare tampone P2 fresco per il giorno dell'esperimento.
   2. Preparare tampone Tris con inibitore della proteasi (tampone P3). A 10 ml di tampone Tris, aggiungere 0,1 ml di 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (Tabella 1) ad una concentrazione finale di 10 mM. Utilizzare il buffer immediatamente, per garantire il corretto funzionamento di PMSF come inibitore della proteasi.
   3. Pellet cellulari risospendere in 10 ml di tampone Tris con inibitori della proteasi e la soluzione di trasferimento in una provetta da 15 ml.
   4. Aggiungere 1 ml di tampone P2 e incubare in ghiaccio per 30 min.
   5. Raccogliere sferoplasti per centrifugazione a 3000 g per 30 minuti e scartare con attenzione il surnatante.
9. Incubare il pellet spheroplast notte a -20 ° C.

2. Purificazione di Strep-tag Membrane Protein (Bait)

1. Mettere spheroplast pellet sul ghiaccio.
2. Durante il tempo i pellets spheroplast disgelo su ghiaccio, preparare 10 ml tampone P3 per ciascun preparato spheroplast. Sciogliere delicatamente 1 mg DNaseI in 10 ml di tampone Tris. Aggiungere 0,1 ml di 1 M PMSF prima dell'uso.
3. Risospendere il pellet in 6 ml P3 preparati al momento. Sonicare il campione quattro volte per 1 minuto continuamente su ghiaccio con 1 min pausa tra ciascun burst, al fine di interrompere sferoplasti.
4. Centrifugare il campione a 10.000 xg per 10 min a detriti cellulari raccolto. Trasferire il surnatante con una pipetta ad un tubo ultracentrifuga.
5. Pellet la frazione di membrana a 100.000 xg per 30 min. Lavare il pellet con cura in Tris-buffer, senza scioglierla. Essiccare il tubo con un fazzoletto di carta (ad esempio Kleenex). Evitare di disturbare il pellet in qualsiasi momento.
6. Risospendere accuratamente il pellet (= membrane) in 1 ml di tampone Tris. Usare un'aliquota di 20 microlitri per determinare la concentrazione proteica mediante saggio es BCA. A questo punto, le membrane possono essere scosse congelati in Liazoto quid e conservati a -80 ° C.

3. Purificazione di Strep-tag membrana Bait Proteine ​​e SDS-PAGE

1. Normalizzare la concentrazione proteica della frazione di membrana a 5 mg / ml con tampone Tris. Prendere 2,5 ml frazione di membrana (5 mg / ml) in una provetta ultracentrifuga e aggiungere 0,25 ml di 20% Triton X-100 per raggiungere una concentrazione finale del 2%, in modo da solubilizzare le proteine ​​di membrana. Aggiungi una canna micro-magnetico e mescolare in ghiaccio per 1 ora.
   Nota: Anche se in generale abbiamo buoni risultati con Triton X-100 come detergente, potrebbe essere utile cambiare il detersivo per l'ottimizzazione. A questo proposito, abbiamo migliori risultati con quelli detergenti usati per la purificazione funzionale della rispettiva proteina di membrana esca.
2. Durante l'esecuzione passo 3.1, preparare 50 ml di soluzione tampone W e 5 ml di tampone E da (Tabella 1). Riempire 10 ml tampone 5x W concentrato a 50 ml e aggiungere 150 microlitri 20% Triton X-100.
   1. Riempire 1 ml 5x buffer E concentrato a 10 ml e aggiungere 30 ml 20% Triton X-100. Equilibrare un Strep-Tactin superflow gravità colonna 1 ml di flusso con 8 ml di soluzione tampone W.
      Nota: E 'essenziale per il detersivo utilizzato per solubilizzazione in una concentrazione 10 volte superiore alla concentrazione micellare critica (CMC) in ogni buffer durante la procedura di purificazione.
3. Rimuovere l'asta di micro-magnetico dal campione solubilizzazione e ultracentrifuga a 100.000 xg per 30 min, per far sedimentare la frazione di membrana insolubile. Rimuovere il surnatante con una pipetta per ulteriore purificazione.
4. Caricare il supernatante alla colonna. Eseguire la colonna solo con il flusso di gravità. Lavare la colonna con 5 ml di tampone W. Ripetere questa fase di lavaggio 5x.
5. Eluire le proteine ​​di membrana esca con 1 ml di tampone E. Ripetere questo passaggio eluizione 4x.
6. Concentrato frazioni di eluizione 2, 3, e da 4 a 300 ul di un'unità filtro centrifugo.
7. Mescolare 200 ml di ogni campione con 50 microlitri 5x SDS-PAGE colorante di caricamento. Split ogni preparazione in 125 microlitri aliquote. Bollire un'aliquota di ciascuna preparazione per 20 min a 95 ° C, per invertire formaldeide legami crociati. Lasciate raffreddare i campioni a temperatura ambiente per almeno 10 minuti sul banco superiore.
8. Carico 30 microlitri di ciascun campione in una singola corsia di un gel di poliacrilammide-adatto per immunoblotting. Usare un pennarello prestained peso molecolare per la migliore orientamento ed eseguire SDS-PAGE ^10.

4. Immunoblot analisi per confermare partner di interazione

1. Una volta passo 3.8 è completato, proteine ​​di trasferimento ad una membrana di nitrocellulosa per es semisecco.
2. Bloccare la membrana per impedire l'etichettatura aspecifica. Preparare tampone di bloccaggio mediante pesatura albumina di siero bovino (BSA) per ottenere 3% in peso per volume in soluzione salina tamponata con Tris supplementato con una concentrazione finale di 0,05% Tween-20 (TBS-T). Utilizzare un volume sufficiente di tampone di bloccaggio per coprire la membrana. Bloccare la membrana per 1 ora a RT.
3. Diluire unnd incubare il primo anticorpo specifico proteine ​​preda come al solito. Utilizzare un anticorpo HRP-linked come secondo anticorpo.
4. Sviluppare l'immunoblot utilizzando un kit rivelazione chemiluminescente ad alta sensibilità. Monitorare il segnale utilizzando una procedura classica lavorazione del film o apparecchiature di imaging digitale.

5. Esperimenti NanoLC-ESI-MS/MS ad alta risoluzione per identificare partner di interazione

1. Nel caso in cui nessun anticorpo specifico è disponibile per la proteina preda o partner di interazione sconosciuti dovrebbero essere identificata, utilizzare la spettrometria di massa (MS) per l'identificazione. Al fine di prevenire la contaminazione cheratina, usare gel prefabbricato per la separazione delle proteine.
2. Argento macchia la SDS-PAGE usando un kit di colorazione compatibile MS secondo il protocollo del produttore. Eseguire tutte le operazioni di colorazione e lavaggio in vasche di vetro.
3. Accise rispettive bande ed analizzare questi per alta risoluzione LC / MS ^9.

Risultati

Analisi membrana SPINE permette la co-purificazione di proteine ​​di membrana e transitoriamente interagenti partner proteici. Il co-purificazione è ottenuto utilizzando l'agente formaldeide reticolazione. Due parametri sono fondamentali per evitare aspecifiche legami incrociati: la concentrazione di formaldeide e il tempo di reticolazione. L'uso sufficiente, ma non eccessivo di formaldeide può essere facilmente controllato mediante immunoblotting. Complessi proteici formaldeide reticolati possono essere s...

Discussione

Analisi membrana colonna vertebrale è un approccio biochimico che permette di confermare e per identificare a questo punto sconosciuti partner di interazione di proteine ​​di membrana. Membrana SPINE combina in vivo reticolazione da formaldeide con purificazione di una proteina di membrana esca Strep-tag. La combinazione con immunoblotting facilita la conferma di partner di interazione previsti (Figura 2). Inoltre, la combinazione con analisi MS consente l'identificazione di partner di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge