膜脊柱：一个生化工具来确定膜蛋白的蛋白质 - 蛋白质相互作用<em&gt;在体内</em

摘要

一个生化方法描述识别体内蛋白质膜蛋白的相互作用（PPI）。该方法结合了蛋白质的交联，亲和纯化和质谱法，并且是适合于几乎任何类型的细胞或生物体。用这种方法，瞬态质子泵抑制剂的甚至识别成为可能。

摘要

膜蛋白是细胞存活必不可少的，因此是重要的治疗靶标^1-3。由于他们在配合^4个功能，方法来识别和描述它们之间的相互作用是必要的^5。为此，我们开发了膜链球菌-蛋白相互作用的实验，称为膜脊柱^6。该技术结合在体内使用可逆的交联剂甲醛与链球菌标签膜诱饵蛋白的亲和纯化的交联。在实验过程中，交联的猎物蛋白质是共纯化，用该膜诱饵蛋白，并随后通过煮沸分离。因此，两大任务可以分析蛋白质 - 蛋白质相互作用的膜蛋白（生产者价格指数），当使用膜脊柱执行：首先，提出一个合作伙伴的交互通过免疫印迹，并确认第二，新的互动合作伙伴通过质谱分析鉴定。而且，即使升嗷嗷的亲和力，瞬间PPIs是检测用这种技术。最后，膜脊柱是适用于几乎任何类型的细胞，使其适用于作为一个强大的筛选工具，以确定膜蛋白的生产者价格指数。

引言

了解蛋白质的功能，必须知道它的相互作用伙伴。几种传统的技术可用于可溶性蛋白的相互作用伙伴的标识。然而，这些技术是不容易转移到膜，由于其疏水性^，4种蛋白。为了克服这个限制，我们已经开发了膜链球菌蛋白质相互作用实验（膜脊柱^）6。它是根据脊柱的方法，它是唯一适合的可溶性蛋白^7。

从两个优点的交联剂甲醛的膜-脊柱的好处：第一，甲醛可以轻易穿透细胞膜，因此产生一个活细胞⁸的相互作用组的精确快照。二，甲醛交联可煮沸⁹逆转。在这里，这两个优势是用来识别不仅永久性的，但也是短暂的膜保护制服的生产者价格指数插件^6。

简言之，Strep-标签融合到完整的膜诱饵蛋白的C-末端。细胞中表达的膜蛋白诱饵孵育与甲醛的交联猎物蛋白质与膜诱饵蛋白（ 图1）。不需要猎物蛋白的修饰。接着，将膜部分准备。因此，膜蛋白是由洗涤剂处理和饵料蛋白质共同纯化，用亲和纯化它的猎物的蛋白质溶解。接着，将交联是通过煮沸颠倒，诱饵和其共洗脱猎物蛋白通过SDS-PAGE分离。最后，猎物的蛋白质可通过免疫印迹分析或质谱来识别。

研究方案

注： 表1是关于可在协议中表示缓冲区的详细信息。

1。蛋白质 - 蛋白质相互作用的甲醛交联的活细胞固定

1. 要开始准备的生长介质，原液和缓冲P1
   1. 制备500mL介质：该介质应该提供支持膜诱饵蛋白和猎物蛋白之间的相互作用的条件。此外，一个实验应该在没有相互作用，预期（ 例如，未经交联）的条件下进行。
      注意：我们比较蛋白质 - 蛋白质相互作用中强调和非强调的细菌。因此，我们制备500mL的Luria BERTANI（LB）培养基中（ 表1），我们有应激诱导剂（ 例如，0.5M氯化钠）中的2升锥形烧瓶中补充。为控制中，我们使用正常的LB培养基中以0.17 M氯化钠（pH 7.0）中。
   2. 制备的Tris-缓冲液（20mM的Tris-H氯，pH值8.0）和0.1M乙二胺四乙酸（EDTA），pH值8.0储备溶液（ 表1）。
   3. 准备缓冲区P1。蔗糖溶解到0.5M的在Tris-缓冲液中的最终浓度。消毒缓冲P1通过过滤，并将其存储在4℃下
2. 生长细胞中表达的膜蛋白诱饵与从向量的C-末端Strep-标签融合。诱导膜诱饵蛋白进行足够时间的表达。
   注意：我们通过加入250μl的1M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至500ml培养基中诱导细菌膜诱饵蛋白的表达在早期的对数期（A ₆₀₀ = 0.3）（终浓度为0.5mM） 。为预留足够的表达，我们培养细菌，直到后期日志相（A ₆₀₀ = 1.2）。
3. 每个文化中两种离心机烧杯准备与各300ml最小体积，并把它们放在冰上。
4. 执行甲醛交联。
   中国农业大学TION：甲醛是剧毒的建议下，安全通风柜工作。
   1. 转下安全通风柜培养容器。每个样品分成两个样品，1省略了交联（ - X）和1包括交联的甲醛（X +）。加4毫升37％甲醛溶液至250毫升培养物达到0.6％的终浓度。
5. 转让培养容器回来，像以前一样培养细胞进行进一步20分钟。
6. 请填写你的文化变成下一个安全通风柜的离心管。离心3000×g离心30分钟收集细胞。
7. 通过在一个安全的通风柜仔细吹打起来弃上清液。收集有毒含甲醛上清液并妥善处置。
8. 为了膜蛋白制备过程中达到最佳的产量，先准备原生质球。这里，我们提供了一个协议，用于原生质球形成的革兰氏阴性菌：
   1. PreparË缓冲P2（ 表1）从冻干粉。轻轻地溶解2毫克溶菌酶在0.1M EDTA，pH为8，在1.5ml管中。总是新鲜制备缓冲液P2为在实验的当天。
   2. 制备的Tris-缓冲液中的蛋白酶抑制剂（缓冲液P3）。到10毫升的Tris-缓冲液中，加入0.1毫升的1摩尔苯甲基磺酰氟（PMSF）（ 表1），以10mM的终浓度。立即使用缓冲区，以确保PMSF的正常功能作为蛋白酶抑制剂。
   3. 重悬细胞沉淀物在10毫升的Tris-缓冲液中蛋白酶抑制剂和转移溶液到15毫升锥形管中。
   4. 加入1 ml缓冲液P2，并在冰上孵育30分钟。
   5. 经离心收集原生质球在3000×g离心30分钟，小心弃去上清液。
9. 过夜孵育原生质球丸粒在-20℃下

2。的Strep-标签膜蛋白的纯化（诱饵）

1. 将原生质体沉淀置于冰上。
2. 在当时的球状体颗粒融化冰，准备好10 ml缓冲液P3每个原生质体的制备。轻轻地溶解1毫克DNA酶I在10毫升的Tris-缓冲液中。加入0.1毫升的1摩尔PMSF使用前。
3. 重悬沉淀6毫升新鲜配制P3。超声处理的样品4次，用于连续1分钟在冰上用每个脉冲串之间的1分钟的停顿，以破坏球状体。
4. 离心样品以10,000 xg离心10分钟以收获细胞碎片。用移液管向一个超速离心管转移上清液。
5. 沉淀膜级分以100,000×g离心30分钟。不溶解于Tris缓冲仔细洗涤沉淀。干管与纸巾（ 如纸巾）。避免打扰沉淀在任何时候。
6. 1毫升的Tris缓冲仔细悬浮颗粒（=膜）。使用20微升等分试样由例如 BCA测定来确定蛋白质浓度。在该步骤中，膜可快速冷冻在利嚼食氮气并储存于-80℃。

3。的Strep-标签膜诱饵蛋白和SDS-PAGE分离纯化

1. 归一化膜部分的蛋白浓度为5毫克/毫升，用Tris-缓冲液中。采取2.5毫升膜部分（5毫克/毫升）在超速离心管中，加入0.25的20％的Triton X-100毫升达到2％的终浓度，以溶解的膜蛋白。加一个微磁性棒搅拌，冰浴1小时。
   注：虽然一般我们在使用的Triton X-100作为洗涤剂了良好的效果，它可能是有用的改变洗涤剂进行优化。在这方面，我们已与用于各个膜诱饵蛋白的功能性纯化的那些洗涤剂最好的结果。
2. 而执行步骤3.1，准备50毫升从（ 表1）缓冲W和5毫升指令E。填写10毫升5X缓冲W浓缩至50毫升加入150μl20％的Triton X-100。
   1. 填写1毫升5倍buffeR E浓缩至10ml，加入30微升20％的Triton X-100。平衡用8ml缓冲器W的1毫升链霉素-Tactin超流重力流柱
      注意：这是必要添加用于增溶的浓度10倍以上的临界胶束浓度（cmc）的任何缓冲的纯化过程中的洗涤剂。
3. 从溶解样品和超速离心除去微磁性棒以100,000×g离心30分钟，以沉淀不溶性膜级分。用移液管进行进一步的纯化除去上清液。
4. 加载上清上柱。只与重力流运行列。用5毫升的缓冲W.洗柱重复此洗涤步骤5倍。
5. 洗脱膜诱饵蛋白1毫升缓冲液E.重复此洗脱步骤4倍。
6. 浓缩洗脱馏分2，3，和4到300微升用离心过滤单元。
7. 混合200μl的各样品与50μl的5×SDS-PAGê样染料。在125微升等份分割每个准备。熬每个准备20分钟的一个等分在95℃，以扭转甲醛交联。让样品冷却至室温的台式至少10分钟。
8. 负载从每个样品30μl到聚丙烯酰胺凝胶适合免疫的单一车道。使用预染色分子量标记为最佳方位和运行的SDS-PAGE ^10。

4。免疫印迹分析，以确认合作伙伴的互动

1. 一旦步骤3.8完成后，转移蛋白至硝酸纤维素膜，例如由半干法。
2. 阻断膜，以防止非特异性标记。制备封闭缓冲液通过称量牛血清白蛋白（BSA），以实现每单位体积的3％重量在Tris缓冲盐水补充有0.05％吐温20（TBS-T）的最终浓度。用封闭缓冲液以覆盖膜的足够体积。阻挡膜1小时，在室温下。
3. 一个稀ND孵化猎物蛋白特异性第一抗体如常。使用HRP-连接的抗体作为第二抗体。
4. 采用化学发光检测试剂盒具有灵敏度高发展免疫。采用经典的胶片处理过程或数码影像设备监控信号。

5。 NanoLC-ESI-MS/MS高分辨率实验，以确定合作伙伴的互动

1. 的情况下，没有特定的抗体可用于猎物蛋白或未知的相互作用伙伴应查明，使用质谱法（MS）进行鉴定。为了防止角蛋白污染，用预制凝胶用于蛋白质的分离。
2. 用MS-兼容染色试剂盒根据制造商的方案银染色的SDS-PAGE。执行中玻璃坦克所有的染色和洗涤步骤。
3. 消费各个频段和高解析度的LC / MS ⁹分析这些。

结果

膜脊柱分析可以共同净化膜蛋白和瞬时相互作用蛋白的合作伙伴。共纯化是通过使用交联剂的甲醛来实现。两个参数是关键的，以防止非特异性交联：甲醛的浓度和交联时间。足够的，但不能过量使用甲醛可以很容易地通过免疫印迹法进行控制。甲醛交联的蛋白质复合物可以通过煮沸而不是由SDS处理进行分离。因此，它们可以在链球菌二型标签膜诱饵蛋白印迹如涂抹在免疫印迹的未煮沸样品的上?...

讨论

膜脊柱的分析是生化的方法，使一个确认，并确定膜蛋白的这点未知的互动合作伙伴。膜脊柱由甲醛与链球菌标签膜诱饵蛋白的纯化结合在体内的交联。用免疫印迹法的组合有利于预测的相互作用伙伴的确认（ 图2）。此外，与MS分析的组合允许未知的相互作用伙伴的标识（ 图3）。对于这两种应用程序，有修改你的猎物蛋白质没有要求。此外，膜脊柱是足够的敏感...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge