Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı<em&gt; In Vivo</em

Özet

Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.

Özet

Zar proteinleri, hücre canlılığı için gerekli olan ve bu nedenle önemli bir terapötik hedef ^1-3 bulunmaktadır. Bu kompleksler ⁴ işlev için, bunların etkileşimleri belirlemek ve karakterize etmek için yöntemler ⁵ gereklidir. Bu amaçla, biz Membran-OMURGA ⁶ denilen Membran Strep-protein etkileşim deney geliştirdi. Bu teknik, Strep-işaretli zar yem proteinin afinite saflaştırma ile geri dönüşümlü çapraz bağlayıcı formaldehit kullanılarak çapraz bağlama, in vivo olarak bir araya getirmektedir. İşlem sırasında, çapraz bağlanmış av proteinleri membran yem protein ile birlikte saf hale getirilir ve daha sonra kaynatılarak ayrılır. Membran omurga kullanılarak zar proteinlerinin protein-protein etkileşimleri (PPI) analiz Bu yüzden, iki ana görevleri icra edilebilir: ilk olarak, immün, tarafından önerilen bir etkileşim ortağının ikinci onay, kütle spektrometrisi analizi ile yeni etkileşim ortaklarının tespiti . Dahası, lafinite ow, geçici PPIs Bu teknik ile tespit edilebilir. Son olarak, Membran-OMURGA membran proteinlerinin PPI tanımlamak için güçlü bir tarama aracı olarak geçerli hale, hemen hemen herhangi bir hücre tipine uyarlanabilir.

Giriş

Bir proteinin işlevini anlamak için onun etkileşim ortaklarını bilmek önemlidir. Çeşitli klasik teknikler çözünür proteinlerin etkileşimi ortaklarının tespiti için kullanılabilir. Ancak, bu teknikler, hidrofobik doğası ⁴ dolayı zar proteinleri kolaylıkla transfer edilemez. Bu sınırlamayı aşmak için, Membran Strep-protein etkileşim deneyi (Membran-OMURGA) ⁶ geliştirdik. Bu çözünür proteinler ⁷ için uygundur olan OMURGA yöntemine dayanmaktadır.

Çapraz bağlama maddesi, iki formaldehid avantajlarından zara OMUR faydaları: ilk olarak, formaldehit kolayca nüfuz membranlar ve bu nedenle, bir canlı hücrenin ^8'in interactome kesin bir görüntüsünü oluşturur olabilir. İkincisi, formaldehit çapraz bağlantılar ⁹ kaynatılarak ters olabilir. Burada, bu iki avantajı zar prote sürekli değil, aynı zamanda geçici bir PPI, sadece tanımlamak için kullanılırins ^6.

Kısaca, Strep-eklentisi, integral zar yem proteinin C-ucuna kaynaştırılır. Membran yem proteini eksprese eden hücreler, çapraz bağlantıları membran proteinine yem proteinleri av formaldehid (Şekil 1) ile birlikte inkübe edilir. Av proteinleri modifikasyonları gerekli değildir. Daha sonra, membran fraksiyonu hazırlanır. Bu nedenle, membran proteinleri proteinleri afinite arıtma kullanarak av proteinleri ile birlikte saf hale deterjan tedavisi ve yem ile eritilir. Daha sonra, çapraz-link kaynatma ile tersine çevrilir ve yem ve eş-elüt av proteinler SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Son olarak, av proteinleri bağışıklık beneklenme analizi veya kütle spektroskopisi ile tespit edilebilir.

Protokol

Not: protokolde belirtilen tamponlar ile ilgili detaylı bilgiler Tablo 1'de kullanılabilir.

1.. Formaldehit Yaşayan hücreler içinde Çapraz bağlama ile protein-protein etkileşimleri Fixation

1. Büyüme ortamı, stok çözümleri ve tampon P1 hazırlamak başlamak için
   1. 500 ml ortam hazırlayın: orta yem zar proteini ve av proteinleri arasındaki etkileşimi destek koşulları sağlamalıdır. Buna ek olarak, bir deney bir etkileşim (çapraz bağlanması olmayan, örneğin) beklenen koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
      Not: stresli olan ve olmayan stresli bakterilerde protein-protein etkileşimleri karşılaştırın. Bu nedenle, bir 2 L Erlenmeyer şişesi içinde stres yaratıcı bir madde (örneğin, 0.5 M NaCI) ile tamamlamak 500 ml Luria Bertani (LB) ortamı (Tablo 1) hazırlanması. Kontrolü için, 0.17 M NaCl (pH 7.0) normal LB ortamını kullanın.
   2. Tris-tamponu hazırlayın (20 mM Tris-HCl, pH 8.0) ve 0.1 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), pH 8.0 stok çözeltisi (Tablo 1).
   3. Tampon P1 hazırlayın. Tris-tampon maddesi içinde 0.5 M bir son konsantrasyona kadar sakroz çözülür. Süzme ile sterilize tampon P1 ve 4 ° C'de saklayın
2. Bir vektör bir C-terminal Strep-eklentisi füzyonu ile yem zar proteini sentezleyen hücrelerin büyümesine. Yeterli bir süre için yem zar proteinlerinin ifadesini teşvik eder.
   Not: Bu 500 ml ortam için 250 ul 1 M izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenmesi ile erken-log fazında (A ₆₀₀ = 0.3) de (nihai konsantrasyon: 0.5 mM), bakteriyel yem zar proteinlerinin sentezlenmesini uyaran . Yeterli ifadesine olanak tanımak için, geç log fazında (A ₆₀₀ = 1.2) kadar bakteri inkübe edin.
3. 300 ml'lik bir minimum hacimde her iki kültür santrifüj bardak hazırla ve buz üzerine yerleştirin.
4. Formaldehit çapraz bağlanmasını gerçekleştirmek.
   CAUDOĞRULANAMADI: Formaldehit son derece toksik Biz güvenlik davlumbaz altında çalışmanızı öneririz..
   1. Bir güvenlik davlumbaz altında kültür damarı aktarın. (- X) ve çapraz bağlama formaldehid (+ X) da dahil olmak üzere bir iki numune, çapraz-bağlama atlama içine her bir örnek ayrıldı. % 0.6 'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere 250 ml kültüre 4 ml% 37 formaldehit çözeltisi ekleyin.
5. Geri kültür damarları transferi ve daha önce olduğu gibi 20 dakika daha hücreler büyür.
6. Bir güvenlik davlumbaz altında santrifüj tüplerine içine kültürleri doldurun. 30 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile hücreler toplayın.
7. Dikkatli bir güvenlik davlumbaz altında yukarı pipetleme süpernatant atın. Toksik formaldehit içeren süpernatant toplayın ve uygun şekilde atın.
8. Membran proteini hazırlanması sırasında en iyi verimi ulaşmak için, ilk olarak spheroplastlar hazırlar. Burada, Gram-negatif bakterilerin sferoplast oluşumu için bir protokol sağlar:
   1. Prepare tampon P2 (Tablo 1) liyofilize toz. Yavaşça, 1.5 ml bir tüp içinde, 0.1 M EDTA, pH 8 içinde 2 mg lizozim çözülür. Her deney günü için taze tampon P2 hazırlar.
   2. Proteaz inhibitörü (tampon P3) ile Tris-tamponu hazırlayın. Tris-tampon maddesi içinde 10 ml'lik, 10 mM'lik bir son konsantrasyona değin 0.1 ml 1 M fenilmetilsülfonilflüorür (PMSF) (Tablo 1) ekleyin. Proteaz inhibitörü olarak PMSF düzgün çalışmasını sağlamak için, hemen tampon kullanın.
   3. Proteaz inhibitörü ve bir 15 ml konik tüp transfer çözeltisi ile 10 ml Tris-tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücre topakları.
   4. 1 ml tampon P2 ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
   5. 30 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj ile spheroplastlar toplayın ve dikkatli bir şekilde supernatant atın.
9. -20 ° C de bir gece inkübe sferoplast granül

2. Strep-eklentisi Membran protein saflaştırılması (yem)

1. Buz üzerinde sferoplast pelet yerleştirin.
2. Sferoplast pelet, buz üzerinde çözülme süre boyunca, her bir sferoplast hazırlanması için, 10 ml tampon P3 hazırlar. Yavaşça 10 ml Tris-tampon maddesi içinde 1 mg DNaseI çözülür. Kullanımdan hemen önce 0.1 ml 1 M PMSF ekleyin.
3. 6 ml taze hazırlanmış P3 pelet tekrar. Spheroplastlar engellemek amacıyla, her bir patlama ile 1 dakika duraklama ile buz üzerinde sürekli olarak 1 dakika boyunca bir numune dört kez sonikasyon.
4. Hasat hücre artıkları için 10 dakika 10,000 x g'de santrifüjleyin örnek. Ultrasantrifüj işlemi, tüp, bir pipet kullanılarak süpernatan aktarın.
5. 30 dakika boyunca 100,000 x g'de membran fraksiyonu Pelet. Çözündürülerek olmadan Tris-tampon maddesi içinde dikkatli bir şekilde pelet yıkayın. Bir ince kağıt (örneğin, Kleenex) ile tüp kurutun. Herhangi bir zamanda pelet rahatsız kaçının.
6. 1 ml Tris-tampon maddesi içinde dikkatli bir pelet (= zar) yeniden süspanse edin. Örneğin, BCA analizi ile protein konsantrasyonunu belirlemek için, 20 ul bir kısım kullanın. Bu adımda, membranlar şok li dondurulabilirsterlin azot ve -80 ° C'de saklandı

3. Strep-eklentisi Membran yem Protein ve SDS-PAGE ile saflaştırılması

1. Tris-tamponu ile 5 mg / ml membran fraksiyonunun konsantrasyonu protein normalize. Ultrasantrifüj işlemi bir tüp içinde 2.5 ml membran fraksiyonu (5 mg / ml) alın ve zar proteinleri çözündürülmesi amacıyla,% 2'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için% 20 Triton X-100 ve 0.25 ml ekleyin. Bir mikro-manyetik çubuk ilave edilir ve 1 saat boyunca buz üzerinde karıştırılmıştır.
   Not: genel olarak, deterjan olarak Triton X-100 kullanılarak iyi sonuçlar vermesine rağmen, bu optimizasyonu için deterjan değiştirmek için yararlı olabilir. Bu bağlamda, ilgili yem zar proteininin fonksiyonel saflaştırılması için kullanılan deterjan ile en iyi sonuçları vardır.
2. Adım 3.1 yerine getirirken, 50 ml (Tablo 1) W ve 5 ml tampon E tampon hazırlar. 10 ml 5x tampon W konsantre ml 50 kadar doldurun ve 150 ul% 20 Triton X-100 ekleyin.
   1. 1 ml 5x Buffe doldurunr E 10 ml'ye konsantre ve 30 ul% 20 Triton X-100 ilave edin. 8 ml tampon W ile bir 1 ml Strep-taktin superflow yerçekimi akışlı sütuna Denge
      Not: Bu saflaştırma işlemi sırasında herhangi bir tampon maddesi içinde kritik misel konsantrasyonunun (cmc) üstünde bir konsantrasyonu, 10-kat içinde çözündürme için kullanılan deterjan eklemek için gereklidir.
3. Çözünmeyen membran fraksiyonu pelet haline getirmek üzere, 30 dakika boyunca 100,000 x g'de çözündürme örnek ve ultrasantrifuju gelen mikro-manyetik çubuk çıkarın. Daha fazla saflaştırma için bir pipet kullanılarak süpernatantı.
4. Kolona süpernatant yerleştirin. Sadece yerçekimi akışı ile sütun çalıştırın. Bu yıkama adımı 5x tekrar 5 ml tampon W. ile sütun yıkayın.
5. Bu yıkama adımı 4x tekrarlayın 1 ml tampon E. ile membran yem proteinleri Zehir.
6. Bir santrifüj filtre birimi ile elüsyon fraksiyonları 2, 3, ve 4-300 ul konsantre edin.
7. 50 ul 5x SDS-PAG ile her bir numunenin 200 ul karıştırınE yükleme boyası. 125 ul hacimde her hazırlık ayrıldı. Formaldehit çapraz bağlantıları tersine çevirmek için, 95 ° C'de 20 dakika boyunca her bir preparasyonun bir kısım kaynatın. Numuneler tezgah üstünde en az 10 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
8. Immunoblotting için uygun olan bir poliakrilamid jel tek bir şerit için yük Her bir numune, 30 ul. Iyi yönlendirme için bir Prestained molekül ağırlığı bir kalem kullanın ve SDS-PAGE ¹⁰ çalıştırın.

4. İmmünoblot Analizi Etkileşim Ortaklar Onayla

1. Bir kez, örneğin 3,8 ile yan-kuru bir nitroselüloz zara transfer proteinleri aşama tamamlanır.
2. Spesifik etiketleme önlemek için membran engelleyin. % 0.05 Tween-20 (TBS-T) son bir konsantrasyon ile takviye edilmiş Tris-tamponlu tuzlu su içinde hacim başına% 3 ağırlık elde etmek sığır serum albümini (BSA) tartı ile blokaj tamponu hazırlayın. Membran karşılamak için blokaj tamponu yeterli bir hacmi kullanın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke membran.
3. Seyreltiknd zamanki gibi av proteini spesifik bir ilk antikor kuluçkaya yatmaktadır. İkinci antikor olarak bir HRP-bağlı antikor kullanarak.
4. Yüksek hassasiyet ile bir kemilüminesan algılama kiti kullanılarak immüno geliştirin. Klasik bir film işleme yordamı veya dijital görüntüleme ekipmanı kullanarak sinyalini izleyin.

5. Etkileşim Ortaklar tanımak NanoLC-ESI-MS/MS Yüksek Çözünürlük Deneyleri

1. Belirlenmelidir özel bir antikor, av proteini ya da bilinmeyen bir etkileşim ortakları için kullanılabilir durumda, tanımlama için kütle spektrometresi (MS) kullanılır. Keratin kirlenmesini önlemek amacıyla, protein ayrılması için precasted jelleri kullanın.
2. Gümüş, üreticinin protokolüne göre, bir MS-uyumlu bir boyama kiti kullanılarak SDS-PAGE leke. Cam tanklarda tüm boyama ve yıkama adımları gerçekleştirin.
3. Tüketim ilgili bantları ve yüksek çözünürlüklü LC / MS ⁹ bu analiz.

Sonuçlar

Membran OMURGA analiz zar proteinlerinin ortak arıtma ve geçici olarak etkileşimli protein ortakları sağlar. Co-saflaştırma çapraz bağlama ajanı formaldehit kullanılarak elde edilir. Formaldehit konsantrasyonu ve çapraz bağlama süresi: İki parametre spesifik olmayan çapraz bağlantı engellemek için kritik öneme sahiptir. Formaldehid aşırı yeterli ama kullanımı kolay immunoblotting ile kontrol edilebilir. Formaldehit çapraz bağlanmış protein kompleksleri, SDS işlenerek kaynama değil ile ayr?...

Tartışmalar

Membran OMURGA analiz onaylamak ve membran proteinlerinin bu noktada bilinmeyen bir etkileşim ortakları tanımlamak için birini sağlayan biyokimyasal bir yaklaşımdır. Membran OMURGA bir Strep-etiketli yem zar proteini saflaştırılması ile formaldehid ile çapraz bağlanması vivo olarak bir araya getirmektedir. Immüno-lekeleme ile kombinasyon tahmin etkileşim ortaklarının onay (Şekil 2) kolaylaştırır. Buna ek olarak, MS analizi ile kombine bilinmeyen etkileşim ortaklarının ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge