الثقافة الأولية من الإنسان الدهليزي Schwannomas

Summary

الدهليزي Schwannomas (VSS) هي أورام غير خبيثة من خلية شوان (SC) الأصل، ويرتبط مع طفرات في الجينات الكابتة للورم NF2. نحن الإبلاغ عن استنساخه، بروتوكول فعالة لالإنسان الأساسية VS ثقافة الخلية التي تسمح للتلاعب التجريبية الجزيئية والخلوية والتحليل ويلخص طبيعة غير متجانسة من الأمراض التي تصيب البشر.

Abstract

schwannomas الدهليزي (VSS) تمثل خلية شوان (SC) أورام العصب الدهليزي، المساومة 10٪ من جميع الأورام داخل الجمجمة. VSS تحدث في (نوع الورم العصبي الليفي 2، NF2) أشكال إما متفرقة أو العائلية، سواء المرتبطة تعطيل عيوب في الكابتة للورم NF2 الجينات. العلاج لVSS عموما استئصال الجراحي أو الشعاعية، ولكن الاعتلال مثل هذه الإجراءات قد قاد التحقيقات في علاجات أقل الغازية. تاريخيا، وعدم الحصول على عينات أنسجة جديدة، وحقيقة أن الخلايا شفاني لا خلد أعاقت بشكل كبير من استخدام الثقافات الأولية للتحقيق في شفاني تكون الأورام. للتغلب على إمدادات محدودة من الثقافات الأولية، تم إنشاء خط الخلية HEI193 VS خلده تنبيغ مع فيروس الورم الحليمي البشري E6 E7 والجينات المسرطنة. أدخلت هذه التعديلات أنكجنيك تنبيغ الجزيئية والمظهري كبيرة في الخلايا، والتي تحد من استخدامها كنموذج ليالي الإنسانالأورام chwannoma. وبالتالي فإننا توضيح مبسط، بروتوكول استنساخه لثقافة الإنسان الأساسية VS الخلايا. يتقن هذه التقنية بسهولة يسمح للتحقيقات الجزيئية والخلوية التي ألخص أكثر دقة تعقيد المرض VS.

Introduction

schwannomas الدهليزي (VSS) تمثل خلية شوان (SC) أورام العصب الدهليزي، المساومة 10٪ من جميع الأورام داخل الجمجمة ^1-3. VSS تحدث في (نوع الورم العصبي الليفي 2، NF2) أشكال إما متفرقة أو العائلية، سواء المرتبطة تعطيل عيوب في الكابتة للورم NF2 الجينات. العلاج لVSS عموما استئصال الجراحي أو الشعاعية، ولكن الاعتلال مثل هذه الإجراءات تشمل الصمم، واعتلال الأعصاب في الوجه، وتسرب السائل الشوكي، وعدم التوازن، وإعادة نمو الورم ^1. بالإضافة إلى ذلك ليس كل المرضى المرشحين الجراحية أو الإشعاع مقبولة. مثل قسط كبير من المراضة وكذلك عدم وجود العلاجات البديلة قد قاد التحقيق في البيولوجيا الجزيئية فريدة من VSS أملا في تطوير علاجات جديدة ^3،4.

يسمح زراعة الخلايا لتحليلها السريع، السهل، ومتعمقة للسلوك الجزيئية والخلوية وفحص كوم العلاجية المحتملةجنيه. تاريخيا، وعدم الحصول على عينات أنسجة جديدة، وحقيقة أن الخلايا شفاني لا خلد أعاقت بشكل كبير من استخدام الثقافات الأولية للتحقيق في شفاني تكون الأورام. للتغلب على إمدادات محدودة من الثقافات الأولية، تم إنشاء خط الخلية HEI193 VS خلده تنبيغ مع فيروس الورم الحليمي البشري E6 E7 والجينات المسرطنة ^5. أدخلت هذه التعديلات أنكجنيك تنبيغ الجزيئية والمظهري كبيرة في الخلايا، والتي تحد من استخدامها كنموذج للأورام شفاني الإنسان. SC الثقافات المستمدة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى الجين NF2 وظيفية تمثل بديلا آخر للتحقيق NF2 التي تعتمد SC تكون الأورام في المختبر. ولكن هذه الثقافات تفشل في ألخص طبيعة غير متجانسة من VSS الإنسان أو حساب لسلوك معين الإنسان. معظم تقنيات الثقافة VS السابقة المطلوبة أوقات المعالجة طويلة نسبيا ومعقدة تقنيات ثقافة انتقائية ^6-8.هنا نقدم، بروتوكول بسيط لاستنساخه الأولية VS ثقافة الخلية مع معالجة كاملة في أقل من 3 دقائق، مع 95٪ النقاء الخلية السرطانية على النحو الذي يحدده المناعية.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام العينات السرطانية البشرية في هذا البروتوكول من قبل جامعة ولاية ايوا مجلس المراجعة المؤسسية (IRB): بيان الأخلاق.

1. إعداد قبل يوم ورم الحصاد

1. معطف الخليوي لوحات الثقافة: في غطاء الثقافة العقيمة، وإضافة ما يكفي من بولي-L-الأورنيثين (0.01٪ الحل) لتغطية الجزء السفلي من ثقافة البوليسترين / البلاستيك جيدا / طبق، استبدال الأغطية، وترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل 2 ساعة. الشرائح الزجاجية أو coverslips يمكن أن تكون بديلا عن البوليسترين للتجارب التي تتطلب التصوير.
2. بعد 2 ساعة، وإزالة-L-الأورنيثين بولي حل مع الشفط والسماح لوحات لتجف تماما في اغطية الثقافة العقيمة. إضافة ما يكفي من حل laminin (10 ميكروغرام / مل في كا ^{2 +} / ² ملغ ⁺ خالية HBSS [HBSS / -]) لتغطية كامل لوحات والثقافة، واستبدال الأغطية، ثم إما 1) في مكان بارد 4 ° C الثلاجة بين عشية وضحاها، أو 2) وضع في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل. إذا لوحاتسيتم تخزين بين عشية وضحاها أو أطول، والتفاف على لوحات في غلاف بلاستيكي لمنع التبخر / جفاف.

2. الإعداد يوم ورم الحصاد

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام: يرصد وسائل الاعلام الطازج في يوم الحصاد الورم ومعالجة وتخزينها في 4 درجات مئوية، ودرجة حرارة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة مباشرة قبل وسائل الإعلام الإضافات / التغييرات.
2. وسائل الإعلام ثقافة شفاني مرتفع الجلوكوز (4.5 ملغ / مل) DMEM (مع الفينول الحمراء) مع 0.1 ملغ / مل البنسلين و 0.1 ملغ / مل الستربتوميسين؛ وسائل الإعلام N2 تكملة التخفيف النهائية 1:100؛ الأنسولين البقري 5 ميكروغرام / مل؛ مصل بقري جنيني إلى إجمالي حجم 10٪. تصفية جميع وسائل الإعلام من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
3. تحضير العينة النقل المبردة: ارسال برودة الجليد مليئة 1-2 (اعتمادا على كمية من الورم ليتم حصادها) العقيمة أنابيب مخروطية 50 مل مع 25 مل HBSS مع كا ^{2 +} / ^{+ 2} ملغ (HBSS + / +) الى غرفة العمليات لنقل عينة الورم والنقل.
4. إعداد فرديidual أنابيب الورم تفارق - ملء العقيمة 2 مل جولة أنابيب أسفل مع 1 مل من HBSS + / + ومكان على الجليد. (سوف تستخدم أنابيب للتشريح حادة / تفكك عينات الورم).
5. لتفارق، وإعداد ما يقرب من أنبوب تفارق لكل 0.5 سم ³ من الأنسجة التي تحصد؛ على سبيل المثال، سوف عينة الورم قياس 1.0 × 1.0 × 1.0 سم (1 سم ³⁾ تتطلب اثنين HBSS أنابيب + / + التفكك.
6. تعقيم الأشعة فوق البنفسجية: مقص مكان الأنسجة، ملقط صغير، والتعامل مع مشرط، 1X طبق بتري العادية، P1000 ماصة، ونصائح ماصة في غطاء الثقافة العقيمة، وترك تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ل~ 15 دقيقة قبل الوصول وتجهيز نسيج الورم.

3. عينة عزل والنقل

1. عزل عينات الورم عن طريق استئصال الجراحي.
2. وضع على الفور عينات الورم في HBSS الجليد الباردة + / + في أسرع وقت ممكن بعد إزالة من المريض. مرة واحدة كل TISSUيتم جمع عينات ه، وعينات النقل (على الجليد) من المسرح المنطوق إلى المختبر لمزيد من المعالجة.

4. تفارق الأنسجة وسحن

1. التالية تقنية معقمة القياسية في غطاء تدفق الصفحي، وجلب أنبوب مخروطي مع عينة الورم في غطاء محرك السيارة والثقافة، وغسل العينات بواسطة قلب الأنبوب والورم 50X. تسمح شظايا في الانخفاض إلى أسفل الأنبوب، ثم إزالة HBSS + / +. إعادة ملء مع 30 مل HBSS + / +، وتستنهض الهمم / عكس 50X مرة أخرى. تكرار إزالة انعكاس / وسائل الإعلام ليصبح المجموع 4X.
2. اعادة تعليق شظايا الورم في 30 مل HBSS + / + للمرة الأخيرة، ثم صب الخليط في طبق بتري ملم sterile100، والورم منفصلة إلى 0.5 سم ³ مجموعات. إذا واجهت شظايا الورم أكبر، استخدم مقص أو مشرط الأنسجة (# 11 أو # 15 شفرة) لمقطعة إلى قطع أصغر.
3. استخدام ملقط لوضع مجموعات الأنسجة 0.5 سم ³ في الفرد HBSS + / + شغلها، 2 مل أسفل الجولة مخروطيأنابيب القاعدة وكل على الجليد. استخدام مقص لتخطر على الأنسجة السرطانية في أجزاء الفرعية 1 ملم شظايا-تعليق ينبغي أن يكون لها مظهر 'سنوجلوب' (الشكل 1). تخطر على الورم فقط حتى الغالبية العظمى من شظايا هي الفرعية 1 مم؛ لا 'أكثر من اللحم المفروم' عينات الورم. وضع أنبوب الأنسجة المفروم تماما مرة أخرى على الجليد، وكرر مع جميع أنابيب عينة إضافية.
4. نقل جميع عينات الورم مجزأة إلى واحدة 15 مل أنبوب مخروطي. ماصة P1000 مع خفض / تعديل غيض العقيمة يعمل بشكل جيد لهذه الخطوة. استخدام اضافية HBSS + / + لطرد / شطف 2 مل تفارق أنابيب للتأكد من تم جمع كل عينة الورم في أنبوب 15 مل. تدور باستمرار الخليط في أجهزة الطرد المركزي في 23 درجة مئوية، في 73 x ج لمدة 5 دقائق.
5. شفط قبالة HBSS + / +، وترك بيليه الخلية. اعادة تعليق شظايا في 1:01 خليط من 0.25٪ التربسين: 0.2٪ كولاجيناز (الذائبة في HBSS / -) - إضافة ما يكفي فقط للحفاظ على شظايا الورم في ضيق سوspension. استبدال المسمار العلوي، ووضعه في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تستنهض الهمم خليط الخلية مرة واحدة على الأقل خلال فترة الحضانة للحفاظ على شظايا في التعليق. وضع وسائل الإعلام ثقافة شفاني في حاضنة دافئة لأنه في هذا الوقت أيضا.
6. بعد الحضانة، وإضافة 100 ميكرولتر FBS إلى كل أنبوب لإبطال نشاط التربسين، ثم عينة الطرد المركزي في 23 درجة مئوية، 73 x ج لمدة 5 دقائق. باستخدام ماصة، شفط بعناية قبالة بقدر طاف ممكن من دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة سائل الإعلام والثقافة الدفء (N2/insulin/5٪ FBS) إلى شظايا الورم إلى نسبة 1:2 النهائية شظايا الورم: وسائل الإعلام والثقافة (على سبيل المثال، إذا كان هناك 1 مل من شظايا الورم، إضافة في 2 مل من درجة حرارة وسائل الإعلام).
7. الاستعداد للورم سحن عن طريق خفض غيض الخروج من غيض ماصة P1000 ليبلغ قطرها حوالي 1-2 مم. يسحن ببطء تعليق الخلية باستخدام نصائح تدريجيا أصغر وأصغر قطرها ماصة، حتى يمكنك بسهولة ماصة الحل من خلال unaltالدو P1000 ماصة. على الفور انتقل إلى تلميح أصغر مرة واحدة يمكنك بسهولة ماصة الحل الورم من خلال طرف - لا يسحن على العينة. إذا قطعة واحدة من أكبر كتل الأنسجة الطموح خلال سحن، والتنصت غيض ماصة على الجزء السفلي من الأنبوب المخروطية غالبا ما يسمح استمرار سحن.

5. الخليوي تصفيح

1. واحد 0.5 مم ³ جزء من الأنسجة غير كافية لبذر 1 × 100 مم طبق، أو 4 × الشرائح 8-well/4-well. فقط قبل إضافة خليط سائل الإعلام / خلية، وإزالة حل laminin من لوحات الثقافة ولكن لا تدع لوحات الجافة.
2. لكل 100 ملم طبق، ويحل جزء الورم في 10 مل تحسنت سائل الإعلام والثقافة.
3. لكل بئر من الشريحة 4 جيدا، استخدم 750 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة الدفء (3 مل للشريحة كاملة).
4. لكل بئر من الشريحة 8 جيدا، استخدم 400 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة الدفء (3.2 مل للشريحة كاملة).
5. احتضان الثقافات في 37 و# 160؛ درجة مئوية، الرطوبة 100٪، 6٪ CO _2. مغادرة الثقافات وحدها لمدة 36 ساعة على الأقل، ثم قم بتغيير وسائل الإعلام إذا تم المصفرة الحل (الحامضية). خلاف ذلك تغيير وسائل الإعلام في 72 ساعة، ثم كل 2-3 أيام، أو عندما تصبح وسائل الإعلام الحمضية. إذا أصبحت وسائل الإعلام حمضية يوميا لعدة أيام متتالية، وهذا هو عادة مؤشرا على التلوث الجرثومي أو الخميرة المحتملة.

النتائج

تفتيت الورم الصحيح هو ضروري لبذر الأمثل وثمرة في أطباق زراعة الأنسجة (الشكل 1). تحديد الخلايا شفاني خلال الأيام الأولى بعد الطلاء غالبا ما يكون صعبا، وذلك بسبب حجب كميات من الحطام الخلوية وخلايا الدم الحمراء. قبل ^عشر 4 أو اليوم ^ال 5، وملحقات خلية با...

Discussion

تاريخ الثقافات في المختبر شفاني

بدأت الجهود الرامية إلى إنشاء المختبر في الثقافات شفاني فقط بضعة عقود بعد بأورام في العصب السمعي الأولي وقعت استئصال الجراحي المفتوحة في عام 1894 ^12. كانت الثقافات سجلت أول م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components