העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

Summary

שיווי המשקל schwannomas (VSS) הם גידולים לא ממאירים ממוצא שוואן תא (SC), הקשורים עם מוטציות בגן המדכא גידולי NF2. אנו מדווחים על פרוטוקול לשחזור, יעיל לאנושי ראשוני VS תרבית תאים המאפשר מניפולציה ניסויית מולקולרית ותאית וניתוח ומשחזר את האופי הטרוגנית של מחלות בבני אדם.

Abstract

schwannomas שיווי המשקל (VSS) מייצג תא שוואן גידולים (SC) של עצב שיווי המשקל, להתפשר 10% מכלל השאתות תוך גולגולתי. VSS להתרחש ב(, נוירופיברומטוזיס NF2 סוג 2) צורות או ספורדי או משפחתיות, שניהם קשורות עם מומי inactivating במדכאי סרטן NF2 גנים. טיפול VSS הוא בדרך כלל כריתה כירורגית או radiosurgery, עם זאת התחלואה של נהלים כאלה העלתה חקירות לטיפולים פחות פולשניים. מבחינה היסטורית, היעדר הגישה לדגימות רקמה טריות והעובדה שתאי schwannoma לא הונצחו יש הכביד באופן משמעותי את השימוש בתרבויות עיקריות לחקירה של tumorigenesis schwannoma. כדי להתגבר על ההיצע המוגבל של תרבויות עיקריות, שורת תאי HEI193 VS הונצחה נוצרה על ידי התמרה עם אונקוגנים HPV E6 ו-E7. התמרה בשעור זה הציגה שינויים מולקולריים ופנוטיפי משמעותיים לתאים, המגבילים את השימוש בם כמודל לשל אדםגידולי chwannoma. לפיכך, אנו מדגימים פרוטוקול פשוט יותר, לשחזור לתרבות אנושית ראשוני VS תאים. טכניקה לשלוט בקלות זה מאפשרת לחקירות מולקולריות ותאיות שיותר במדויק לשחזר את המורכבות של המחלה VS.

Introduction

schwannomas שיווי המשקל (VSS) מייצג תא שוואן גידולים (SC) של עצב שיווי המשקל, להתפשר 10% מכלל השאתות תוך גולגולתי ^1-3. VSS להתרחש ב(, נוירופיברומטוזיס NF2 סוג 2) צורות או ספורדי או משפחתיות, שניהם קשורות עם מומי inactivating במדכאי סרטן NF2 גנים. טיפול VSS הוא בדרך כלל כריתה כירורגית או radiosurgery, עם זאת התחלואה של נהלים כאלה כוללת חירשות, נוירופתיה פנים, דליפת נוזל השדרה, חוסר איזון, וצמיחה מחודשת גידול ^1. בנוסף לא כל החולים הם מועמדים ניתוחיים או קרינה מקובלים. תחלואה כה משמעותית, כמו גם חוסר טיפולים אלטרנטיביים העלתה חקירת הביולוגיה מולקולרית הייחודית של VSS בתקווה לפתח טיפולים חדשניים ^3,4.

תרבית תאים מאפשרת ניתוח מהיר, קליל, ומעמיק בהתנהגות והקרנה מולקולריות ותאית של com הטיפולי הפוטנציאליקילו. מבחינה היסטורית, היעדר הגישה לדגימות רקמה טריות והעובדה שתאי schwannoma לא הונצחו יש הכביד באופן משמעותי את השימוש בתרבויות עיקריות לחקירה של tumorigenesis schwannoma. כדי להתגבר על ההיצע המוגבל של תרבויות עיקריות, שורת תאי HEI193 VS הונצחה נוצרה על ידי התמרה עם אונקוגנים HPV E6 ו E7 ^5. התמרה בשעור זה הציגה שינויים מולקולריים ופנוטיפי משמעותיים לתאים, המגבילים את השימוש בם כמודל לגידולי schwannoma אנושיים. תרבויות SC נגזרות מהקווים עכבר מהונדסים שאין גן NF2 פונקציונלי מייצגות אלטרנטיבה אחרת כדי לחקור tumorigenesis SC NF2 תלוי במבחנה. תרבויות אלה עם זאת יצליחו לשחזר את הטבע הטרוגנית של VSS או חשבון בבני אדם להתנהגות מסוימת של אדם. רוב טכניקות תרבות VS הקודמות נדרשות זמני עיבוד ארוכים יחסית וטכניקות תרבות סלקטיבית מסובכות ^6-8.כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט, לשחזור לעיקרי VS תרבית תאים עם עיבוד מלא בפחות מ -3 שעות, עם 95% טוהר תאים סרטניים כפי שנקבע על ידי immunostaining.

Protocol

הצהרת אתיקה: שימוש בדגימות גידול האנושיים בפרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת איווה דירקטוריון סקירה מוסדית (IRB).

1. התקנת היום לפני קציר גידול

1. צלחות תרבית תאי פרווה: במנדף תרבות סטרילי, להוסיף (פתרון 0.01%) פולי-L-ornithine מספיק כדי לכסות את תחתית תרבות קלקר / פלסטיק גם / צלחת, להחליף את המכסים, ולתת לשבת בטמפרטורת חדר למשך לפחות 2 שעות. שקופיות זכוכית או coverslips ניתן להחליף לקלקר לניסויים הדורשים הדמיה.
2. לאחר 2 שעות, להסיר-L-ornithine פולי הפתרון עם יניקה ולאפשר הצלחות להתייבש לחלוטין בברדסי תרבות סטרילי. הוסף מספיק פתרון laminin (10 מיקרוגרם / מיליליטר בCa ^{2 +} / Mg ^{2 +} ללא HBSS [HBSS-/ -]) כדי לכסות את צלחות התרבות לחלוטין, להחליף את המכסים, אז גם 1) מקום במקרר של 4 מעלות צלזיוס מגניב הלילה, או 2) מקום בחממת 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה 2. אם צלחותיאוחסן לילה או יותר, לעטוף את הצלחות בניילון נצמד, כדי למנוע אידוי / התייבשות.

2. הגדרת היום של גידול קציר

1. הכן את תרבות מדיה: מדיה מורכבת טרי ביום של קציר גידול ועיבוד, מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, וחיממה עד 37 ° C בחממה מייד לפני תקשורת שנוספו / שינויים.
2. תקשורת ותרבות Schwannoma היא גבוה גלוקוז (4.5 מ"ג / מיליליטר) DMEM (עם פנול אדום) עם 0.1 מ"ג / מיליליטר פניצילין ו0.1 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין; תקשורת N2 להשלים דילול סופי 1:100; אינסולין שור 5 מיקרוגרם / מיליליטר; בסרום שור עוברי 10% נפח כולל. לסנן את כל התקשורת דרך 0.22 מסנן מיקרומטר.
3. הכן את דגימת התחבורה Cooler: שלח צידנית קרח מלא עם 1-2 (תלוי בכמות של גידול להיות שנקטפו) צינורות חרוטי 50 מיליליטר סטרילי עם 25 מיליליטר HBSS עם Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} (HBSS + / +) לחדר הניתוח להעברת דגימת גידול והובלה.
4. הכן indivצינורות דיסוציאציה גידול idual - למלא 2 מיליליטר סטרילי סביב צינורות תחתון עם 1 מיליליטר של HBSS + / + ומניחים על קרח. (צינורות ישמשו לנתיחה / ניתוק חד של דגימות גידול).
5. לדיסוציאציה, להכין כ אחד צינור ניתוק לכל 0.5 ³ סנטימטר של רקמה שנקטפו; למשל, דגימת גידול מדידת 1.0 1.0 x 1.0 סנטימטר x (1 סנטימטר ³⁾ תדרוש שני צינורות + / + ניתוק HBSS.
6. עיקור אור אולטרה סגול: מספריים רקמת מקום, מלקחיים קטנים, ידית אזמל, צלחת פטרי 1x הנורמלית, פיפטה P1000, וטיפים פיפטה במכסת מנוע בתרבית סטרילית, ולהשאיר באור אולטרה סגול ל~ 15 דקות לפני הגעה ועיבוד של רקמת גידול.

3. בידוד דגימה ותחבורה

1. לבודד דגימות גידול על ידי כריתה כירורגית.
2. מייד למקום דגימות סרטניים לתוך HBSS קר כקרח + / + במהירות אפשרית לאחר ההסרה מהמטופל. ברגע שכל Tissuדגימות דואר נאספות, דגימות תחבורה (על קרח) מהתיאטרון האופרטיבי למעבדה לעיבוד נוסף.

4. דיסוציאציה רקמות וטחינה דקה

1. בעקבות טכניקה סטרילית סטנדרטית בזרימה למינרית, להביא את צינור חרוטי עם דגימת גידול למכסת המנוע בתרבית, ולשטוף את הדגימות על ידי היפוך צינור וגידול 50x. הרשה ברים ליפול לתחתית של התחתית, ולאחר מכן להסיר HBSS + / +. למלא עם 30 מיליליטר HBSS + / +, ולהתסיס / להפוך 50x שוב. חזור על הסרת היפוך / תקשורת עבור סכום כולל של 4x.
2. Re-להשעות ברי גידול ב30 מיליליטר HBSS + / + בפעם האחרונה, ולאחר מכן יוצק את התערובת לתוך צלחת פטרי מ"מ sterile100, וגידול נפרד ל0.5 סנטימטר ³ קבוצות. אם שברי גידול גדולים יותר הם נתקלו, השתמשו במספרי הרקמה או אזמל (# 11 או # 15 להב) לחתוך לחתיכות קטנות יותר.
3. השתמשו במלקחיים כדי למקם את 0.5 סנטימטר ³ קבוצות רקמה לתוך HBSS + / + מולא בודד, 2 מיליליטר חרוטי סיבוב תחתוןצינורות אל, כולם על קרח. השתמש במספרי הרקמה לברר שבברי גידול למשנה 1 מ"מ ברים-ההשעיה צריכה להיות מראה 'snowglobe' (איור 1). לרכך את הגידול רק עד שרוב הברים הם מ"מ משנה 1; לא 'מעל בשר טחון' דגימות גידול. הנח צינור רקמות טחון לחלוטין חזרה על קרח, וחזור עם כל צינורות דגימה נוספים.
4. להעביר את כל דגימות הגידול מקוטעות לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר אחד. פיפטה P1000 עם טיפ סטרילי לחתוך / שונה עובדת היטב עבור שלב זה. השתמש בתוספת HBSS + / + לשטוף / לשטוף את 2 צינורות דיסוציאציה מיליליטר כדי לוודא שכל מדגם הגידול נאסף ב15 צינור מיליליטר. ספין למטה תערובת בצנטריפוגה ב23 מעלות צלזיוס, ב73 XG במשך 5 דקות.
5. יניקה מHBSS + / +, עוזבת את התא גלולה. Re-להשעות ברים ב01:01 תערובת של טריפסין 0.25%: collagenase 0.2% (מומס בHBSS-/ -) - su ההדוק להוסיף רק מספיק כדי לשמור על שברי גידול בspension. החלף בורג העליון, ומקום ב37 חממת מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. להתסיס תערובת תא לפחות פעם אחת במהלך דגירה כדי לשמור על שברים בהשעיה. הנח את התקשורת ותרבות Schwannoma לתוך החממה כדי לחמם בשלב זה גם כן.
6. לאחר דגירה, להוסיף FBS 100 μl על צינור אחד כדי להשבית טריפסין, ולאחר מכן מדגם צנטריפוגות ב 23 ° C, 73 XG במשך 5 דקות. בעזרת פיפטה, יניקה בזהירות את supernatant ככל האפשר מבלי להפריע לתא גלולה. מוסיף את התקשורת חיממה התרבות (FBS% N2/insulin/5) לברי גידול ליחס סופי של 1:2 שברי גידול: תקשורת והתרבות (לדוגמא, אם יש 1 מיליליטר של שברי גידול, להוסיף 2 מיליליטר של חימם תקשורת).
7. היכונו לטחינה דקה גידול על ידי חיתוך הקצה מעל קצה פיפטה P1000 לקוטר של כ 1-2 מ"מ. לאט triturate ההשעיה התא באמצעות טיפים פיפטה הקוטר בהדרגה יותר ויותר קטנים, עד שאתה יכול בקלות פיפטה הפתרון דרך unaltקצה פיפטה ered P1000. מייד לעבור לטיפ קטן יותר ברגע שאתה יכול בקלות פיפטה פתרון הגידול בקצה - לא על triturate המדגם. אם חתיכה אחת גדולה של שאיפה בלוקים רקמות במהלך טחינה דקה, הקשה על קצה פיפטה על החלק התחתון של צינור חרוטי לעתים קרובות מאפשרת טחינה דקה המשך.

5. נייד ציפוי

1. אחד 0.5 מ"מ ³ שבר של רקמה הוא מספיק בקושי ל1 x 100 מנה מ"מ, או 4 x שקופיות 8-well/4-well. רק לפני הוספת תערובת מדיה / תא, להסיר את פתרון laminin מצלחות התרבות, אך לא נותן את הצלחות יבשות.
2. לכל מנה 100 מ"מ, לפזר את בר הגידול ב10 מיליליטר תקשורת התרבות חיממה.
3. לכל באר של שקופית 4 היטב, השתמש 750 μl תקשורת חיממה תרבות (3 מיליליטר לכל השקופית).
4. לכל טוב של שקופית 8 היטב, השתמש 400 μl תקשורת חיממה תרבות (3.2 מיליליטר לכל השקופית).
5. דגירה התרבויות ב37 &# 160; ° C, לחות 100%, 6% CO _2. השאר את התרבויות לבד לפחות 36 שעות, ולאחר מכן לשנות את התקשורת, אם הפתרון הוא הצהיב (חומצי). אחרת לשנות את התקשורת ב72 שעה, ולאחר מכן בכל 2-3 ימים, או כאשר אמצעי התקשורת הופכת לחומצי. אם התקשורת הופכת להיות חומצי מדי יום במשך כמה ימים ברציפות, זה בדרך כלל סימן לזיהום חיידקים או שמרים פוטנציאליים.

תוצאות

פיצול גידול נכון הוא חיוני לזריעה אופטימלית ותוצאה במנות בתרבית הרקמה (איור 1). זיהוי של תאי schwannoma בימים הראשונים לאחר ציפוי הוא לעתים קרובות קשה, בשל טשטוש כמויות של פסולת תאית ותאי דם אדומים. על ידי ^ה 4 או 5 יום ^ה, הרחבות תא ליד שברי גידול חסיד ייצר?...

Discussion

היסטוריה של במבחנה תרבויות Schwannoma

מאמצים להקים בתרבויות schwannoma מבחנה החלו רק כמה עשרות שנים אחרי נוירומה אקוסטית הראשונית כריתה כירורגית פתוחה התרחשה בשינה 1894 ^12. התרבויות המתועדות הראשונות היו על יד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components