人間の前庭神経鞘腫の初代培養

要約

前庭神経鞘腫（VSS）がNF2腫瘍抑制遺伝子における変異に関連するシュワン細胞（SC）由来の非悪性腫瘍である。私たちは、分子や細胞の実験操作および分析を可能にし、ヒトの疾患の不均一な性質を再現細胞培養VS初代ヒトのための再現可能な、効率的なプロトコルを報告します。

要約

前庭神経鞘腫（VSS）は、全ての頭蓋内新生物の10パーセントを損なう、前庭神経のシュワン細胞（SC）の腫瘍を表​​す。 VSSは、両方のNF2腫瘍抑制における不活性化の欠陥に関連する散発性または家族のどちらか（神経線維腫症2型、NF2）の形態で起こる 遺伝子。 、VSSの治療は、しかし、このような手順の罹患率は、低侵襲治療法の調査を推進してきました、一般的には外科的切除や放射線手術である。歴史的に、新鮮な組織試料へのアクセスの欠如、および神経鞘腫細胞は不死化されていないという事実は、有意に神経鞘腫の腫瘍形成の調査のための一次培養物の使用を妨げている。一次培養物の限られた供給を克服するために、不死化VS HEI193細胞株は、HPV E6およびE7癌遺伝子による形質導入により作製した。この発癌性形質導入は、人間のためのモデルとしてのそれらの使用を制限する細胞に重要な分子および表現型変化を導入chwannoma腫瘍。そこで我々は、細胞のVS初代ヒトの培養のための単純化され、再現性のあるプロトコルを示しています。この簡単に習得技術は、より正確に、VS疾患の複雑さを再現分子や細胞の研究が可能になります。

概要

前庭神経鞘腫（VSS）は、全ての頭蓋内新生物は^1-3の10％を犠牲にすること、前庭神経のシュワン細胞（SC）の腫瘍を表す。 VSSは、両方のNF2腫瘍抑制における不活性化の欠陥に関連する散発性または家族のどちらか（神経線維腫症2型、NF2）の形態で起こる 遺伝子。のVSの治療は、しかし、このような手順の罹患率は、難聴、顔面神経障害、脊髄液漏出、不均衡、および腫瘍の再増殖¹と、一般的に外科的切除または放射線手術である。さらに、すべての患者が許容できる外科的または放射線の候補ではない。このような重大な病的状態だけでなく、代替療法がないことは、新たな治療^の3,4の開発を期待してのVSのユニークな分子生物学の調査を推進してきました。

細胞培養は、潜在的な治療COMの分子や細胞の挙動やスクリーニング、迅速な容易、かつ詳細な分析が可能にポンド。歴史的に、新鮮な組織試料へのアクセスの欠如、および神経鞘腫細胞は不死化されていないという事実は、有意に神経鞘腫の腫瘍形成の調査のための一次培養物の使用を妨げている。一次培養物の限られた供給を克服するために、不死化VS HEI193細胞株は、HPV E6およびE7癌遺伝子⁵で形質導入によって生成した。この発癌性形質導入は、人間の神経鞘腫のモデルとしてそれらの使用を制限する細胞に重要な分子および表現型の変化を導入しました。官能NF2遺伝子を欠いているトランスジェニックマウス系統由来SC培養物は、 インビトロでNF2依存SC腫瘍形成を調査する別の代替を表す。これらの培養物は、しかし、人間の特定の動作のために、人間のVSSまたはアカウントの不均一な性質を再現することができない。ほとんどの前のVS培養技術は、比較的長い処理時間及び複雑な選択的な培養技術^6-8を必要と^した。ここでは、免疫染色によって決定された95％の腫瘍細胞の純度で、3時間の下に完全に処理した細胞培養VS原発のための簡単​​な、再現性のあるプロトコルを提示する。

プロトコル

倫理声明：このプロトコルでのヒト腫瘍標本の使用は、アイオワ大学施設内倫理委員会（IRB）により承認された。

1。セットアップ腫瘍収穫前日

1. コー​​ト細胞培養プレート：無菌培養フードにおいては、蓋を交換し、ポリスチレン/プラスチック培養ウェル/皿の底を覆うのに十分なポリ-L-オルニチン（0.01％溶液）を添加し、少なくとも室温で放置2時間。ガラススライドまたはカバースリップを画像化を必要とする実験のためのポリスチレンの代わりに用いることができる。
2. 2時間後、吸引しながらポリ-L-オルニチン溶液を除去し、プレートを無菌培養フードで完全に乾燥させます。十分なラミニン液追加（約²で10μg/ mlのを⁺ / Mg ^{2 +}を含まないHBSS [HBSS-/ - ]）は、完全に培養プレートをカバーするために、蓋を交換し、一晩冷却4℃の冷蔵庫で1）どちらかで、または2）少なくとも2時間、37℃のインキュベーター内に置く。もしプレート一晩以上保存され、蒸発/乾燥を防ぐためにプラスチックラップでプレートをラップ。

2。セットアップ腫瘍収穫の日

1. 準備文化メディア：メディアは、腫瘍の収穫と加工の日に新しく作られ、4℃で保存し、直前のメディアの追加/変更内容をインキュベーター内で37℃に加温する。
2. 神経鞘腫培養培地は、0.1 mg / mlのペニシリンおよび0.1 mg / mlのストレプトマイシン（フェノールレッドを含む）（4.5 mg / ml）をDMEM高グルコースであり; N2メディアは、最終希釈1:100を補足;ウシインスリン5μg/ mlの;ウシ胎児血清10％の全量。 0.22μmのフィルターを介してすべてのメディアをフィルタリングします。
3. 検体搬送クーラーを準備します。手術室に^{2 +（HBSS} + / +）のCa ^{2 +} / Mgを25ミリリットルのHBSS、滅菌50mlコニカルチューブ（収穫されるために、腫瘍の量に応じて）1-2氷いっぱいのクーラーを送信腫瘍サンプル移送や輸送のため。
4. 個人ラージヒルを準備しますidual腫瘍解離チューブ - 無菌2ミリリットルを氷上のHBSS + / +および場所の1ミリリットル丸底チューブを埋める。 （チューブ腫瘍サンプルの鋭い切開/解離のために使用される）。
5. 解離のために、採取した組織のあらゆる0.5センチメートル³約1解離のチューブを準備し;例えば、1.0×1.0×1.0センチメートル（1センチメートル^3）を測定する腫瘍標本は2 HBSS + / +解離チューブが必要になります。
6. 紫外線殺菌：場所組織はさみ、小さな鉗子、メスハンドル、1X通常のペトリ皿、P1000ピペット、および無菌培養フード内のピペットチップ、および前腫瘍組織の到着と処理に約15分間、紫外線下のまま。

3。試料の単離と交通

1. 外科的切除によって腫瘍検体を分離します。
2. すぐに患者から取り出した後、可能な限り迅速に氷冷HBSS + / +に腫瘍標本を配置。一度すべてTISSU電子サンプルは、さらなる処理のために実験室に作動劇場​​から、（氷上で）トランスポート·サンプルを収集する。

4。組織解離と粉砕して

1. 次の層流フード内の標準無菌、培養フードへの腫瘍検体とコニカルチューブを持参し、チューブおよび腫瘍50Xを反転させた試料を洗う。断片はチューブの底に落としておくことができ、その後、HBSS + / +を削除してください。 30ミリリットルのHBSS + / +を補充し、50Xが再び反転/攪拌する。 4Xの合計反転/メディアの削除を繰り返します。
2. 再懸 ​​濁30ミリリットルのHBSS + / +における腫瘍断片最後に、その後0.5センチメートル³グループにsterile100ミリメートルペトリ皿に混合物を注ぐと、独立した腫瘍。大きな腫瘍断片が発生した場合は、より小さな断片に切断するために、組織のはさみや小刀（＃11または＃15ブレード）を使用します。
3. 個々のHBSSが+ / +いっぱいに0.5センチメートル³組織グループを配置するために鉗子を使用し、2ミリリットルの丸底円錐すべての氷の上のAl管。 「スノーグローブ」の外観（ 図1）を有するべきでサブ1ミリメートル断片-懸濁液中に腫瘍断片をミンチするために組織のはさみを使用してください。フラグメントの大半はサブ1ミリメートルであるだけになるまで腫瘍をミンチ。腫瘍サンプルではありません 'オーバーミンチ」を行う。氷の上に戻って完全に組織細片チューブを配置し、すべての追加の試料管を繰り返します。
4. シングル15ミリリットルコニカルチューブにすべての断片化された腫瘍サンプルを転送します。カット/変更された無菌の先端とP1000ピペットは、このステップに適しています。 /必ず全ての腫瘍サンプルは15mlチューブに集めてきたように2ミリリットル解離管をすすぐフラッシュするために余分なHBSS + / +を使用してください。 5分間73×gで、23℃で遠心分離器で混合をスピンダウン。
5. 細胞ペレットを残し、HBSS + / +をオフに吸引する。 0.25％トリプシンとの1:1混合物中で再懸濁断片（HBSS-/に溶かし - ） - 0.2％コラゲナーゼタイトのsuに腫瘍断片を維持するためにちょうど十分な投稿spension。スクリュートップを交換し、そして30分間37℃のインキュベーター内の場所。懸濁液中の断片を保つために、インキュベーション中に少なくとも1回細胞混合物を攪拌する。このときにも、それを暖めるためにインキュベーターに神経鞘腫の培養培地を配置します。
6. インキュベーション後、23°C、5分間73×gでトリプシンを不活性化するために各チューブに100μlのFBSを追加し、遠心分離試料。ピペットを用いて、慎重に細胞ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清を吸引する。腫瘍断片を1mlがある場合に温めた2mlに加える、例えば培養培地（1:2腫瘍断片の最終比に腫瘍断片に温めた培養培地（N2/insulin/5％FBS）を追加メディア）。
7. 約1〜2の直径にP1000のピペットチップの外先端部を切断することにより、腫瘍のチュレーションの準備をします。あなたが簡単にunaltを通じてソリューションをピペットでできるようになるまで、ゆっくりと、徐々に小さくしてより小さな直径のピペットチップを使用して、細胞懸濁液を粉砕するエーP1000ピペットチップ。上のサンプルを粉砕するはありません - あなたは簡単にチップを通して腫瘍ソリューションをピペットでできるようになると、すぐに小さく、先端に移動します。コニカルチューブの底にピペットチップをタップチュレーション時の組織ブロック吸引の単一のより大きな部分は、多くの場合、継続的なチュレーションすることができます。

5。細胞播種

1. 組織の一つ0.5ミリメートル³断片を1×100 mmディッシュ、または4×8-well/4-wellスライドをシードするのに十分です。直前のメディア/細胞混合物を追加するには、培養プレートからラミニン液を除去するが、プレートを乾燥させないでください。
2. 各100mmの皿のために10mlの温めた培養培地中の腫瘍断片を溶解する。
3. 4ウェルスライドの各ウェルについて、750μL温めた培養培地（全体スライドの3ミリリットル）を使用します。
4. 8ウェルスライドの各ウェルについて、400μlの温めた培養培地（全体スライドの3.2ミリリットル）を使用します。
5. 37＆で文化をインキュベート＃160;°C、湿度100％、6％CO _2。少なくとも36時間一人での文化のままにして、解決策は（酸性）黄ばんであれば、メディアを変更してください。そうしないと、その後2〜3日ごとに、またはメディアが酸性になると、72時間後にメディアを変更。メディアは連続で数日間毎日酸性になる場合、これは一般に、潜在的な細菌または酵母汚染の指標である。

結果

正しい腫瘍の断片化は、組織培養皿で播種し、最適な成長（ 図1）に必須である。めっき後の最初の日の間に神経鞘腫細胞の同定は、細胞残屑および赤血球の量を不明瞭に、しばしば困難である。 4 ^回目か5 ^日目では、付着性の腫瘍断片近いセルの拡張機能は、残骸の中からパターンを「レーシング」に認識が作成されます。その後のメディアの変更は、一般的に...

ディスカッション

in vitroでの神経鞘腫の文化の歴史

体外神経鞘腫培養で確立するための努力は、最初の聴神経腫のオープン外科的切除は1894 ¹²に発生したわずか数十年後に始まった。最初に記録文化が1920年代にKredelであったが、失敗した「ハンギングドロップ法^」12に刻まれた腫瘍を成長しようとした人。その後、博士。マレーとスタウト...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components