Cultura primária de Vestibular Humano Schwanomas

Resumo

Schwannomas vestibulares (VSS) são tumores não-malignos de células de Schwann (SC), origem associados com mutações no gene supressor de tumores de NF2. Apresentamos um protocolo reprodutível e eficiente para humano primário VS cultura celular que permite a manipulação experimental celular e molecular e análise e recapitula a heterogeneidade da doença humana.

Resumo

Schwannomas vestibulares (VSS) representam Schwann célula (SC) tumores do nervo vestibular, comprometendo 10% de todas as neoplasias intracranianas. VSes ocorrer na neurofibromatose tipo 2 (NF2), formas ou esporádica ou familiar, tanto associados inativando defeitos no supressor de tumor NF2 gene. Tratamento para VSS é geralmente a ressecção cirúrgica ou radiocirurgia, porém a morbidade desses procedimentos tem conduzido investigações sobre tratamentos menos invasivos. Historicamente, a falta de acesso a amostras de tecido fresco e ao fato de que as células schwannoma não são imortalizadas têm dificultado significativamente o uso de culturas primárias para a investigação de schwannoma tumorigênese. Para superar o fornecimento restrito de culturas primárias, a linha celular imortalizada HEI193 VS foi gerado através de transdução com o HPV E6 e E7 de oncogenes. Este transdução oncogénica introduzido alterações moleculares e fenotípicas significativas para as células, o que limita a sua utilização como um modelo para es humanostumores chwannoma. Nós, portanto, ilustrar um protocolo simplificado, reprodutível para a cultura do ser humano primário VS células. Esta técnica permite facilmente dominado investigações moleculares e celulares que recapitulam com mais precisão a complexidade da doença VS.

Introdução

Schwannomas vestibulares (VSS) representam Schwann célula (SC) tumores do nervo vestibular, comprometendo 10% de todas as neoplasias intracranianas ^1-3. VSes ocorrer na neurofibromatose tipo 2 (NF2), formas ou esporádica ou familiar, tanto associados inativando defeitos no supressor de tumor NF2 gene. Tratamento para VSS é geralmente a ressecção cirúrgica ou radiocirurgia, no entanto, a morbidade de tais procedimentos incluem surdez, neuropatias faciais, vazamento de fluido espinhal, desequilíbrio, e rebrota tumor ^1. Além disso nem todos os pacientes são aceitáveis ​​candidatos à cirurgia ou radioterapia. Tal morbidade significativa, bem como a falta de terapias alternativas tem impulsionado a investigação sobre a biologia molecular única de VSes na esperança de desenvolver novos tratamentos ^3,4.

Cultura celular permite a análise rápida, fácil, e em profundidade do comportamento molecular e celular e de triagem do potencial terapêutico comlibras. Historicamente, a falta de acesso a amostras de tecido fresco e ao fato de que as células schwannoma não são imortalizadas têm dificultado significativamente o uso de culturas primárias para a investigação de schwannoma tumorigênese. Para superar o fornecimento restrito de culturas primárias, a linha celular imortalizada HEI193 VS foi gerado através de transdução com o HPV E6 e E7 oncogenes ^5. Este transdução oncogénica introduzido alterações moleculares e fenotípicas significativas para as células, o que limita a sua utilização como um modelo para tumores schwannoma humanos. Culturas SC derivados de linhas de camundongos transgênicos que não possuem um gene NF2 funcional representam uma outra alternativa para investigar tumorigenesis SC NF2-dependente in vitro. Estas culturas no entanto deixar de recapitular a heterogeneidade dos VSes humano ou conta para o comportamento específico humano. A maioria das técnicas anteriores de cultura VS necessário tempos de processamento relativamente longas e complicadas técnicas de cultura seletivos ^6-8.Aqui apresentamos um protocolo simples e reprodutível para a primária VS cultura de células com processamento completo em menos de 3 horas, com 95% de pureza das células tumorais, como determinado por imunocoloração.

Protocolo

Declaração de Ética: Uso dos espécimes tumorais humanas neste protocolo foi aprovado pela Universidade de Iowa Institutional Review Board (IRB).

1. Setup no dia anterior Tumor Colheita

1. Placas de cultura de células: casaco Num capuz de cultura estéril, adicionar suficiente poli-L-ornitina (solução a 0,01%) para cobrir o fundo de uma cultura de poliestireno / poço de plástico / prato, substituir as tampas, e deixar repousar à temperatura ambiente durante pelo menos 2 hr. Lâminas de vidro ou de lamelas pode ser substituído por poliestireno para experiências que requerem imagiologia.
2. Após 2 horas, remove-L-ornitina poli solução por sucção e permitir que as placas a secar completamente em um estéreis capuzes cultura. Adicionar solução de laminina suficiente (10 ug / ml, em Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} livre HBSS [HBSS-/ -]) para cobrir completamente as placas de cultura, substituir as tampas, em seguida, ou 1) em lugar frio a 4 ° C frigorífico durante a noite, ou 2) colocar em 37 ° C incubadora durante pelo menos 2 horas. Se as placasserão armazenadas durante a noite ou mais, envolver as placas em filme plástico para evitar a evaporação / dessecação.

2. Configuração do Dia da Colheita Tumor

1. Prepare Meios de Cultura: Meios é feita fresca no dia da colheita e processamento do tumor, armazenado a 4 ° C, e aqueceu-se a 37 ° C na incubadora imediatamente antes da mídia adições / modificações.
2. Meios de cultura de Schwannoma é de alta glucose (4,5 mg / ml) DMEM (com vermelho de fenol) com 0,1 mg / ml de penicilina e 0,1 mg / ml de estreptomicina; Mídia N2 complementar diluição final de 1:100; A insulina bovina de 5 ug / ml; Soro fetal bovino a 10% volume total. Filtre todos os meios de comunicação através do filtro de 0,22 mM.
3. Prepare Specimen Transport Refrigerador: Enviar um cheios de gelo refrigerador com 1-2 (dependendo da quantidade de tumor a ser colhida) estéreis de 50 ml tubos cônicos com 25 ml de HBSS com Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} (HBSS + / +) para a sala de cirurgia para a transferência de amostra de tumor e de transporte.
4. Prepare indivtubos de dissociação tumor idual - preencher estéreis 2 ml tubos redondos de fundo com 1 ml de HBSS + / + e colocar no gelo. (Os tubos serão utilizados para dissecção cortante / dissociação de amostras tumorais).
5. Para dissociação, prepare aproximadamente um tubo de dissociação para cada 0,5 cm ³ de tecido colhido; por exemplo, uma amostra do tumor medindo 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 ^cm3) vai exigir dois tubos HBSS + / + de dissociação.
6. Esterilização luz ultravioleta: tesoura Local de tecido, pequenas pinças, cabo de bisturi, 1x prato normal de Petri, P1000 pipeta e pontas de pipeta em uma capa de cultura estéril, e deixar sob a luz ultravioleta para ~ 15 min antes da chegada e processamento de tecido do tumor.

3. Espécime Isolamento e Transporte

1. Isolar amostras de tumor por ressecção cirúrgica.
2. Colocar imediatamente as amostras de tumor para o HBSS + / + gelada, tão rapidamente quanto possível após a retirada do paciente. Uma vez que todos tissue as amostras são coletadas, as amostras de transporte (no gelo) do teatro operatório para o laboratório para processamento posterior.

4. Dissociação de tecidos e trituração

1. Seguindo uma técnica estéril padrão numa câmara de fluxo laminar, trazer tubo cónico com a amostra de tumor no capuz de cultura, e lava-se as amostras por inversão do tubo e do tumor de 50x. Permitir que os fragmentos a cair para o fundo do tubo, e, em seguida, remover HBSS + / +. Recarga com 30 ml HBSS + / +, e agite / inverter 50x novamente. Repita remoção inversão / media para um total de 4x.
2. Re-suspender fragmentos do tumor em 30 ml HBSS + / +, pela última vez, em seguida, despeje a mistura em uma placa de Petri sterile100 mm, e tumor separar em 0,5 centímetros ³ agrupamentos. Se fragmentos de tumores maiores são encontradas, usar a tesoura de tecido ou bisturi (# 11 ou # 15 lâminas) para cortar em pedaços menores.
3. Use a pinça para colocar os 0,5 centímetros ³ grupos de tecido para o indivíduo HBSS + / + cheia, 2 ml de fundo redondo cônicatubos ai, tudo no gelo. Use as tesouras de tecidos para triturar os fragmentos tumorais em sub-fragmentos de um milímetro-a suspensão deve ter uma aparência 'snowglobe' (Figura 1). Picar o tumor apenas até que a maioria dos fragmentos são sub-1 mm; não 'sobre-mince' as amostras tumorais. Coloque o tubo de tecido completamente picada de volta no gelo, e repita com todos os tubos de amostras adicionais.
4. Transfira todas as amostras tumorais fragmentadas em um único tubo cônico de 15 ml. A pipeta P1000 com um corte / modificados ponta estéril funciona bem para essa etapa. Use adicional HBSS + / + para lavar / enxaguar os 2 tubos ml de dissociação para garantir que todos amostra de tumor foi coletado em tubo de 15 ml. Girar mistura em centrífuga a 23 ° C, a 73 g durante 5 min.
5. Sucção fora HBSS + / +, deixando o sedimento celular. Re-suspender fragmentos em 1:1 mistura de 0,25% de tripsina: 0,2% de colagenase (dissolvido em HBSS-/ -) - adicionar apenas o suficiente para manter fragmentos do tumor em apertada suspension. Substitua o parafuso-top, e coloque em 37 ° C incubadora por 30 min. Agitar a mistura de células de pelo menos uma vez durante a incubação de manter fragmentos em suspensão. Coloque o meio de cultura Schwannoma na incubadora para aquecê-la neste momento também.
6. Após a incubação, adicionar 100 mL de FBS a cada tubo para inactivar a tripsina, e depois centrifugar a amostra a 23 ° C, 73 g durante 5 min. Com uma pipeta, cuidadosamente sucção fora tanto quanto possível sobrenadante sem perturbar pellet celular. Adicionar o meio de cultura aquecido (N2/insulin/5% de FBS) aos fragmentos de tumor a uma razão final de 01:02 tumor: meio de cultura (por exemplo, se houver um ml de fragmentos tumorais, adicionar 2 ml de aqueceu mídia).
7. Preparar para a trituração do tumor, cortando a ponta fora da ponta de uma pipeta P1000 com um diâmetro de cerca de 1-2 mm. Lentamente triturar a suspensão de células usando dicas progressivamente menores e menores de pipeta de diâmetro, até que você possa facilmente pipetar a solução através de um unaltponteira ered P1000. Mover-se imediatamente a uma ponta menor, uma vez que pode facilmente pipetar a solução tumor através da ponta - não mais de triturar a amostra. Se um único pedaço maior de blocos de tecido de aspiração durante a trituração, tocando a ponta da pipeta na parte inferior do tubo cónico permite frequentemente a trituração contínua.

5. Celular chapeamento

1. Ona 0,5 mm ³ fragmento de tecido é suficiente para semear um prato de 100 mm x, ou 4 x lâminas 8-well/4-well. Pouco antes de adicionar a mistura media / celular, remova a solução laminina das placas de cultura, mas não deixe as placas seco.
2. Para cada placa de 100 mm, dissolve-se o fragmento de tumor em 10 ml de meio de cultura aquecido.
3. Para cada poço de uma 4-bem corrediça, utilizar 750 ul do meio de cultura aquecido (3 ml para toda a lâmina).
4. Para cada poço de um de 8 poços corrediça, utilizar 400 ul do meio de cultura aquecido (3,2 ml de toda a lâmina).
5. Incubar as culturas a 37 &# 160; ° C, 100% de humidade, 6% de CO _2. Deixe as culturas sozinho por pelo menos 36 horas, e, em seguida, alterar a mídia, se a solução é amarelado (ácido). Caso contrário, alterar a mídia em 72 horas, em seguida, a cada 2-3 dias ou quando os meios de comunicação tornam-se ácida. Se a mídia se torna ácido diariamente durante vários dias seguidos, isso é geralmente uma indicação do potencial de contaminação por bactérias ou fungos.

Resultados

Fragmentação tumor correcta é essencial para a propagação óptima e excrescência em pratos de cultura de tecidos (Figura 1). Identificação de células de schwannoma, durante os primeiros dias após o revestimento é muitas vezes difícil, devido ao obscurecimento quantidades de detritos celulares e as células vermelhas do sangue. Até o 4 ^º ou 5 ^º dia, extensões celulares perto de fragmentos tumorais aderentes criará reconhecível 'laçar' padrões entre os esc...

Discussão

História das culturas in vitro Schwannoma

Esforços para estabelecer em culturas in vitro schwannoma começou apenas algumas décadas após o neuroma acústico inicial ressecção cirúrgica aberta ocorreu em 1894 ^12. As primeiras culturas foram gravadas por Kredel na década de 1920, que tentou em vão crescer tumor picada pelo "método da gota pendurado" ¹² . Mais tarde, os drs. Murray e Stout publicou sua experi?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components