İnsan Vestibüler Schwannomalar İlköğretim Kültürü

Özet

Vestibüler Schwannomalar (VSS) TNF2 tümör baskılayıcı gen mutasyonu ile ilişkili Schwann hücre (SC) kökenli olmayan habis tümörler vardır. Biz, moleküler ve hücresel deneysel manipülasyon ve analiz için izin verir ve insan hastalığının heterojen doğası tekrarıdır hücre kültürü VS birincil insan için yeniden üretilebilir ve etkili protokolü sunulmaktadır.

Özet

Vestibüler schwannomalar (VSS) tüm intrakraniyal tümörlerin% 10 taviz, Schwann hücresi vestibüler sinirin (SC) tümörler temsil eder. Vss hem TNF2 tümör baskılayıcı olarak inaktive kusurları ile ilişkili sporadik veya ailesel ya (Nörofibromatozis tip 2, NF2) formlar, meydana Gen. VSS tedavisi ancak bu tür prosedürlerin morbidite daha az invaziv tedaviler soruşturmaları tahrik olan, genellikle cerrahi rezeksiyon veya radyocerrahi olduğunu. Tarihsel olarak, taze doku örneklerinin erişim ve schwannoma hücreler immortalize değildir gerçeğinin olmaması önemli schwannoma Tümörgenez araştırılması için primer kültürlerinde kullanımını engellemiştir. Primer kültürlerin sınırlı kaynağı üstesinden gelmek için, ölümsüz kılınmış hücre kuşağı HEI193 VS HPV E6 ve E7 onkogenler ile transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu onkojenik transdüksiyon insan s için bir model olarak, kullanımlarını sınırlayan hücrelere, önemli moleküler ve fenotipik değişiklikler ortayachwannoma tümörler. Bu nedenle hücreler VS primer insan kültürü için basitleştirilmiş, tekrarlanabilir bir protokol göstermektedir. Bu kolayca hakim teknik daha doğru VS hastalığın karmaşıklığı özetlemek moleküler ve hücresel incelemeler için izin verir.

Giriş

Vestibüler schwannomalar (VSS) tüm intrakraniyal tümörlerin ^1-3 10% ödün, Schwann hücresi vestibüler sinirin (SC) tümörler temsil eder. Vss hem TNF2 tümör baskılayıcı olarak inaktive kusurları ile ilişkili sporadik veya ailesel ya (Nörofibromatozis tip 2, NF2) formlar, meydana Gen. VSS tedavisi ancak bu tür prosedürlerin morbidite sağırlık, yüz nöropatlien omurilik sıvısı kaçağı, dengesizlik, ve tümör büyütme ¹ içerir, genellikle cerrahi rezeksiyon veya radyocerrahi olduğunu. Buna ek olarak her hasta olarak kabul edilebilir bir cerrahi veya radyasyon adaylardır. Alternatif tedaviler gibi önemli morbidite yanı sıra bir eksikliği yeni tedaviler ^3,4, gelişmekte umuduyla VSS eşsiz moleküler biyoloji soruşturma tahrik vardır.

Hücre kültürü potansiyel tedavi com moleküler ve hücresel davranış ve tarama, hızlı kolay ve derinlemesine analiz sağlarlira. Tarihsel olarak, taze doku örneklerinin erişim ve schwannoma hücreler immortalize değildir gerçeğinin olmaması önemli schwannoma Tümörgenez araştırılması için primer kültürlerinde kullanımını engellemiştir. Primer kültürlerin sınırlı kaynağı üstesinden gelmek için, ölümsüz kılınmış hücre kuşağı HEI193 VS HPV E6 ve E7 onkogenler ⁵ ile transdüksiyonu ile üretilmiştir. Bu onkojenik transdüksiyon schwannoma, insan tümörleri için bir model olarak, kullanımlarını sınırlayan hücrelere, önemli moleküler ve fenotipik değişiklikler getirmiştir. Fonksiyonel NF2 geni eksik transgenik fare hatları türetilen SC in vitro kültürler NF2 bağımlı SC tümörogenez araştırmak için başka bir alternatif oluşturmaktadır. Bu kültürler, ancak insan belirli bir davranış insan VSS veya hesabın heterojen doğasını özetlemek için başarısız. Çoğu önceki VS kültür teknikleri nispeten uzun işlem süreleri ve karmaşık seçici kültür teknikleri ^6-8 gereklidir.Immun boyama ile saptandığı haliyle Burada% 95 tümör hücresi saflıkta altında, 3 saat içinde tam bir işlem ile hücre kültürü VS primer için basit ve tekrarlanabilir bir protokol, mevcut.

Protokol

Etik Açıklama: Bu protokolde insan tümör örneklerinin kullanılması Iowa Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi (KİK) tarafından onaylanmıştır.

1.. Kur Gün önce Tümör Hasat

1. Coat Hücre Kültürü Plakaları: bir steril kültür başlık olarak, kapak yerine, bir polistiren / plastik kültür kuyu / çanak alt karşılamak için yeterli poli-L-ornitin (% 0.01 solüsyon) ekleyin ve en azından oda sıcaklığında bekletin 2 hr. Cam slaytlar, lameller veya görüntüleme gerektiren deneyler için polistiren için ikame edilebilir.
2. 2 saat sonra, emme ile poli-L-ornitin çözeltisi çıkarın ve plakaları bir steril kültür davlumbaz tamamen kurumaya bırakın. Kadar laminin solüsyonu (Ca ² 10 ug / ml ⁺ / ^{Mg2 +} içermeyen HBSS [HBSS-/ -]) tamamen kültür plakaları kaplamak için, kapak yerine, daha sonra gece boyunca 4 ° C soğuk buzdolabı içinde 1) yeri, ya ya da 2), en az 2 saat boyunca 37 ° C inkübatör yerleştirin. Eğer plakalargecede veya daha uzun saklanır, buharlaşma / kuruma önlemek için plastik wrap plakaları sarın.

2.. Kurulum Tümör Hasat Günü

1. Hazırlama Kültür Ortamı: Ortam, tümör hasat ve işleme gününde taze yapılmış 4 ° C'de saklanır ve hemen önce ortam ilave ve / değişir inkübatörde 37 ° C'ye kadar ısıtılır.
2. Schwannom kültür ortamı 0,1 mg / ml penisilin ve 0.1 mg / ml streptomisin ile yüksek glikoz (4.5 mg / ml) (fenol kırmızısı ile) DMEM olduğu; N2 ortamı son seyreltme 1:100 takviyesi; Bovine İnsülin 5 ug / ml; % 10 toplam hacme Fetal Sığır Serumu. 0.22 mikron filtre ile tüm medya filtre.
3. Örnek Transport Soğutucu hazırlayın: ameliyathaneye ^{2 +} (HBSS + / +) ^{2 +} Ca / Mg ile birlikte 25 ml HBSS ile steril 50 ml konik tüp (hasat edilmesi, tümörün miktarına bağlı olarak) 1-2, bir buz dolu bir soğutucu gönder tümör numune transferi ve ulaşım için.
4. Indiv hazırlayınidual tümör ayrışma tüpleri - 1 HBSS'nin + / + ml ve buz üzerinde yer ile yuvarlak steril 2 ml alt tüpler doldurun. (Tüpler tümör örneklerinin keskin diseksiyon / ayrışması için kullanılan edilecektir).
5. Ayrışma için, hasat edilen doku, her 0.5 cm ³ için yaklaşık bir ayrılma tüpü hazırlanması; örneğin, 1.0 x 1.0 x 1.0 cm (1 ^cm3) ölçen bir tümör numunesi iki HBSS + / + ayrılma tüpler gerektirecektir.
6. Ultraviyole ışık sterilizasyon: Yer doku makas, küçük forseps, neşter sapı, 1x normal bir Petri kabı, P1000 pipet ve steril bir kültürü kaputu pipet uçları, ve ~ için ultraviyole ışık altında bırakmak öncesinde tümör dokusunun geliş ve işleme 15 dk.

3.. Numune İzolasyon ve Ulaşım

1. Cerrahi rezeksiyon ile tümör örnekleri izole.
2. Hemen hastadan çıkarıldıktan sonra mümkün olan en kısa sürede, buzla soğutulmuş HBSS + / + içine tümör örnekleri yerleştirin. Bir kez tüm tissue örnekleri daha fazla işlem için laboratuara ameliyat tiyatro, (buz üzerinde) taşıma örnekleri toplanır.

4.. Doku Ayrılma ve triturasyon

1. Laminer akış kaputu standart, steril tekniği izleyerek, kültürü kaputu içine tümör örneği ile konik tüp getirmek ve tüp ve tümör 50x evirerek örnekleri yıkayın. Fragmanları, tüpün altına düşer ve daha sonra HBSS + / + çıkarmak için izin verin. 30 ml HBSS + / + ile doldurun ve ajitasyon / tekrar 50x ters. 4x toplam inversiyon / medya kaldırma tekrarlayın.
2. 30 ml HBSS + / + son kez, sonra bir sterile100 mm petri içine karışımı dökün, ve ayrı tümör 0,5 cm içine ³ gruplar içinde tümör fragmanları askıya yeniden. Büyük tümör fragmanları karşılaşılan, küçük parçalar halinde kesmek için makas veya neşter doku (# 11 veya # 15 bıçak) kullanın.
3. Bireysel HBSS + / + dolu içine 0.5 cm ³ doku grupları yerleştirmek için forseps kullanın, 2 ml'lik yuvarlak dipli konikTüm buz üzerinde arkadaşları borular. A 'snowglobe' görünümü (Şekil 1) sahip olmalıdır alt 1 mm fragmanları-süspansiyona tümör parçaları kıyma doku makas kullanın. Parçalarının çoğunluğu alt 1 mm kadar sadece tümör kıyma; değil 'over-kıyma' tümör örnekleri yapın. Geri buz tamamen kıyılmış doku tüpü yerleştirin ve tüm ek numune tüpleri ile tekrarlayın.
4. Tek bir 15 ml konik tüp içine tüm parçalanmış tümör örnekleri aktarın. Bir kesim / modifiye steril ucu ile bir P1000 pipet, bu adım için iyi çalışır. Kullanın ekstra HBSS + / + emin tüm tümör numune 15 ml tüp içinde tahsil edilmiştir yapmak için 2 ml ayrışma tüpler durulama / temizlemek için. 5 dakika boyunca 73 x g, 23 ° C 'de santrifüj içinde bir karışımı aşağıya doğru dönerler.
5. Hücre topaklarını bırakarak HBSS + / + kapalı emme. % 0.25 tripsin 1:1 karışımı içinde fragmanları yeniden askıya (HBSS-/ içinde çözülmüş -) -% 0.2 'lik kolajenaz tümör parçalarını tutmak için yeterince sıkı eklemek SUspension. 30 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde vidalı üst ve bir yer değiştirme. Süspansiyon parçaları korumak için inkübasyon sırasında en az bir kez hücre karışımı çalkalayın. De bu anda ısınmak için kuvöz içine Schwannom kültür ortamı yerleştirin.
6. İnkübasyondan sonra, 23 ° C, 5 dakika için 73 x g tripsin etkisiz hale getirmek için her bir tüpe 100 ul FBS ekleme ve daha sonra santrifüj örnek. Bir pipet kullanarak, dikkatli bir hücre pelet bozmadan mümkün olduğunca süpernatant aspire. 01:02 tümör parçalarının nihai oranı tümör fragmanları için ısıtıldı kültür ortamı (N2/insulin/5% FBS) ekleyin kültür ortamı (örneğin tümör parçalarının 1 mi var ise, ısıtılmış ve 2 ml ekle medya).
7. Yaklaşık 1-2 mm'lik bir çapa bir P1000 pipet ucu kapalı ucu kesilerek tümör toz haline getirme için hazırlayın. Kolayca bir unalt yoluyla çözüm pipetle kadar yavaş yavaş, giderek daha küçük ve daha küçük çaplı pipet ipuçlarını kullanarak hücre süspansiyonu çiğnemekniyor P1000 pipet. Kolayca ucundan tümör çözüm pipetle bir kez hemen küçük bir ucuna hareket - over örnek çiğnemek yok. Konik tüpün alt pipet çekme toz haline getirme sırasında doku blokları aspirasyon daha büyük tek bir parça, genellikle sürekli ince toz haline koyma izin veriyorsa.

5.. Hücre Kaplama

1. Doku biri 0.5 mm ³ parçası 1 x 100 mm tabak veya 4 x 8-well/4-well slaytlar tohum için yeterlidir. Hemen önce medya / hücre karışımı ekleyerek, kültür plakaları laminin çözüm kaldırmak ancak plakaları kuru izin vermeyin.
2. Her 100 mm tabak için 10 mi ısıtıldı kültür ortamı olarak tümör parçası çözülür.
3. 4-iyi bir slayt her bir kuyu için 750 ul ısıttı kültür ortamı (tüm slayt için 3 ml) kullanın.
4. 8-iyi slayt her bir kuyu için 400 ul ısıttı kültür ortamı (tüm slayt için 3.2 ml) kullanın.
5. 37 ve en kültürleri inkübe# 160; ° C,% 100 nem,% 6 _CO2. En az 36 saat süre ile, tek başına kültürleri bırakın ve daha sonra solüsyon (asidik) sararmış ise ortamı değiştirmek. Aksi takdirde daha sonra her 2-3 gün veya ortam asidik olunca, 72. saatte ortamı değiştirmek. Ortam üst üste birkaç gün boyunca günlük olarak asidik hale gelmesi durumunda, bu genellikle potansiyel bakteri ya da maya kontaminasyon bir göstergesidir.

Sonuçlar

Doğru tümör parçalanması doku kültür tabaklarında uygun tohumlama ve oluşumun (Şekil 1) için gereklidir. Kaplama sonraki ilk günlerinde schwannoma hücrelerin tanımlanması nedeniyle hücre döküntüleri ve kırmızı kan hücrelerinin miktarda örtücü için, çoğu zaman zordur. 4 veya 5 ^{inci inci} gün, yapışık tümör parçalarının yakınında hücresi uzantıları enkaz arasında desenleri 'bağlama' tanınabilir yaratacaktır. Daha sonraki ortam değişikliği...

Tartışmalar

In vitro Schwannom Kültürleri Tarihi

Vitro schwanom kültürlerde kurmak için çabalar açık cerrahi rezeksiyon 1894 ¹² yılında meydana gelen ilk akustik nöroma sonra sadece bir kaç yıl başladı. İlk kaydedilen kültürleri başarısız "asılı damla yöntemiyle" ¹² ile kıyılmış tümör büyümeye çalışmış 1920'lerde Kredel tarafından vardı . Daha sonra, Dr. Murray ve Stout pıhtılaşmış...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components