Cultura primario di Human vestibolare Schwannomi

Riepilogo

Vestibolare Schwannomi (VSS) sono tumori non maligni della cella (SC) di origine Schwann, associati a mutazioni del NF2 gene soppressore del tumore. Riportiamo un protocollo efficace e riproducibile per uso umano primario VS coltura cellulare che permette di manipolazione sperimentale molecolare e cellulare e di analisi e ricapitola la natura eterogenea delle malattie umane.

Abstract

Schwannoma vestibolare (VSS) rappresentano cellule di Schwann (SC) i tumori del nervo vestibolare, compromettendo il 10% di tutte le neoplasie intracraniche. Vss verifica in (neurofibromatosi di tipo 2, NF2) forma sporadica o familiare, entrambe associate a difetti inattivazione nel tumore soppressore NF2 gene. Il trattamento per VSS è generalmente la resezione chirurgica o la radiochirurgia, ma la morbosità di tali procedure ha spinto indagini trattamenti meno invasivi. Storicamente, la mancanza di accesso ai campioni di tessuto fresco e il fatto che le cellule schwannoma non sono immortalati hanno ostacolato in modo significativo l'uso di colture primarie per le indagini di schwannoma tumorigenesi. Per superare la limitata offerta di colture primarie, la linea cellulare HEI193 VS immortalata è stato generato da trasduzione con HPV oncogeni E6 ed E7. Questo trasduzione oncogenica introdotto significative alterazioni molecolari e fenotipici alle cellule, che limitano il loro uso come modello per s umanitumori chwannoma. Abbiamo quindi illustrare un protocollo riproducibile semplificata per cultura umana primaria VS cellule. Questa tecnica permette facilmente masterizzato per indagini molecolari e cellulari che ricapitolano più accuratamente la complessità della malattia VS.

Introduzione

Schwannoma vestibolare (VSS) rappresentano cellule di Schwann (SC) i tumori del nervo vestibolare, compromettendo il 10% di tutte le neoplasie intracraniche ^1-3. Vss verifica in (neurofibromatosi di tipo 2, NF2) forma sporadica o familiare, entrambe associate a difetti inattivazione nel tumore soppressore NF2 gene. Il trattamento per VSS è generalmente la resezione chirurgica o la radiochirurgia, ma la morbosità di tali procedure comprende sordità, neuropatie del viso, perdita di liquido spinale, squilibrio, e la ricrescita del tumore ^1. Inoltre, non tutti i pazienti sono candidati per la chirurgia o radiazioni accettabili. Tale significativa morbilità, nonché una mancanza di terapie alternative ha spinto indagine sulla biologia molecolare unico di VSS nella speranza di sviluppare nuovi trattamenti ^3,4.

Coltura cellulare permette una rapida, facile, e approfondita analisi del comportamento molecolare e cellulare e lo screening del potenziale terapeutico comsterline. Storicamente, la mancanza di accesso ai campioni di tessuto fresco e il fatto che le cellule schwannoma non sono immortalati hanno ostacolato in modo significativo l'uso di colture primarie per le indagini di schwannoma tumorigenesi. Per superare la limitata offerta di colture primarie, la linea cellulare HEI193 VS immortalata è stato generato da trasduzione con HPV oncogeni E6 ed E7 ^5. Questo trasduzione oncogenica introdotto significative alterazioni molecolari e fenotipici alle cellule, che ne limitano l'uso come modello per i tumori schwannoma umani. Culture SC derivate da linee di topi transgenici che mancano di un gene NF2 funzionale rappresentano un'altra alternativa per indagare NF2-dipendente tumorigenesi SC in vitro. Queste culture però non riescono a riepilogare la natura eterogenea del Vss umano o di un conto per il comportamento umano specifico. La maggior parte delle precedenti tecniche di coltura VS richiesti tempi relativamente lunghi di lavorazione e complicate tecniche di coltura selettivi ^6-8.Qui vi presentiamo un protocollo semplice e riproducibile per primario VS coltura cellulare con l'elaborazione completa in meno di 3 ore, con il 95% di purezza delle cellule tumorali come determinato da immunoistochimica.

Protocollo

Dichiarazione Etica: uso dei campioni tumorali umani in questo protocollo è stato approvato dalla University of Iowa Institutional Review Board (IRB).

1. Setup giorno prima Tumore Harvest

1. Cappotto cellulari piastre di coltura: in una cappa sterile cultura, aggiungere abbastanza poli-L-ornitina (soluzione 0,01%) per coprire il fondo di una cultura polistirolo / plastica e / piatto, sostituire i coperchi, e lasciate riposare a temperatura ambiente per almeno 2 hr. Vetrini e vetrini possono essere sostituiti per polistirene per esperimenti che richiedono l'imaging.
2. Dopo 2 ore, rimuovere la soluzione di poli-L-ornitina mediante aspirazione e permettono le piastre asciugare completamente in un sterili cappe cultura. Aggiungere la soluzione laminina abbastanza (10 mg / ml di Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} senza HBSS [HBSS-/ -]) per coprire completamente le piastre di coltura, sostituire le palpebre, poi o 1) posto in un luogo fresco 4 ° C frigorifero per una notte, o 2) inserire nel 37 ° C incubatore per almeno 2 ore. Se le piastresaranno memorizzati notte o più, avvolgere le piastre in involucro di plastica per evitare l'evaporazione / essiccazione.

2. Impostazione del Giorno del Tumore Harvest

1. Preparare Culture Media: media è fatta fresca del giorno di raccolta e di trasformazione tumorale, conservato a 4 ° C, e riscaldato a 37 ° C in incubatore immediatamente prima ai media aggiunte / modifiche.
2. Cultura schwannoma media è alta glucosio (4,5 mg / ml) DMEM (con rosso fenolo) con 0,1 mg / ml di penicillina e 0,1 mg / ml streptomicina; Mezzi N2 integrano diluizione finale 1:100; Insulina Bovini 5 mg / ml; Siero fetale bovino al 10% del volume totale. Filtrare tutti i media attraverso il filtro di 0,22 micron.
3. Preparare campioni Trasporti di raffreddamento: Manda un dispositivo di raffreddamento del ghiaccio pieno di 1-2 (a seconda della quantità di tumore per essere raccolto) 50 ml provette coniche sterili con 25 ml di HBSS con Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} (HBSS + / +) per sala operatoria per il trasferimento del campione tumorale e trasporto.
4. Preparare indivtubi tumore dissociazione idual - riempiono sterile 2 ml tondi tubi inferiori di 1 ml di HBSS + / + e posto sul ghiaccio. (Tubi sarà utilizzato per sharp dissezione / dissociazione di campioni tumorali).
5. Per dissociazione, preparare circa un tubo di dissociazione per ogni 0,5 cm ³ di tessuto raccolto; per esempio, un campione di tumore che misurano 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm ³⁾ richiederà due tubi + / + dissociazione HBSS.
6. La luce ultravioletta sterilizzazione: forbici Luogo di tessuto, piccole pinze, bisturi manico, 1x piatto normale Petri, P1000 pipette e puntali per pipette in una cappa sterile cultura, e lasciare sotto la luce ultravioletta per ~ 15 minuti prima dell'arrivo e la trasformazione del tessuto tumorale.

3. Isolamento dei campioni e dei Trasporti

1. Isolare campioni tumorali con la resezione chirurgica.
2. Porre immediatamente campioni tumorali nel HBSS ghiacciata + / + il più rapidamente possibile dopo la rimozione dal paziente. Una volta che tutti Tissue campioni vengono prelevati, i campioni di trasporto (su ghiaccio), dal teatro operativo al laboratorio per ulteriori elaborazioni.

4. Dissociazione tessuti e Trituration

1. Seguente tecnica sterile norma in una cappa a flusso laminare, portare provetta con il campione tumorali nella cappa coltura, e lavare i campioni capovolgendo tubo e tumore 50x. Consentire frammenti di cadono sul fondo del tubo, e poi rimuovere HBSS + / +. Riempire con 30 ml HBSS + / +, ed agitare / invertire 50x di nuovo. Ripetere rimozione inversione / media per un totale di 4x.
2. Risospendere frammenti di tumore in 30 ml HBSS + / + per l'ultima volta, poi versare la miscela in un piatto di Petri mm sterile100 e tumore separato in 0,5 centimetri ³ raggruppamenti. Se frammenti di tumore più grandi sono incontrati, usare le forbici di tessuto o bisturi (# 11 o # 15 lame) per tagliare in pezzi più piccoli.
3. Utilizzare le pinze per collocare i 0,5 centimetri ³ gruppi tissutali nella persona HBSS + / + compilato, 2 ml rotondo fondo conicotubi al, tutte su ghiaccio. Usare le forbici tessuti per sminuzzare frammenti di tumore in sub-1 millimetro frammenti, la sospensione dovrebbe avere un aspetto 'snowglobe' (figura 1). Tritare il tumore solo fino alla maggior parte dei frammenti sono sub-1 mm; non 'over-trita' i campioni di tumore. Posizionare il tubo di tessuto completamente macinata di nuovo sul ghiaccio, e ripetere con tutte le provette dei campioni supplementari.
4. Trasferire tutti i campioni tumorali frammentati in un unico tubo da 15 ml. Una pipetta P1000 con un taglio / modificato punta sterile funziona bene per questo passo. Utilizzare supplementare HBSS + / + per svuotare / lavare i 2 tubi ml di dissociazione per assicurarsi che tutti i campioni di tumore è stato raccolto in 15 ml di tubo. Centrifugare miscela in centrifuga a 23 ° C, a 73 xg per 5 min.
5. Aspirare off HBSS + / +, lasciando il pellet. Re-sospendere frammenti in miscela 1:1 di 0,25% tripsina: 0.2% collagenasi (sciolto in HBSS-/ -) - aggiungere quel tanto che basta per tenere frammenti di tumore in stretto suspension. Sostituire il tappo a vite, e il luogo nel 37 ° C incubatore per 30 min. Agitare la miscela di cellule almeno una volta durante l'incubazione per mantenere i frammenti in sospensione. Posizionare la cultura dei media Schwannoma nell'incubatrice per riscaldarla in questo tempo pure.
6. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri FBS a ciascuna provetta per inattivare la tripsina, e poi campione centrifugare a 23 ° C, 73 xg per 5 min. Usando una pipetta, accuratamente aspirazione fuori il più possibile surnatante senza disturbare pellet di cellule. Aggiungere i terreni di coltura riscaldato (N2/insulin/5% FBS) ai frammenti di tumore a un rapporto finale di 1:2 frammenti di tumore: coltura (per esempio, se vi è 1 ml di frammenti di tumore, aggiungi in 2 ml di riscaldato media).
7. Prepararsi per tumore trituration tagliando la punta di una punta P1000 pipetta ad un diametro di circa 1-2 mm. Lentamente triturare la sospensione cellulare con punte per pipette di diametro progressivamente sempre più piccoli, fino a quando si può facilmente pipetta la soluzione attraverso un unaltEred P1000 punta di pipetta. Passare immediatamente a una punta più piccola, una volta si può facilmente pipetta la soluzione tumore attraverso la punta - non più di triturare il campione. Se un unico pezzo più grande di blocchi di tessuto aspirazione durante triturazione, toccando la punta della pipetta sul fondo della provetta conica permette spesso continua triturazione.

5. Cella di placcatura

1. Uno 0,5 millimetri ³ frammento di tessuto è sufficiente per seminare 1 x 100 mm piatto, o 4 x diapositive 8-well/4-well. Poco prima di aggiungere alla miscela media / cellulare, rimuovere la soluzione laminina dalle piastre di coltura, ma non lasciare le piastre a secco.
2. Per ogni piatto 100 mm, sciogliere il frammento tumore in 10 ml di terreni di coltura riscaldato.
3. Per ciascun pozzetto di una slitta 4 pozzetti, utilizzare 750 microlitri Terreni di coltura riscaldata (3 ml per l'intero vetrino).
4. Per ogni ben di uno scivolo 8-bene, usare 400 microlitri di media cultura riscaldato (3.2 ml per tutta la diapositiva).
5. Incubare le culture nel 37 &# 160; ° C, umidità del 100%, 6% di CO _2. Lasciare le colture da solo per almeno 36 ore, e quindi modificare il supporto se la soluzione è ingiallito (acido). In caso contrario, cambiare il supporto a 72 ore, poi ogni 2-3 giorni o quando i media diventano acide. Se il supporto diventa acido giorno per diversi giorni di fila, questo è generalmente un segno di potenziale contaminazione batterica o di lievito.

Risultati

Corretta frammentazione tumore è essenziale per la semina ottimale e escrescenza nelle piastre di coltura tissutale (Figura 1). Identificazione di cellule schwannoma durante i primi giorni dopo placcatura è spesso difficile, a causa oscurando quantità di detriti cellulari e globuli rossi. Con il 4 ^° o 5 ^° giorno, estensioni delle cellule vicino frammenti di tumore aderenti creeranno riconoscibile 'allacciatura' modelli tra i detriti. Successive modifiche di supporto ge...

Discussione

Storia delle culture in vitro schwannoma a

Sforzi per stabilire in colture in vitro schwannoma iniziato solo pochi decenni dopo la neuroma acustico iniziale resezione chirurgica aperta si è verificato nel 1894 ^12. Le prime colture registrate erano di Kredel nel 1920, che hanno tentato senza successo di crescita del tumore macinate dal "metodo goccia appeso" ¹² . Più tardi, Drs. Murray e Stout pubblicato la...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components