Primäre Kultur der Menschen vestibuläre Schwannome

Zusammenfassung

Vestibuläre Schwannome (VSS) nicht-malignen Tumoren von Schwann-Zellen (SC) Ursprungs, mit Mutationen im NF2 Tumorsuppressor-Gen assoziiert ist. Wir berichten über einen reproduzierbaren, effizienten Protokoll für primäre humane VS Zellkultur, die für die molekulare und zelluläre experimentelle Manipulation und Analyse ermöglicht und rekapituliert die heterogene Natur der menschlichen Krankheit.

Zusammenfassung

Vestibuläre Schwannome (VSS) stellen Schwann-Zellen (SC) Tumoren des Nervus vestibularis, Kompromisse 10% aller intrakraniellen Neoplasmen. VSs treten entweder sporadisch oder familiär (Neurofibromatose Typ 2, NF2) Formen, die beide mit Inaktivierung von Defekten in der NF2 Tumorsuppressor verbunden Gen. Die Behandlung ist in der Regel für VSS chirurgische Resektion oder Radiochirurgie, aber die Morbidität dieser Verfahren hat Ermittlungen in weniger invasive Behandlungen angetrieben. Historisch sind der fehlende Zugang zu frischen Gewebeproben und der Tatsache, dass Schwannom Zellen nicht verewigt deutlich die Verwendung von Primärkulturen zur Untersuchung der Tumorgenese Schwannom behindert. Um das begrenzte Angebot an Primärkulturen zu überwinden, wurde die verewigt HEI193 VS Zelllinie durch Transduktion mit HPV-Onkogene E6 und E7 erzeugt. Diese onkogene Transduktion eingeführt signifikanten molekularen und phänotypischen Veränderungen der Zellen, die ihre Verwendung als Modell für menschliche s begrenzenchwannoma Tumoren. Wir stellen daher eine vereinfachte, reproduzierbare Protokoll für die Kultur von primären humanen Zellen VS. Diese leicht zu beherrschen Technik ermöglicht molekularen und zellulären Untersuchungen, genauer rekapitulieren die Komplexität der VS Krankheit.

Einleitung

Vestibuläre Schwannome (VSS) stellen Schwann-Zellen (SC) Tumoren des Nervus vestibularis, Kompromisse 10% aller intrakraniellen Neoplasmen ^1-3. VSs treten entweder sporadisch oder familiär (Neurofibromatose Typ 2, NF2) Formen, die beide mit Inaktivierung von Defekten in der NF2 Tumorsuppressor verbunden Gen. Die Behandlung ist in der Regel für VSS chirurgische Resektion oder Radiochirurgie, aber die Morbidität dieser Verfahren beinhaltet Taubheit, Gesichts Neuropathien, Rückenmarksflüssigkeit auslaufen, Ungleichgewicht, und ^ein erneutes Tumorwachstum. Außerdem werden nicht alle Patienten sind akzeptabel chirurgischen oder strahlen Kandidaten. Solche erheblichen Morbidität sowie ein Mangel an alternativen Therapien hat die Untersuchung in die einzigartige molekulare Biologie der VSs in der Hoffnung, die Entwicklung neuer Behandlungen ^3,4 angetrieben.

Zellkultur ermöglicht eine schnelle, einfache und gründliche Analyse der molekularen und zellulären Verhalten und Screening von potenziellen therapeutischen comPfund. Historisch sind der fehlende Zugang zu frischen Gewebeproben und der Tatsache, dass Schwannom Zellen nicht verewigt deutlich die Verwendung von Primärkulturen zur Untersuchung der Tumorgenese Schwannom behindert. Um das begrenzte Angebot an Primärkulturen zu überwinden, wurde die verewigt HEI193 VS Zelllinie durch Transduktion mit HPV-Onkogene E6 und E7 ⁵ erzeugt. Diese onkogene Transduktion eingeführt signifikanten molekularen und phänotypischen Veränderungen der Zellen, die ihre Verwendung als Modell für menschliche Tumoren Schwannom begrenzen. SC Kulturen aus transgenen Mauslinien, die eine funktionelle NF2-Gen fehlt abgeleitet sind eine weitere Alternative zu NF2 abhängige SC Tumorgenese in vitro zu untersuchen. Diese Kulturen allerdings nicht die heterogene Natur der menschlichen VSs oder Konto für den menschlichen bestimmtes Verhalten zu rekapitulieren. Die meisten bisherigen VS Kulturtechniken benötigt relativ lange Bearbeitungszeiten und komplizierte selektiven Kulturtechniken ^8.6.Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, reproduzierbare Protokoll für VS primären Zellkultur mit Komplettbearbeitung in unter 3 Stunden, mit 95% Reinheit, wie Tumorzellen durch Immunfärbung bestimmt.

Protokoll

Ethikerklärung: Einsatz der menschlichen Tumorproben in diesem Protokoll wurde von der University of Iowa Institutional Review Board (IRB) genehmigt.

1. Setup-Tumor am Tag vor Ernte

1. Coat Zellkulturplatten: In einem sterilen Kulturhaube, fügen Sie genug Poly-L-Ornithin (0,01% Lösung) auf den Boden einer Polystyrol / Kunststoff-Kultur gut / Schale bedecken, ersetzen Sie den Deckel, und lassen Sie sich bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden. Glasobjektträger oder Deckgläser für Polystyrol für Experimente Bildgebung erfordern ersetzt werden.
2. Nach 2 Stunden, entfernen Sie die Poly-L-Ornithin-Lösung mit Saug-und damit die Platten vollständig in einem sterilen Kulturhauben trocknen. Fügen Sie genug Laminin-Lösung (10 g / ml in Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-freiem} HBSS [HBSS-/ -]), um die Kulturplatten vollständig zu bedecken, Deckel zu ersetzen, dann ist entweder 1) in kühlen 4 ° C Kühlschrank über Nacht oder 2) in 37 ° C-Inkubator für mindestens 2 Stunden. Wenn Plattenwird über Nacht oder länger aufbewahrt werden, wickeln die Platten in der Plastikverpackung, um Verdunstung / Austrocknung zu verhindern.

2. Setup-der Tag der Ernte Tumor

1. Bereiten Kultur, Medien: Die Medien werden frisch am Tag der Tumor Ernte und Verarbeitung gemacht, bei 4 ° C gelagert und auf 37 ° C im Brutschrank unmittelbar vor der Medien Ergänzungen / Änderungen.
2. Schwannom Kulturmedien mit hohem Glucosegehalt (4,5 mg / ml) DMEM (mit Phenolrot) mit 0,1 mg / ml Penicillin und 0,1 mg / ml Streptomycin; N2 Medien ergänzen endgültigen Verdünnung 1:100; Rinder-Insulin 5 ug / ml; Fötales Rinderserum und 10% Volumen. Filtern Sie alle Medien durch 0,22 um-Filter.
3. Bereiten Probentransport Kühler: Senden Sie eine Eis gefüllt Kühler mit 1-2 (je nach Höhe der Tumor, geerntet werden) steriles 50 ml konische Röhrchen mit 25 ml HBSS mit Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} (HBSS + / +) in den Operationssaal für die Tumorprobentransfer und Transport.
4. Bereiten indiv.idual Tumor Dissoziation Röhren - füllen sterile 2 ml Rundbodenröhrchen mit 1 ml HBSS + / + und auf Eis. (Tubes für scharfe Dissektion / Dissoziation von Tumorproben verwendet werden).
5. Für Dissoziation, bereiten etwa eine Dissoziation Rohr für jeden 0,5 cm ³ gewonnene Gewebe; zum Beispiel, wird eine Tumorprobe beträgt 1,0 x 1,0 x 1,0 cm (1 cm ³⁾ zwei HBSS + / + Dissoziation Rohre erfordern.
6. UV-Licht Sterilisation: Platz Gewebe Schere, kleine Zange, Skalpell Griff, 1x normale Petrischale, Pipette P1000 und Pipettenspitzen in einem sterilen Kultur Haube, und lassen unter UV-Licht für ~ 15 min vor Ankunft und Verarbeitung von Tumorgewebe.

3. Specimen Isolation und Verkehr

1. Isolieren Tumorproben durch chirurgische Resektion.
2. Sofort legen Tumorproben in die eiskalte HBSS + / + so schnell wie möglich nach der Entnahme aus dem Patienten. Sobald alle tissue-Proben werden gesammelt, Transport-Proben (auf Eis) von der operativen Theater an das Labor zur weiteren Verarbeitung.

4. Tissue Dissoziation und Verreiben

1. Folgende Standard sterilen Technik in einem Abzug mit laminarer Strömung, bringen konischen Rohr mit Tumorprobe in das Kulturhaube und Waschproben durch Umdrehen des Röhrchens und Tumor 50x. Lassen Fragmente auf den Boden der Röhre fallen, und entfernen Sie dann HBSS + / +. Refill mit 30 ml HBSS + / + und agitieren / invertieren 50x wieder. Wiederholen Inversion / media Entfernung für insgesamt 4x.
2. Re-suspend Tumorfragmente in 30 ml HBSS + / + zum letzten Mal, dann gießen Mischung in eine sterile100 mm Petrischale und separate Tumor in 0,5 cm ³ Gruppierungen. Wenn größere Tumorfragmente auftreten, verwenden Sie die Schere oder Skalpell Gewebe (# 11 oder # 15 Klinge) in kleinere Stücke schneiden.
3. Verwenden Sie die Zange, um die 0,5 cm ³ Gewebe Gruppen in den einzelnen HBSS + / + gefüllten, 2 ml-Rundkegelal Röhren, die alle auf dem Eis. Verwenden Sie die Schere, um Gewebe Tumorfragmente in Unter 1 mm-Fragmente der Aussetzung Hackfleisch sollte eine "Schneekugel" Aussehen (Abbildung 1) zu haben. Blatt vor den Tumor nur bis die Mehrheit der Fragmente Unter 1 mm; nicht "over-mince" die Tumorproben. Zeigen vollständig zerkleinerte Gewebe Rohr zurück auf dem Eis, und wiederholen Sie mit allen zusätzlichen Probenröhrchen.
4. Übertragen Sie alle fragmentierten Tumorproben in einem einzigen 15 ml konischen Röhrchen. Ein P1000 Pipette mit einem Schnitt / geändert sterile Spitze eignet sich gut für diesen Schritt. Sie besonders HBSS + / + zu spülen / spülen Sie die 2 ml Röhrchen Dissoziation sicherstellen, dass alle Tumorprobe wurde in 15-ml-Röhrchen gesammelt. Spin down-Gemisch in Zentrifuge bei 23 ° C, bei 73 xg für 5 min.
5. Abzusaugen HBSS + / +, so dass die Zellpellet. Re-suspend-Fragmente in 1:1-Gemisch von 0,25% Trypsin: 0,2% Kollagenase (in HBSS-/ gelöst -) - fügen gerade genug, um in Tumorfragmente halten engen suspension. Ersetzen Schraubverschluss, und in 37 ° C-Inkubator für 30 min. Man schüttelt Zellgemisch mindestens einmal während der Inkubation, um Fragmente in Suspension zu halten. Legen Sie das Schwannom Kulturmedien in den Brutschrank, um es in dieser Zeit zu wärmen auch.
6. Nach der Inkubation werden 100 ul FBS zu jedem Röhrchen, um das Trypsin zu inaktivieren, und dann Zentrifuge Probe bei 23 ° C, 73 × g für 5 min. Mit einer Pipette vorsichtig abzusaugen, so viel wie möglich, ohne überstehende Zellpellet zu stören. Hinzufügen des erwärmten Kulturmedien (N2/insulin/5% FBS) zu den Tumorfragmente zu einem endgültigen Verhältnis von 1:2 Tumorfragmente: Kulturmedien (z. B. wenn es 1 ml Tumorfragmente, fügen in 2 ml warmem Medien).
7. Bereiten Sie für die Tumor Verreiben durch Schneiden der Spitze weg von einer P1000 Pipettenspitze zu einem Durchmesser von etwa 1-2 mm. Langsam verreiben die Zellsuspension mit immer kleiner und kleiner Durchmesser Pipettenspitzen, bis Sie einfach pipettieren der Lösung durch eine unaltEred P1000 Pipettenspitze. Unmittelbar auf eine kleinere Spitze zu bewegen, sobald man leicht pipettieren den Tumor-Lösung durch die Spitze - nicht über die Probe verreiben. Wenn ein einzelnes größeres Stück Gewebeblöcke Aspiration während Verreiben, Antippen der Pipettenspitze an der Unterseite des konischen Rohrs ermöglicht oft fort Verreiben.

5. Zellüberzug

1. Ein 0,5 mm ^3-Fragment von Gewebe ist genug, um 1 x 100 mm-Schale, oder 4 x Dias 8-well/4-well Saatgut. Kurz vor der Zugabe der Medien / Zellgemisch, entfernen Sie das Laminin-Lösung von den Kulturplatten, aber nicht die Platten trocknen lassen.
2. Für jede 100-mm-Schale, die Auflösung der Tumor-Fragment in 10 ml Kulturmedium erwärmt.
3. Für jede Vertiefung einer 4-gut rutschen, 750 ul erwärmt Kulturmedien (3 ml für die ganze Folie).
4. Für jede Vertiefung eines 8-Well-rutschen, 400 ul erwärmt Kulturmedien (3,2 ml für die ganze Folie).
5. Die Kulturen in 37 & inkubieren# 160; ° C, 100% Luftfeuchtigkeit, 6% CO _2. Lassen Sie die Kulturen allein für mindestens 36 Stunden, und ändern Sie dann die Medien, wenn die Lösung vergilbt (sauer). Die Medien bei 72 h Ansonsten ändern, dann alle 2-3 Tage oder wenn die Medien zu sauer. Wenn das Medium sauer wird täglich für mehrere Tage in einer Reihe, das ist in der Regel ein Hinweis auf einen möglichen Bakterien-oder Hefe-Verunreinigung.

Ergebnisse

Korrekte Tumor Fragmentierung ist für die optimale Aussaat und Vermehrung in Gewebekulturschalen (Abbildung 1). Identifizierung von Schwannom Zellen während der ersten Tage nach der Plattierung ist oft schwierig, aufgrund verdeckt Mengen von Zelltrümmern und roten Blutkörperchen. Durch die ^4. oder ^5. Tag, wird in der Nähe von adhärenten Zellforttumorfragmente erkennbar erstellen "Schnürung" Muster unter den Trümmern. Nachträgliche Änderungen in der Regel entfern...

Diskussion

Geschichte der In-vitro-Kulturen Schwannom

Die Bemühungen um die In-vitro-Kulturen zu etablieren begann Schwannom weniger Jahrzehnte nach der ersten Akustikusneurinom offenen chirurgischen Resektion erfolgte im Jahre 1894 ^12. Die erste aufgezeichnete Kulturen waren von Kredel in den 1920er Jahren, der erfolglos versuchte, Hackfleisch Tumor durch "hanging drop-Methode" ¹² wachsen . Später Drs. Murray und Stout veröffentlich...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components