人体前庭神经鞘瘤的原代培养

摘要

前庭神经鞘瘤（VSS）是雪旺细胞（SC）的原点非恶性肿瘤，与在NF2的肿瘤抑制基因的突变相关联。我们提出一个可重复的，高效的协议，用于原代人类VS细胞培养，允许分子和细胞实验操作和分析，概括人类疾病的异质性。

摘要

前庭神经鞘瘤（VSS）代表雪旺氏细胞的前庭神经（SC）的肿瘤，危及所有颅内肿瘤的10％。 VSS发生在任何偶发或家族（神经纤维瘤病2型，NF2）形式，既在NF2肿瘤抑制基因失活的缺陷有关 基因。治疗VSS通常是手术切除或放射治疗，但此类程序的发病率，带动调查微创治疗。从历史上看，缺乏新鲜组织标本，事实上，神经鞘瘤细胞不会永生都显著阻碍了利用原代培养的神经鞘瘤肿瘤发生的研究。为了克服原代培养的供应有限，是由转导与HPV E6和E7癌基因产生的永生HEI193 VS细胞系。这种致癌转导介绍显著分子和表型改变的细胞，从而限制了其作为一种模式为人类的使用chwannoma肿瘤。因此，我们说明了一个简单的，可重复的协议，用于原代人类文化VS细胞。这很容易掌握技术允许分子和细胞研究能够更准确地概括了VS疾病的复杂性。

引言

前庭神经鞘瘤（VSS）代表雪旺氏细胞的前庭神经（SC）的肿瘤，危及所有颅内肿瘤^1-3的10％。 VSS发生在任何偶发或家族（神经纤维瘤病2型，NF2）形式，既在NF2肿瘤抑制基因失活的缺陷有关 基因。治疗VSS通常是手术切除或放射治疗，但此类程序的发病率，包括耳聋，面部神经病变，脊髓液渗漏，不平衡，和肿瘤再生长^1。另外不是所有的患者都可以接受手术或放疗的候选人。这种显著的发病率替代疗法，以及缺乏带动调查VSS的独特分子生物学在开发新的治疗方法^3,4的希望。

细胞培养允许潜在的治疗COM的分子和细胞行为和筛选的快速，轻便，并深入分析磅。从历史上看，缺乏新鲜组织标本，事实上，神经鞘瘤细胞不会永生都显著阻碍了利用原代培养的神经鞘瘤肿瘤发生的研究。为了克服原代培养的供应有限，是由转导与HPV E6和E7癌基因⁵所产生的永生HEI193 VS细胞系。这种致癌转导介绍显著分子和表型改变的细胞，从而限制了其作为一种模式为人类神经鞘瘤的使用。从缺乏功能性NF2基因的转基因小鼠系衍生的资深大律师代表的文化研究在体外NF2依赖SC肿瘤发生另一种选择。然而，这些文化不能概括人类VSS或帐户人类特定行为的异质性。以往大多数VS培养技术需要相对较长的处理时间和复杂的选择性培养技术^6-8。在这里，我们提出了一个简单的，可重复的协议，用于原发性VS细胞培养与完整的处理下3小时，用95％的肿瘤细胞的纯度，通过免疫测定。

研究方案

伦理声明：利用人类肿瘤标本在这个协议的批准爱荷华机构审查委员会的大学（IRB）。

1，安装前一天收获肿瘤

1. 外套细胞培养板：在无菌培养罩，补充足够的聚L-鸟氨酸（0.01％溶液），以支付聚苯乙烯/塑料培养以及/培养皿的底部，更换盖子，并让坐在在室温下至少2小时。载玻片或盖玻片可以代替聚苯乙烯为需要成像实验。
2. 2小时后，取出与吸力的聚-L-鸟氨酸溶液，并允许所述板中的无菌培养罩完全干燥。添加足够的层粘连蛋白溶液（10微克/毫升中的Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +}的HBSS中自由[HBSS-/ - ），以完全覆盖培养皿，更换盖子，然后要么1）在阴凉4℃冰箱放置过夜，或2）在37℃培养箱中放置至少2小时。如果板将过夜或更长时间储存​​，包装在保鲜膜板，以防止蒸发/干燥。

2，安装肿瘤收获的日子

1. 准备文化传媒：媒体是由新鲜肿瘤收获和加工的一天，存放于4℃，紧接媒体新增/变更加热到37℃的培养箱中培养。
2. 神经鞘瘤的培养基是高血糖（4.5毫克/毫升）的DMEM（含酚红）与0.1毫克/毫升青霉素和0.1毫克/毫升链霉素; N2培养基补充最终稀释度1:100;牛胰岛素5微克/毫升;胎牛血清至10％的总体积。通过0.22微米的过滤器过滤所有的媒体。
3. 准备试样运输冷却器：发送一个装满冰冷却器用1-2（取决于肿瘤的数量有所收获）无菌50ml锥形管25毫升的HBSS用的Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +}的（HBSS + / +）手术室肿瘤样品转移和运输。
4. 准备逐张idual肿瘤分离管 - 填充无菌的圆底管1毫升的HBSS + / +，并置于冰上。 （管将用于肿瘤样本的锐性剥离/解离）。
5. 对于解离，准备约一解离管组织收获的每0.5 ^立方厘米 ;例如，肿瘤样品测量1.0×1.0×1.0厘米（1 ^毫升 ）将需要两个HBSS + / +解离管。
6. 紫外线杀菌：将组织剪刀，小镊子，解剖刀手柄，1个正常的培养皿中，P1000吸管，并在无菌培养罩的枪头，并在紫外光下离开〜15分钟前抵达肿瘤组织和处理。

3，标本分离和运输

1. 通过手术切除孤立的肿瘤标本。
2. 从患者体内取出后，立即将肿瘤标本放入冰冷的HBSS + / +尽可能快地。一旦所有的布甲Ë样品收集，样品运输（冰）从手术剧场实验室作进一步处理。

4，组织解离和研磨

1. 下列标准无菌技术在层流罩，带锥形管与肿瘤标本进培养罩，并通过反相管和肿瘤50X洗涤样品。允许碎片掉落到管的底部，然后除去HBSS + / +。笔芯用30毫升的HBSS + / +和搅拌/再反转50倍。重复反转/媒体搬迁总共4倍。
2. 重悬肿瘤碎片在30毫升的HBSS + / +最后一次，然后将混合物倒入一个sterile100毫米培养皿，以及独立的肿瘤，用0.5 ^立方厘米分组。如果较大的肿瘤片段遇到，使用组织剪刀或手术刀（＃11或＃15刀片），以切成小块。
3. 使用镊子把0.5 ^立方厘米组织团体到个人的HBSS + / +填充，2个圆底圆锥曲线人管，所有的冰。使用组织剪刀切碎的肿瘤碎片成子1毫米片段，该悬浮液应该有一个“雪球”外观（ 图1）。剁碎的肿瘤只有等到大多数碎片都低于1毫米;不要“过度肉'的肿瘤样本。将完全碎纸巾筒背冰上，并重复所有额外标本管。
4. 转移所有零散的肿瘤样本到一个单一的15 mL锥形管。 P1000的移液管与剪切/修改无菌尖端可以很好地用于此步骤。使用额外的HBSS + / +冲洗/冲洗2毫升分离管，以确保所有的肿瘤样本被收集在15毫升管。在离心机降速混合物在23°C，在73×g离心5分钟。
5. 吸过的HBSS + / +，留下细胞团块。重悬片段中0.25％的胰蛋白酶1:1的混合物：0.2％胶原酶（溶于HBSS-/ - ） - 添加仅够维持肿瘤碎片在狭小的苏spension。代替螺旋盖，并置于37℃培养箱中培养30分钟。孵化保持碎片悬浮在搅拌细胞混合物至少一次。将神经鞘瘤培养基放入培养箱温暖就在这时候也是如此。
6. 孵育后，加入100微升的FBS，每管以灭活胰蛋白酶，然后离心样品，在23℃，73×g离心5分钟。使用移液管小心吸过尽可能多的上清液尽可能不干扰细胞沉淀。温热的培养基（N2/insulin/5％FBS）添加到肿瘤片段为1:2肿瘤片段的最终比例：培养介质（例如，如果有1毫升肿瘤片段，在2ml的升温加介质）。
7. 通过切割头销P1000的移液管尖端的直径为约1-2毫米的制备对肿瘤研磨。使用渐进式小口径的枪头慢慢磨碎的细胞悬液，直到你可以很容易地通过一个unalt吸取的解决方案ERED P1000的枪头。立即移动到一个较小的针尖，一旦你可以很容易地通过吸管尖端的肿瘤解决方案 - 不超过磨碎试样。如果一个单一的一块较大的组织块抽吸研磨过程中，攻丝枪头在锥形管的底部往往允许续研磨。

5，细胞电镀

1. 一个0.5毫米³片段组织足够的种子1×100毫米的菜，或4×8-well/4-well幻灯片。加上媒体/细胞混合物前夕，请从培养板的层粘连蛋白的解决方案，但不要让板干燥。
2. 每100毫米的菜，溶解肿瘤片段在10毫升加温培养基。
3. 对于4以及滑动的各孔中，用750微升温热的培养基（3毫升整个滑动）。
4. 对于一个8孔滑动的每一个孔，用400微升回暖文化传媒（3.2毫升整个幻灯片）。
5. 孵育培养37＆＃160;℃，100％湿度，6％的CO _2。离开文化的独自至少36小时，然后改变介质如果解决方案是泛黄（酸性）。否则在72小时改变媒体，然后每2-3天或当媒体变成酸性。如果媒体每日变为酸性，为连续数天，但通常潜在的细菌或酵母菌污染的指示。

结果

正确的肿瘤碎片是最佳的播种和生长在组织培养皿中（ 图1）是必不可少的。神经鞘瘤细胞的过程中电镀后的第一天鉴定是非常困难的，由于遮蔽细胞碎片和红血细胞的数量。由^第 4或^第 5天，贴壁附近的肿瘤细胞碎片扩展将创建可识别的“花边”模式的瓦砾中。随后的媒体的变化通常由第二周除去大部分的非贴壁细胞。使用这种方法，90％汇合可以7-14天之间所预期的?...

讨论

在体外培养神经鞘瘤史

努力建立体外培养神经鞘瘤的最初听神经瘤的开放手术切除发生于1894年¹²开始后短短的几十年，第一次有记载的文化是由Kredel在20世纪20年代，谁不成功地试图用“悬滴法^”12成长切碎的肿瘤。后来，博士。穆雷和烈性黑啤酒发表了他们在体外用生长在凝结人类血浆神经鞘瘤的文化体验。有趣的是，这种?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components