인간의 전정 신경초종의 차 문화

요약

전정 신경초종 (VSS는) NF2 종양 억제 유전자의 돌연변이와 관련된 슈반 세포 (SC) 기원의 비 악성 종양이다. 우리는 분자 및 세포 실험 조작 및 분석이 가능하며 인간의 질병의 이질적인 성격을 되풀이되었습니다 세포 배양 VS 인간의 기본에 대한 재현, 효율적인 프로토콜을보고합니다.

초록

전정 신경초종 (VSS는) 모든 두개 내 종양의 10 %를 손상 슈반 세포 전정 신경의 (SC) 종양을 나타냅니다. VSS는 모두 NF2 종양 억제의 비활성화 결함과 관련된 산발적 또는 가족 중 하나 (형 신경 섬유종증 (neurofibromatosis type 2), NF2) 형태의 발생 유전자. VS들에 대한 치료는 그러나 이러한 절차의 합병증이 덜 침습적 인 치료로 조사를 주도하고있다, 일반적으로 수술 적 절제 또는 방사선 수술입니다. 역사적으로, 신선한 조직 표본에 대한 액세스 및 신경초종 세포는 불멸화되지 않는다는 사실의 부족이 크게 신경초종의 종양 형성의 연구에 대한 일차 배양의 사용을 방해했다. 차 문화의 공급이 제한을 극복하기 위해, 불후의 HEI193 VS 셀 라인은 HPV E6와 E7 발암 유전자와 형질 도입에 의해 생성 된. 이 종양 전달은 인간의 모델로 사용을 제한하는 세포에 중요한 분자 및 형질 변경을 도입chwannoma 종양. 따라서 우리는 세포 VS 인간의 기본 문화에 대한 단순화, 재생 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 이 간단 익힌 기술은 더 정확하게 VS 질환의 복잡성을 다시 요약 분자 및 세포 조사를 허용한다.

서문

전정 신경초종 (VSS는) 모든 두개 내 종양 ^1-3의 10 %를 손상 슈반 세포 전정 신경의 (SC) 종양을 나타냅니다. VSS는 모두 NF2 종양 억제의 비활성화 결함과 관련된 산발적 또는 가족 중 하나 (형 신경 섬유종증 (neurofibromatosis type 2), NF2) 형태의 발생 유전자. VS들에 대한 치료는 그러나 이러한 절차의 사망률은 청각 장애, 안면 신경 병증, 척수액 누출, 불균형, 그리고 종양의 재성장 ^1을 포함, 일반적으로 수술 적 절제 또는 방사선 수술입니다. 또한 모든 환자는 허용 수술 또는 방사선 후보입니다. 대체 요법의 이러한 중요한 합병증뿐만 아니라 부족은 새로운 치료 ^{3,4 개발의} 희망 VSS의 고유의 분자 생물학에 조사를 주도하고있다.

세포 배양은 잠재적 인 치료 컴의 분자 및 세포 행동과 심사의 신속 손쉬운, 심도있는 분석을 할 수 있습니다파운드. 역사적으로, 신선한 조직 표본에 대한 액세스 및 신경초종 세포는 불멸화되지 않는다는 사실의 부족이 크게 신경초종의 종양 형성의 연구에 대한 일차 배양의 사용을 방해했다. 차 문화의 공급이 제한을 극복하기 위해, 불후의 HEI193 VS 셀 라인은 HPV E6와 E7 유전자 (oncogene) ^5와 전달에 의해 생성 된. 이 종양 전달은 인간의 신경초종 종양 모델로 사용을 제한하는 세포에 중요한 분자 및 표현형의 변화를 소개했다. 기능 NF2 유전자가 부족한 유전자 변형 마우스 라인에서 파생 된 SC 문화는 체외에서 NF2 의존 SC의 종양을 조사하기 위해 다른 대안을 나타냅니다. 이러한 문화는 그러나 인간의 특정 행동에 대한 인간 VS들 또는 계정의 이질적인 성격을 요점을 되풀이하지 못한다. 대부분의 이전 VS 배양 기술은 상대적으로 긴 처리 시간과 복잡한 선택적 배양 기술 ^6-8이 필요합니다.면역 염색에 의해 결정 여기서 우리는 95 %의 종양 세포의 순도 3 시간에서 완전 처리와 세포 배양 VS 차에 대한 간단한 재현 프로토콜을 제시한다.

프로토콜

윤리 정책이 프로토콜에서 인간의 종양 표본의 사용은 아이오와 기관 검토위원회의 대학 (IRB)의 승인을 받았다.

1. 설치 일 전에 종양의 수확

1. 외투 세포 배양 접시 : 멸균 문화 후드에서 뚜껑을 교체, 폴리스티렌 / 플라스틱 문화를 잘 / 접시의 바닥을 커버하기에 충분한 폴리-L-오르니 틴 (0.01 % 용액)을 추가하고, 적어도 상온에서 앉아 보자 2 시간. 유리 슬라이드 나 커버 슬립 촬상을 요구하는 실험 폴리스티렌에 대해 치환 될 수있다.
2. 2 시간 후, 흡입과 폴리-L-오르니 틴 솔루션을 제거하고 접시는 살균 문화 후드에서 완전히 건조 할 수 있습니다. 충분히 라미닌 솔루션 추가 ^(칼슘 10 ㎍ / ml의 ⁺ / 마그네슘 ^{2 +} 무료 HBSS [HBSS - / -]) 완전히 배양 플레이트를 커버하는, 뚜껑을 교체, 밤새 차가운 4 ° C 냉장고에있는 1) 장소 중 하나, 2) 최소 2 시간 동안 37 ° C 배양기에 배치합니다. 만약 판하룻밤 이상 저장됩니다, 증발 / 건조를 방지하기 위해 플라스틱 랩에 접시를 감싸줍니다.

2. 설치 종양 수확의 날

1. 준비 문화 미디어 : 미디어, 종양의 수확 및 가공의 날에 신선한 만든 4 ° C에 저장하고, 직전에 미디어 추가 / 변경을 인큐베이터에서 37 ° C로 가열된다.
2. 신경초종 문화 미디어 0.1 ㎎ / ㎖ 페니실린 및 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신과 높은 포도당 (4.5 ㎎ / ㎖) (페놀 레드) DMEM입니다; N2 미디어는 최종 희석 1:100을 보충; 소 인슐린 5 ㎍ / ㎖의; 10 %의 총 부피에 태아 혈청. 0.22 μm의 필터를 통해 모든 미디어를 필터링 할 수 있습니다.
3. 표본 전송 냉각기를 준비 수술실에 ^{2 +} (HBSS + / +) 칼슘 ^{2 +} / Mg를 25 ㎖의 HBSS와 멸균 50 ML 원뿔 튜브 (수확을 종양의 크기에 따라) 1-2 얼음 가득 쿨러 보내기 종양 샘플 전송 및 수송.
4. 개별 선택을 준비idual 종양 해리 튜브 - 1 HBSS + / + ㎖의 얼음에 장소 라운드 멸균 2 ㎖ 아래 튜브를 입력합니다. (튜브는 종양 샘플의 날카로운 절개 / 해리에 사용될 것이다.)
5. 해리를 들면, 수확 된 조직의 매 0.5 cm ³ 약 1 해리 튜브를 준비하고; 예를 들어, 1.0 × 1.0 × 1.0 cm (1cm ³⁾ 측정 종양 표본이 HBSS + / + 해리 튜브를 필요로 할 것이다.
6. 자외선 살균 : 장소의 조직 가위, 작은 집게, 메스 핸들, 1X 일반 세균 배양 용 접시, P1000 피펫 및 멸균 문화 후드에 피펫 팁, ~에 자외선 아래에 남겨 이전의 종양 조직의 도착 및 처리에 15 분.

3. 검체의 분리 및 전송

1. 수술 적 절제에 의해 종양 표본을 분리합니다.
2. 즉시 환자에서 제거 후 가능한 한 빨리 얼음처럼 차가운 HBSS + / +에 종양 표본을 배치합니다. 일단 모든 Tissu은전자 샘플은 추가 처리를 위해 실험실로 수술 극장에서, (얼음)에 전송 샘플을 수집됩니다.

4. 조직 해리와 연화

1. 층류 후드 표준 무균 기술에 이어, 문화 후드에 종양 표본으로 원뿔 튜브를 가지고, 튜브 및 종양의 50 배를 반전시켜 샘플을 씻어. 조각이 튜브의 바닥에 떨어질하고 HBSS + / +를 제거 할 수 있습니다. 30 ㎖의 HBSS + / +로 보충하고, 교반 / 다시 50 배를 반전. 배의 총 반전 / 미디어 제거를 반복합니다.
2. 30 ㎖의 HBSS는 + / + 마지막으로, 다음 sterile100 mm 페트리 접시에 혼합물을 넣어 별도의 종양이 0.5 cm로 ³ 그룹화 종양 조각을 일시 중지 다시. 큰 종양 조각이 발생하는 경우, 작은 조각으로 잘라 조직 가위 또는 메스 (# 11, # 15 블레이드)를 사용합니다.
3. 개인 HBSS는 + / + 작성에 0.5 cm ³ 조직 그룹을 배치 할 집게를 사용하여, 2 ㎖ 둥근 바닥 원뿔 곡선 (이차 곡선)모든 얼음에 알 튜브. 'Snowglobe에'모양 (그림 1)이 있어야 서브 1mm 조각 - 현탁액에 종양 조각을 말하다 조직 가위를 사용합니다. 단편의 대부분이 서브 1mm 때까지만 종양 말하다; 하지 '오버 말하다'종양 샘플을한다. 다시 얼음에 완전히 다진 조직 관을 배치하고 모든 추가 표본 튜브 반복합니다.
4. 하나의 15 ML 원뿔 관에 모든 조각 종양 샘플을 전송합니다. 컷 / 수정 멸균 팁 P1000 피펫은이 단계에서 잘 작동합니다. 사용 추가 HBSS + / + 확인 모든 종양 샘플 15 ML 튜브에 수집 된 확인하기 위해 2 ㎖ 해리 튜브 린스 / 플러시. 5 분 73 XG에, 23 ° C에서 원심 분리기의 혼합물을 스핀 다운.
5. 세포 펠렛을 떠나, HBSS + / +를 흡입. 0.25 % 트립신의 1:1 혼합물에 조각을 다시하면 일시 중지 : (HBSS - /에 용해 -) - 0.2 % 콜라게나 종양 조각을 유지하기 위해 충분한 추가 꽉 스와spension. 30 분 동안 37 ° C의 배양기에서 나사 정상, 장소를 교체합니다. 현탁액 단편을 계속 배양하는 동안 적어도 한번 세포 혼합액을 교반한다. 뿐만 아니라이 시간에 따뜻하게하기 위해 인큐베이터에 신경초종 문화 미디어를 넣습니다.
6. 배양 후, 23 ° C, 5 분 73 XG에 트립신을 불 활성화하기 위해 각각의 튜브에 100 μL의 FBS를 추가 한 다음 샘플을 원심 분리기. 피펫을 사용하여 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 상층 액을 흡입. 1시 2분 종양 단편의 최종 비율 종양 단편에 가온 배양 배지 (N2/insulin/5 % 1 FBS)을 추가 배양 배지 (예, 종양 절편 1 ㎖가있는 경우에, 가온 2 ㎖에 쓰 미디어).
7. 약 1 ~ 2 mm의 직경에 P1000 피펫 팁 떨어져 끝을 절단하여 종양 분쇄를 준비합니다. 쉽게 unalt을 통해 솔루션을 피펫 할 수있을 때까지 천천히, 점진적으로 더 작은 직경의 피펫 팁을 사용하여 세포 현탁액을 씹다ered P1000 피펫 팁. 쉽게 팁을 통해 종양 솔루션을 피펫 수 있으면 즉시 작은 팁으로 이동 -에 샘플을 씹다가 없습니다. 원뿔 튜브의 바닥에 피펫 팁을 눌러 분쇄하는 동안 조직 블록 열망의 하나의 큰 조각은 종종 계속 분쇄을 허용하는 경우.

5. 셀 도금

1. 조직의 한 0.5 mm ³ 조각은 1 개의 x 100mm 접시, 또는 4 개 8-well/4-well 슬라이드를 종자에 충분하다. 직전 미디어 / 세포 혼합물을 추가로 배양 접시에서 라미닌의 용액을 제거하지만 접시가 건조하게하지 않는다.
2. 각 100mm의 요리에, 10 ㎖ 따뜻하게 문화 미디어 종양 조각을 용해.
3. 4 - 웰 슬라이드의 각 웰의 경우, 750 ㎕를 따뜻하게 문화 미디어 (전체 슬라이드 3 ㎖)를 사용합니다.
4. 8 잘 슬라이드의 각 웰의 경우, 400 ㎕의 예열 문화 매체 (전체 슬라이드의 3.2 ML)을 사용합니다.
5. 37 &의 문화를 품다# 160; ° C, 습도 100 %, 6 % CO _2. 적어도 36 시간 동안 혼자 문화를 그대로두고 용액 (산성) 황변 경우 미디어를 변경합니다. 그렇지 않으면 다음 2-3 일마다 또는 미디어가 산성이 될 때, 72 시간에 미디어를 변경합니다. 미디어가 연속 며칠 동안 매일 산성되면, 이것은 일반적으로 잠재적 인 세균이나 효모 오염의 표시이다.

결과

정확한 종양의 분열은 조직 배양 접시에서 최적의 파종 및 파생물 (그림 1)을 위해 필수적입니다. 도금 후의 제 일 동안 신경초종 셀 식별 인해 세포 파편 및 적혈구의 양을 불명료에 종종 어렵다. 4 ^번째 또는 5 ^번째 날에 의해, 부착 종양 조각 근처 세포 확장되는 파편 패턴을 '몰'인식 만듭니다. 이후 미디어의 변화는 일반적으로 두 번째 주에 비 부착 세포의 대?...

토론

체외 신경초종 문화의 역사

체외 신경초종의 문화에서 설정하는 노력이 열려 수술 적 절제 1894 년 ¹² 발생 초기 청신경 후 몇 년을 시작했다. 최초의 기록 문화가 실패 "매달려 드롭 ^방법"(12) 다진 종양의 성장을 시도 1920 년대에 Kredel로했다 . 나중에 박사 부부. 머레이와 스타우트는 응고 인간 혈장에서 성장 neurilemomas과...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components