Culture primaire de l'homme vestibulaire schwannomes

Résumé

Vestibulaire schwannomes (VSS) sont des tumeurs non malignes de cellules de Schwann (SC) origine, associées à des mutations dans le gène suppresseur de tumeur NF2. Nous rapportons, un protocole efficace et reproductible pour l'homme primaire VS culture cellulaire qui permet la manipulation et l'analyse expérimentale moléculaire et cellulaire et récapitule la nature hétérogène de la maladie humaine.

Résumé

Schwannomes vestibulaires (VSS) représentent cellules de Schwann (SC) des tumeurs du nerf vestibulaire, compromettre 10% de toutes les tumeurs intracrâniennes. Commutateurs virtuels se produisent dans (la neurofibromatose de type 2, NF2) soit formes sporadiques ou familiales, à la fois liés à des défauts d'inactivation du gène suppresseur de tumeur NF2 gène. Le traitement de VSS est généralement la résection chirurgicale ou la radiochirurgie, mais la morbidité de ces procédures a conduit des enquêtes sur des traitements moins invasifs. Historiquement, le manque d'accès à des échantillons de tissus frais et le fait que les cellules ne sont pas schwannome immortalisées ont considérablement entravé l'utilisation de cultures primaires d'enquête de schwannome tumorigenèse. Pour remédier à la quantité limitée de cultures primaires, la lignée cellulaire immortalisée HEI193 VS a été générée par transduction avec le HPV oncogènes E6 et E7. Cette transduction oncogène introduit altérations moléculaires et phénotypiques importantes pour les cellules, ce qui limite leur utilisation comme un modèle pour s humainestumeurs du chwannoma. Nous illustrons donc un protocole reproductible simplifiée pour la culture de cellules primaires humaines VS. Cette technique facile à maîtriser permet enquêtes moléculaires et cellulaires qui récapitulent plus précisément de la complexité de la maladie VS.

Introduction

Schwannomes vestibulaires (VSS) représentent cellules de Schwann (SC) des tumeurs du nerf vestibulaire, compromettre 10% de toutes les tumeurs intracrâniennes ^1-3. Commutateurs virtuels se produisent dans (la neurofibromatose de type 2, NF2) soit formes sporadiques ou familiales, à la fois liés à des défauts d'inactivation du gène suppresseur de tumeur NF2 gène. Le traitement de VSS est généralement la résection chirurgicale ou la radiochirurgie, mais la morbidité de ces procédures comprend la surdité, les neuropathies faciales, fuite de liquide céphalo-rachidien, le déséquilibre, et la repousse de la tumeur ^1. En outre tous les patients sont candidats à la chirurgie ou de radiothérapie acceptables. Cette morbidité ainsi que le manque de thérapies alternatives a conduit une enquête sur la biologie moléculaire unique de commutateurs virtuels dans l'espoir de développer de nouveaux traitements ^3,4.

La culture cellulaire permet une analyse rapide, facile, et en profondeur du comportement et de criblage moléculaire et cellulaire de com thérapeutique potentiellelivres. Historiquement, le manque d'accès à des échantillons de tissus frais et le fait que les cellules ne sont pas schwannome immortalisées ont considérablement entravé l'utilisation de cultures primaires d'enquête de schwannome tumorigenèse. Pour remédier à la quantité limitée de cultures primaires, la lignée cellulaire immortalisée HEI193 VS a été générée par transduction avec E6 et E7 de HPV oncogènes ^5. Cette transduction oncogène introduit altérations moléculaires et phénotypiques importantes pour les cellules, ce qui limite leur utilisation comme un modèle pour les tumeurs de schwannome humaines. cultures SC issus de lignées de souris transgéniques qui n'ont pas un gène NF2 fonctionnelle représentent une autre alternative pour enquêter NF2 dépendant tumorigenèse SC in vitro. Ces cultures mais ne parviennent pas à récapituler la nature hétérogène des commutateurs virtuels humain ou d'un compte d'un comportement humain spécifique. La plupart des techniques antérieures de culture VS tenus temps de traitement relativement longs et les techniques de culture sélective complexes ^6-8.Nous présentons ici un protocole simple, reproductible pour principal VS culture cellulaire avec un traitement complet en moins de 3 heures, avec 95% de pureté des cellules tumorales tel que déterminé par immunomarquage.

Protocole

Déclaration d'éthique: l'utilisation des échantillons de tumeurs humaines dans ce protocole a été approuvé par l'Université de l'Iowa Institutional Review Board (IRB).

1. Configuration du jour d'avant tumeur récolte

1. Culture Manteau cellulaires Plaques: Dans une hotte de culture stérile, ajouter suffisamment de poly-L-ornithine (0,01% solution) pour couvrir le fond d'une culture polystyrène / plastique et / plat, remplacer les couvercles et laisser reposer à température ambiante pendant au moins 2 h. Les lames de verre ou des lamelles couvre-objet peuvent être substitués pour le polystyrène pour des expériences d'imagerie nécessitant.
2. Après 2 heures, retirer la poly-L-ornithine solution par aspiration et les plaques permettent de sécher complètement dans un hottes de culture stériles. Ajouter la solution de laminine assez (10 pg / ml dans le Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} sans HBSS [HBSS-/ -]) pour couvrir complètement les plaques de culture, replacer le couvercle, puis soit 1) lieu dans un endroit frais 4 ° C réfrigérateur pendant la nuit, ou 2) placer en incubateur 37 ° C pendant au moins 2 h. Si les plaquesseront stockées une nuit ou plus, envelopper les plaques dans une pellicule de plastique pour éviter l'évaporation / dessiccation.

2. Configuration de la Journée de la tumeur récolte

1. Préparer Culture Média: Média est fait frais le jour de la récolte et de la transformation tumorale, conservé à 4 ° C, et chauffé à 37 ° C dans l'incubateur immédiatement avant médias ajouts / modifications.
2. des milieux de culture de schwannome est haute glucose (4,5 mg / ml) DMEM (avec du rouge de phénol) avec 0,1 mg / ml de pénicilline et 0,1 mg / ml de streptomycine; Médias N2 complètent dilution finale de 1:100; L'insuline bovine 5 ug / ml; Sérum bovin fœtal à 10% volume total. Filtrez tous les médias de 0,22 um filtre.
3. Préparer des échantillons Transport Cooler: Envoyer une glacière remplie de 1-2 (selon le montant de la tumeur à être récoltés) 50 ml tubes coniques stériles avec 25 ml de HBSS avec Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} (HBSS + / +) à la salle d'opération pour le transfert de l'échantillon de la tumeur et le transport.
4. Préparer indivtubes de dissociation de la tumeur idual - remplir stériles 2 ml tubes ronds en bas avec 1 ml de HBSS + / + et placer sur la glace. (Tubes sera utilisé pour forte dissection / dissociation des échantillons de tumeurs).
5. Pour dissociation, préparer environ un tube de dissociation pour chaque 0,5 cm ³ de tissu prélevé; par exemple, un échantillon de la tumeur mesure 1.0 x 1.0 x 1.0 cm (1 cm ^3), il faudra deux tubes + / + de dissociation HBSS.
6. stérilisation de lumière ultraviolette: ciseaux Lieu de tissus, de petites pinces, poignée de scalpel, plat 1x normale Petri, P1000 pipette et pointes de pipette dans une hotte de culture stérile et laisser la lumière ultraviolette pour ~ 15 min avant la date d'arrivée et le traitement du tissu tumoral.

3. Isolation des échantillons et des transports

1. Isoler des échantillons de tumeurs par résection chirurgicale.
2. Immédiatement placer des échantillons de tumeurs dans le glacée HBSS + / + le plus rapidement possible après le retrait du patient. Une fois que tout tissuéchantillons de e sont recueillies, des échantillons de transport (sur la glace) du théâtre opérationnel au laboratoire pour traitement ultérieur.

4. Dissociation de tissus et de trituration

1. Après une technique stérile standard dans une hotte à flux laminaire, apporter tube conique avec l'échantillon de la tumeur dans la hotte de culture et laver les échantillons par inversion tube et tumeur 50x. Permettre aux fragments tombent au fond du tube, puis supprimer HBSS + / +. Remplir avec 30 ml de HBSS + / +, et agiter / inverser 50x nouveau. Répétez l'enlèvement inversion / médias pour un total de 4x.
2. Re-suspendre des fragments de tumeur dans 30 ml de HBSS + / + pour la dernière fois, puis versez le mélange dans un plat mm de Pétri sterile100, et tumeur distincte dans 0,5 cm ³ groupes. Si des fragments de tumeur plus importants sont rencontrés, utiliser les ciseaux ou d'un scalpel tissus (N ° 11 ou n ° 15 lame) pour couper en petits morceaux.
3. Utilisez la pince pour placer des groupes tissulaires 0,5 cm ³ dans l'individu HBSS + / + rempli, 2 ml à fond rond coniquetubes al, tous sur la glace. Utilisez les ciseaux de tissu pour hacher des fragments de tumeur en sous-1 mm fragments-la suspension doit avoir un aspect «snowglobe '(figure 1). Hacher de la tumeur jusqu'à ce que la majorité des fragments sont sous-1 mm; ne pas «sur-mince» des échantillons tumoraux. Placer le tube de tissu complètement hachée retour sur la glace, et répéter avec tous les tubes d'échantillons supplémentaires.
4. Transférez tous les échantillons de tumeurs fragmentés en un seul tube conique de 15 ml. Une pipette P1000 avec une pointe stérile coupe / modifié fonctionne bien pour cette étape. Utilisez supplémentaire HBSS + / + pour vider / rincer les 2 tubes ml de dissociation pour s'assurer que tout échantillon de la tumeur ont été recueillies dans 15 ml tube. Centrifuger le mélange à centrifuger à 23 ° C, à 73 g pendant 5 min.
5. Aspirer hors du HBSS + / +, laissant le culot cellulaire. Re-suspendre fragments dans un mélange 1:1 de 0,25% de trypsine: 0,2% de collagénase (dissous dans du HBSS-/ -) - ajouter juste assez pour garder des fragments de tumeur dans serré suspension. Remplacer la vis en haut, et le lieu de 37 ° C incubateur pendant 30 min. Agiter mélange de cellules au moins une fois pendant l'incubation de garder fragments en suspension. Placez le support de culture Schwannome dans l'incubateur pour la réchauffer en ce moment ainsi.
6. Après incubation, ajouter 100 pl de FBS à chaque tube pour inactiver la trypsine, puis à centrifuger l'échantillon à 23 ° C, 73 g pendant 5 min. Avec une pipette, aspirer soigneusement éteints autant de surnageant sans déranger culot cellulaire. Ajouter au milieu de culture chauffé (N2/insulin/5% de FBS) à des fragments de la tumeur à un rapport final de fragments de tumeur 01:02: milieu de culture (par exemple, s'il existe une ml de fragments de tumeur, ajouter dans 2 ml de réchauffé médias).
7. Préparez-vous à la trituration de la tumeur en coupant la pointe hors de la pointe de la pipette P1000 pour un diamètre d'environ 1-2 mm. Triturer lentement la suspension cellulaire à l'aide des conseils diamètre de pipette progressivement plus en plus petits, jusqu'à ce que vous pouvez facilement la pipette la solution à travers un unaltpointe de la pipette Ered P1000. Passer immédiatement à une pointe plus petite une fois que vous pouvez facilement la pipette la solution de la tumeur à travers la pointe - ne pas triturer sur l'échantillon. Si un seul gros morceau de blocs de tissus au cours de l'aspiration trituration, le taraudage de la pointe de pipette sur la partie inférieure du tube conique permet souvent trituration suite.

5. Cellule de placage

1. Un 0,5 mm ³ fragment de tissu est assez pour ensemencer 1 x boîte de 100 mm ou 4 x diapositives 8-well/4-well. Juste avant d'ajouter le mélange des médias / cellulaire, éliminer la solution de laminine des plaques de culture mais ne laissez pas les plaques sèches.
2. Pour chaque boîte de 100 mm, dissoudre fragment de la tumeur dans 10 ml de milieu de culture réchauffé.
3. Pour chaque puits d'une lame 4-bien, utiliser 750 pi de milieu de culture réchauffé (3 ml pour toute la lame).
4. Pour chaque puits d'une lame de 8 puits, utiliser 400 pi de milieu de culture chauffée (3,2 ml pour toute la lame).
5. Incuber les cultures en 37 &# 160; ° C, 100% d'humidité, 6% de CO _2. Laissez les cultures seul pendant au moins 36 heures, puis modifiez les médias si la solution est jauni (acide). Sinon changer le support à 72 h, puis tous les 2-3 jours ou quand les médias deviennent acides. Si le support devient acide par jour pendant plusieurs jours d'affilée, ce qui est généralement une indication de contamination bactérienne ou de levure potentiel.

Résultats

Fragmentation de la tumeur correct est essentiel pour l'ensemencement optimal et l'excroissance dans des boîtes de culture de tissus (figure 1). Identification des cellules de schwannome pendant les premiers jours après placage est souvent difficile, en raison d'obscurcir quantités de débris cellulaires et des globules rouges. Par la 4 ^e ou 5 ^e jour, les extensions de cellules proches des fragments de tumeur adhérentes vont créer reconnaissable "laçage"...

Discussion

Histoire de cultures in vitro dans Schwannome

Les efforts visant à établir dans les cultures de schwannome in vitro ont commencé quelques décennies après la neurinome de l'acoustique initiale résection chirurgicale ouverte a eu lieu en 1894 ^12. Les premières cultures enregistrées étaient par Kredel dans les années 1920, qui a tenté en vain de se développer tumeur hachée par "méthode de la goutte suspendue"

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin mouse protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS-/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100 mm round culture dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4-well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8-well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction filter flask	Midwest Scientific	TP99500
15 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91015
50 ml Conical tube	Midwest Scientific	TP91050
2 ml Round bottom tube	USA Scientific	1620-2700
Small scissors	FST	14058-11
Small forceps	FST	11251-20
Scalpel handle	FST	10004-13
#11 Scalpel blade	Roboz	RS-9801-11
Non-tissue culture 100 mm round Petri dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, non-filtered P1000 pipette tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated ice cooler
Culture hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)+/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)-/- (w/o Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine insulin (1 mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components