وصفها الفرق من سطح الخلية والمنضوية البروتينات الأجسام المضادة بعد تغذية الخلايا العصبية مثقف لايف

Summary

نحن تصف طريقة لتسمية البروتين على سطح الخلايا العصبية الحية باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل محددة لالحواتم خارج الخلية. البروتين ملزمة الأجسام المضادة على سطح الخلية وبالتالي المنضوية عبر الإلتقام يمكن تمييزها عن البروتين المتبقية على، أو الاتجار بهن ل، والسطح أثناء الحضانة.

Abstract

من أجل إظهار توطين سطح الخلية من مستقبلات عبر الغشاء المفترضة في الخلايا العصبية مثقف، ونحن المسمى البروتين على سطح الخلايا العصبية الحية مع الأجسام المضادة الأولية المحددة التي أثيرت ضد جزء من البروتين خارج الخلية. بالنظر إلى أن المستقبلات يتم الاتجار من وإلى السطح، إذا تم permeabilized الخلايا بعد التثبيت ثم سوف يتم الكشف عن كل من سطح الخلية والبروتينات الداخلية من قبل نفس الأجسام المضادة الثانوية المسمى. هنا، ونحن تكييفها طريقة تستخدم لدراسة الاتجار البروتين ("تغذية الأجسام المضادة") لتفاضلي البروتين التسمية التي كان قد كتبها المنضوية الإلتقام خلال خطوة الضد الحضانة والبروتين الذي إما بقيت على سطح الخلية أو تم الاتجار بهم إلى السطح خلال هذه الفترة . وقدم القدرة على التمييز بين هذه حمامات اثنين من البروتين ممكن من خلال إدماج خطوة الحجب بين عشية وضحاها مع تتركز درجة عالية من الأجسام المضادة الثانوية أونلبلد بعد incubatio الأوليةن من الخلايا العصبية unpermeabilized مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى. بعد عرقلة الخطوة، permeabilization من الخلايا العصبية يسمح الكشف عن تجمع المنضوية مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري المسمى مع fluorophore مختلفة. باستخدام هذه التقنية تمكنا من الحصول على معلومات مهمة عن مكان التحت خلوية من هذا المستقبل المفترضة، وكشف عن أنه كان، في الواقع، يتم الاتجار بهم إلى سطح الخلية في الخلايا العصبية. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة من أنواع الخلايا والبروتينات على سطح الخلية، وتوفير الأجسام المضادة مناسبة لحاتمة خارج الخلية هو متاح.

Introduction

في إنشاء وظيفة من البروتينات التي تم تشخيصها حديثا، ويمكن التحقيق في توطين التحت خلوية والاتجار من البروتين في مسألة توفر أدلة مهمة حول دور المحتمل / ثانية من ^1،2 البروتين. قدم تحليل المعلوماتية الحيوية من Transcriptome على من القشرة المخية الحديثة النامية ³ لنا مع قائمة من الجينات واظهار التعبير تغيير خلال الماوس corticogenesis الدماغ. نحن ثم اعتمدت نهجا خروج المغلوب الجينات للتأكد من أن البروتين المشفرة بواسطة واحد من هذه الجينات، sez6، دورا رئيسيا في تطوير الخلايا العصبية. لاحظنا أن الجينات المتعلقة الاستيلاء 6، أو Sez6 والبروتين الموجود في التشعبات النامية وهذا هو ايضا في العمود الفقري شجيري، هياكل متخصصة في التشعبات التي تتلقى إشارات ودمج مثير. وعلاوة على ذلك، عندما يفتقر هذا البروتين، تفشل التشعبات ونقاط الاشتباك العصبي مثير لتشكيل بشكل صحيح ^4. شكل الإسوي المهيمنة المحتمل من البروتين لديه ملامح transmembranه على الرغم من مستقبلات، وعندما تم فحص توزيع التحت خلوية من البروتين immunolabeled بواسطة المجهر متحد البؤر المجهري أو عن طريق immunoelectron معظم، إن لم يكن كلها، للإشارة ظهرت المرتبطة حويصلات صغيرة في حجرة somatodendritic في القليل، أو لا، البروتين المسمى على غشاء البلازما على سطح الخلية.

من أجل إظهار قاطع أن هذا المستقبل المفترضة مع مجال واسع خارج الخلية توقع والاتجار بهم لغشاء البلازما، واعتمدنا نهجا الخلية الحية باستخدام مصل كنا قد ولدت خارج الخلية إلى جزء من البروتين لتسمية البروتين على سطح الخلية. من خلال الجمع بين هذا النهج "تغذية الأجسام المضادة" مع اثنين من تطبيقات المسمى تفاضلي الضد الثانوية مفصولة خطوة الحجب واسعة وخطوة permeabilization، تمكنا من تحديد اثنين من تجمعات مختلفة من البروتين تتميز ملزمة لالأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى الحاملة fluoresc مختلفةبه والأنف والحنجرة. وهكذا، كنا قادرين على التمييز بين البروتين الذي قد المنضوية بواسطة الإلتقام خلال خطوة الضد الحضانة من البروتين الذي إما بقيت على سطح الخلية أو تم الاتجار بهم إلى السطح خلال هذه الفترة. باستخدام هذا الأسلوب، أنشأنا أن البروتين من الفائدة والاتجار بهم من وإلى سطح الخلية في الخلايا العصبية. لذلك، أثبتت هذه التقنية بسرعة نسبيا وبسيطة أكثر إفصاحا من الطرق التقليدية أو مناعية قبل التضمين immunogold المجهر الإلكتروني، على الرغم من حقيقة أننا تستخدم نفس الأرنب بولكلونل مصل لجميع هذه التقنيات. هذه التقنية تنطبق بصورة عامة على أي بروتين الغشاء قدم جيدة الأضداد الاعتراف الحواتم المجال خارج الخلية هو متاح. وقد استخدمت هذه التقنية سابقا لدراسة الاتجار مستقبلات لمستقبلات الغلوتامات GluR1 الوحيدات ^5.

Protocol

1. نأت الحصين العصبية الثقافة

1. إعداد coverslips (زجاج البورسليكات):
   1. يغسل في الإيثانول بنسبة 100٪.
   2. الهواء الجاف تحت أشعة فوق البنفسجية.
   3. معطف مع بولي-D-يسين (0.5 ملغ / مل في 0.15 M العازلة بورات، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية).
   4. في اليوم التالي (يوم الثقافة) غسل 3X في برنامج تلفزيوني ثم معطف مع laminin (2.5 ميكروغرام / مل، والماوس laminin الطبيعية) + 5٪ ت / ت للحرارة المعطل مصل العجل الجنين (FCS) المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
2. تشريح الجنينية يوم 18 (E18) الحصين الفئران وجمع في برنامج تلفزيوني يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم المبرد على الجليد. ملاحظة: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوان من جامعة ملبورن.
3. إعداد غراء والحلول الدناز أنا من أدوات غراء التفكك وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   1. إضافة 50 ميكرولتر حل الدناز أنا إلى 1 مل محلول غراء.
   2. ملاحظة: مرة واحدةأعدت أول، الحل غراء والحلول الدناز أنا يمكن الاستغناء بشكل منفصل إلى مأخوذة (0.5 مل و 25 ميكرولتر مأخوذة عن غراء الدناز وأنا، على التوالي) وتخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
4. إزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان واحتضان الحصين (من القمامة واحدة من الأجنة) مع 1 مل غراء / الدناز أنا الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة. نفض الغبار بلطف أنبوب لخلط محتويات مرتين خلال فترة الحضانة.
5. يسحن بلطف الأنسجة قرن آمون (تجنب توليد فقاعات) مع siliconized باستور ماصة 10-15X-اللهب مصقول حتى يتم الحصول على الخلايا والتشتت قليلة، إن وجدت، لا تزال أجزاء من الأنسجة undissociated.
6. طبقة بعناية تعليق الخلية فصلها على وسادة 3 مل من 4٪ ث / ت ألبومين المصل البقري (BSA) في محلول الملح المتوازن هانكس بالإضافة إلى المواد المضافة (HBSS ^+، وانظر القسم 1.6.1).
   1. إعداد هذا الحل خطوة التدرج عن طريق إذابة BSA في درجة حرارة الغرفة دون ضجةحلقة في HBSS تحتوي على 2 مم CaCl _2، 1 ملم MgSO _{4 و 4} مم ₃ NaHCO و 40 ملي الجلوكوز (HBSS ⁺⁾ ثم تصفية العقيمة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
7. أجهزة الطرد المركزي، و 100 x ج، 7 دقائق في جهاز للطرد المركزي أعلى مقاعد البدلاء مع الدوار سوينغ التدريجي.
8. إزالة طاف والحرص على عدم نضح بيليه الخلية.
9. resuspend الخلايا مكعبات بلطف مع مصقول لهب (siliconized) باستور ماصة (أو 1 مل الزرقاء غيض ماصة) في 1 مل المتوسطة Neurobasal كاملة (مع 2٪ B27، و 0.5 ملم L-الجلوتامين تستكمل مع 1٪ FCS).
10. عد اثنين مأخوذة 10 ميكرولتر باستخدام عدادة الكريات (NB الاعتماد فقط الخلايا المرحلة مشرق باسم خلايا "العيش").
11. لوحة الخلايا العصبية الأولية على معد مسبقا coverslips الزجاج المطلي (،75-1 × 10 ^5/18 مم ساترة في صفيحة ال 12 أيضا). مباشرة قبل الطلاء، ونضح الزائد الحل laminin / مصل من coverslips واستبدال ثقافة العصبية الأولية المتوسطة (انظر أدناه). ملحوظة: ن المطلوبةبني مصفر من coverslips يحتاج إلى أن تحدد مقدما وإعداد ساترة وبدأت في اليوم السابق للثقافة (انظر الخطوة 1.1).
12. الفئران الثقافة الابتدائية E18 الخلايا العصبية قرن آمون لمدة تصل إلى 21 يوما في المختبر (DIV) في المتوسطة Neurobasal، 2٪ B27، و 0.5 ملم L-الجلوتامين تستكمل مع FCS 1٪ (الحرارة المعطل). إجراء تغيير المتوسطة النصف في 7 DIV والأسبوعية بعد ذلك. يتم إضافة fluorodeoxyuridine المضادة للالإنقسامية / يوريدين في 7 DIV؛ 1/1، 000 التخفيف من 10 ملي الأوراق المالية من كل نوكليوزيد) لمنع فرط الدبقية.

2. الأجسام المضادة الحضانة مع الخلايا العصبية لايف

1. خلال الأسبوع الأول في الثقافة، على تطوير الخلايا العصبية شجيري العرش وخلال الأسبوع 2-3، قد نضجت بما فيه الكفاية لتكون الخلايا العصبية التي تمر synaptogenesis ^6،7.
   1. في الوقت المحدد التجريبية نقطة / ث، تطبيق الأجسام المضادة الأولية لثلاث نسخ الآبار التي تحتوي على الخلايا العصبية الجنينية الأولية coverslips على. إضافة قسامة من الأجسام المضادة مباشرة في مستنبت للالخلايا العصبية الأولية إلى النهائي المطلوب التخفيف ملاحظة: في مثالنا، تم تخفيفه لمصل الأرنب بولكلونل أثيرت ضد شكل يفرز المؤتلف من البروتين 1/500 عن طريق إضافة 2 ميكرولتر إلى 1 مل من مستنبت بشكل جيد؛ على الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة ، 13،000 x ج، يمكن إدراجها RT قبل اتخاذ قسامة من الأجسام المضادة حيث سيؤدي ذلك إلى إزالة أي الجسيمات ويمكن أن تساعد في الحد من الخلفية.
   2. لعناصر المصل preimmune، إضافة مبلغ معادل من المصل preimmune (لنفس التخفيف النهائية). إذا لم يكن هناك مصل preimmune هو متاح، إضافة حجم ما يعادل المتوسطة Neurobasal أو برنامج تلفزيوني (أي سيطرة الأجسام المضادة الأولية). بدلا من ذلك، إذا كان الأجسام المضادة الأولية مناسبة متاح تعترف الخلايا المنطقة / ث من البروتين، يمكن إضافة هذه الأجسام المضادة إلى السيطرة بشكل جيد من أجل اختبار خصوصية تلطيخ السطح.
   3. العودة الخلايا إلى حاضنة الثقافة ل1-4 ساعة (فترة الحضانة هذه قد تحدد تجريبيا). في experime لدينااليلة، كانت الأجسام المضادة الحالية لكامل الفترة على الرغم من أن التصميم التجريبي يمكن أن تدرج في نبضه من الأجسام المضادة تليها فترة حضانة أخرى بعد غسل التدريجي (تجربة نبض مطاردة) لتقييم مدار الساعة من استيعاب.
      خطوة اختيارية: هذه الحضانة يمكن القيام بها في درجة حرارة الغرفة أو حتى على الجليد لإبطاء معدل البروتين القاعدي الداخلي، إذا لزم الأمر. إذا أجريت في بيئة غير _CO-2 للرقابة، يجب تغيير على المديين المتوسط ​​واحد هو أن لا بيكربونات مخزنة قبل إضافة الضد / مصل. تنبيه: الثقافات الناضجة الخلايا العصبية (> 14 يوما، والمثقف بشكل خاص الخلايا العصبية الجنينية الماوس) لا تتسامح مع التغيرات المتوسطة تماما.
2. وقد استخدمنا مرات الحضانة لهذا الضد خطوة استيعاب الأولية من 1 ساعة، 2 ساعة، و 4 ساعة مع نتائج جيدة على الرغم من أن الوقت الأمثل سوف تعتمد على وفرة من البروتين من الفائدة فضلا عن ديناميات الاتجار البروتين في سلليرة سورية قيد الدراسة.
   ملاحظة: تم الحصول على صور ثنائية اللون التي تظهر في نتائج الممثل مع حضانة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة.
3. بعد الحضانة للفترة المطلوبة، نضح قبالة المتوسطة التي تحتوي على الأجسام المضادة. غسل الآبار بلطف ولكن مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني بسرعة في درجة حرارة الغرفة.

3. التطبيق الأجسام المضادة الثانوية لثابت، خلايا Unpermeabilized

1. إصلاح الخلايا العصبية مع بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات عازلة ودرجة الحموضة 7.2، 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، استخدم الطازجة تثبيتي؛ ​​بدلا من استخدام الإصلاح التي تم تخزينها في -20 درجة مئوية وإذابة تماما بحيث لا بارافورمالدهيد عجلت هو واضح . تنبيه: ينبغي إعداد تثبيتي لامتصاص العرق والتعامل معها في غطاء الدخان.
2. إزالة الإصلاح من الآبار (نقل إلى حاوية النفايات السائلة في غطاء الدخان) وشطف 3X مع برنامج تلفزيوني.
   1. خطوة اختيارية: إذا رغبت في ذلك، لانقاذ على الكواشف الأجسام المضادة، ويمكن لل coverslipsيمكن إزالتها بعناية من لوحة 12 جيدا مع ملقط وضعت خلية من جانب الى أعلى، على ورقة من parafilm وضعت على قاعدة من لوحة الثقافة المتاح.
   2. ويمكن بعد ذلك أن الحلول pipetted بلطف على لل coverslips بحيث يتم تغطيتها بالكامل من دون حل الفيضانات على حافة ساترة على Parafilm.
   3. هذا الأسلوب هو مناسبة للحضانات قصيرة الأجل (1-2 ساعة) ولكن لفترة أطول حضانات (على سبيل المثال بين عشية وضحاها) ينبغي الاضطلاع بها في غرفة ترطيب. بدلا من ذلك، لل coverslips يمكن وضعها مرة أخرى في بئر من لوحة 12 جيدا لاحتضان بين عشية وضحاها وحجم كاف ينبغي أن يضاف إلى ضمان لل coverslips لا تجف.
3. كتلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني (ملاحظة: لا إضافة المنظفات لعرقلة الحل في هذه المرحلة كما أنه من المهم أن الخلايا لا permeabilized).
4. من أجل تسمية بروتين السطح قبل الشروع في DETECنشوئها من البروتين المنضوية، تطبيق المسمى الأول fluorescently 2 ° الأجسام المضادة في الاختيار.
   ملاحظة: في المثال الموصوفة هنا، أثيرت ضدي الأولية في أرنب (الضد في المنزل) إلى الإسوي يفرز المؤتلف ^4. وبالتالي، لأول الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن المنطقة خارج الخلية عبر الغشاء من الإسوي على سطح الخلايا العصبية unpermeabilized، استخدمنا حمار المضادة للأرنب Dylight 649 (1/200 المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ BSA). فمن المستحسن أن أجهزة الطرد المركزي لحلول الأجسام المضادة الثانوية المخفف (10 دقيقة، 13،000 x ج، RT) قبل استخدامها.
5. لاحتضان coverslips لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
6. غسل coverslips (في الآبار)، 2X 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.

4. حجب مع زيادة غير إعتبر 2 ° الأجسام المضادة

1. منع الخلايا العصبية unpermeabilized مع تركيز عالية (> 0.1 ملغ / مل) من أونلبلد 2 ° الأجسام المضادة.
   1. وينبغي رفع أونلبلد 2 ° الأجسام المضادة ضد الأنواع التيتم رفع الأجسام المضادة الأولية (في هذه الحالة أرنب) من خلال ليلة وضحاها الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
   2. لهذا البروتوكول، استخدمت AffiniPure F _أساسها جزء الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L) بتركيز 0.13 ملغ / مل.
      وكان تم العثور على الحضانة بين عشية وضحاها أن تكون حاسمة باعتبارها فترة الحضانة أقصر (2 ساعة) كافية لحجب كاملة من الأجسام المضادة الأولية التي ليست ملزمة بالكامل من قبل الأجسام المضادة الثانوية المسماة: ملاحظة.
2. غسل coverslips (في الآبار)، 2X 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
3. بعد هذه الخطوة حظر، بعد إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات عازلة ودرجة الحموضة 7.2، 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شطف مع PBS (2X) بعد إزالة تثبيتي (نقل تثبيتي إلى حاوية النفايات السائلة في غطاء الدخان).

5. Permeabilization وتطبيق الضد الثاني Fluorescently مترافق 2 °

1. Permeabilize ومنع الخلايا مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون-X-100 في غرفة تيمبيrature لمدة 30 دقيقة.
2. إزالة عرقلة الحل (مع الحرص على أن لل coverslips لا تجف). إضافة ثاني fluorescently مترافق 2 ° الأجسام المضادة الموسومة مع fluorophore مختلفة.
   1. ملاحظة: يجب أن يكون من الممكن التمييز بين هذه العلامة fluorophore من تلك المستخدمة في السابق، اعتمادا على مرشحات الإثارة / الانبعاثات المتاحة على المجهر متحد البؤر (انظر أدناه).
   2. للمثال الواردة في هذا البروتوكول، تم استخدام اليكسا فلور 488 حمار مترافق المضادة للأرنب 2 ° الأضداد (1/200 في برنامج تلفزيوني، 5٪ BSA و 0.1٪ تريتون-X-100). احتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم إزالة حل الأجسام المضادة 2 درجة.
3. غسل coverslips 3X 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني، وأخيرا، وغسل لفترة وجيزة مع الماء منزوع الأيونات.

6. تصاعد والتصوير

1. جبل coverslips على الشرائح الزجاجية مع مائي تصاعد المتوسط ​​تحتوي على antifade (على سبيل المثال VECTASHIELD) والسماح ليجف. متجر في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة المرجعالحفاظ timal من شدة إشارة الفلورسنت.
2. الصورة immunostained الخلايا على المجهر متحد البؤر.
   1. يجب أن تكون متاحة المناسبة الإثارة وانبعاث المرشحات للكشف عن الإشارات fluorophore اثنين.
   2. إذا كانت الظروف التجريبية المختلفة ليتم مقارنة (على سبيل المثال، معدلات استيعاب ظل استقطابها ^8،9 أو السيطرة الظروف)، وضمان أن كل تكرار coverslips من مختلف الظروف وتصويرها مع نفس الصورة المعلمات الاستحواذ. ومن ثم يمكن قياس كثافة المتكاملة للمناطق مستوى الفائدة أو سمات نقاط و(مثل عدد وحجم) من الصور الناتجة باستخدام معيار برامج تحليل الصور (مثل فيجي / يماغيج، Metamorph).

النتائج

المزدوجة لون تقنية المناعية فلوري المقدمة هنا هو مفيد لوصفها المجالات خارج الخلية البروتينات عبر الغشاء في الخلايا الحية (كما هو موضح تخطيطي في الشكل 1). خلال فترة الحضانة، وربط الحواتم المناعية الوصول إليها ونسبة من السكان من جزيئات البروتين، جنبا إلى جنب ?...

Discussion

تقنية الموضحة هنا هي مكملة لتلك التي biotinylation سطح الخلية (التي استعرضها Arancibia-Càrcamo وآخرون) ¹² وهذا هو الأسلوب المفضل للحفاظ على المعلومات حول توطين التحت خلوية من البروتين المنضوية، قدم الأجسام المضادة الأولية المناسبة ل حاتمة خارج الخلية هو متاح. بالإضافة إ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206