Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

Resumen

Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.

Resumen

Con el fin de demostrar la localización de la superficie celular de un receptor transmembrana putativo en neuronas cultivadas, etiquetamos la proteína en la superficie de las neuronas en vivo con un anticuerpo primario específico generado contra una porción extracelular de la proteína. Dado que los receptores son objeto de tráfico hacia y desde la superficie, si las células se permeabilizaron después de la fijación a continuación, tanto de la superficie celular y la proteína interna serán detectados por el mismo anticuerpo secundario marcado. Aquí, hemos adaptado un método utilizado para estudiar el tráfico de proteínas ("alimentación anticuerpo") diferencialmente proteína etiqueta que había sido internalizado por endocitosis, durante la etapa de incubación de anticuerpos y proteínas que, o bien se quedaron en la superficie de la célula o se trafica a la superficie durante este periodo . La capacidad de distinguir estos dos grupos de proteínas fue posible gracias a la incorporación de un paso de bloqueo durante la noche con el anticuerpo secundario marcado altamente concentrado-después de una incubatio inicialn de las neuronas unpermeabilized con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente-. Después de la etapa de bloqueo, la permeabilización de las neuronas permitió la detección de la piscina interiorizado con un anticuerpo secundario fluorescente marcada con un fluoróforo diferente. Usando esta técnica pudimos obtener información importante acerca de la localización subcelular de este receptor putativo, revelando que era, de hecho, víctimas de la trata a la superficie celular en las neuronas. Esta técnica es ampliamente aplicable a una gama de tipos de células y proteínas de la superficie celular, proporcionando un anticuerpo adecuado a un epítopo extracelular está disponible.

Introducción

En el establecimiento de la función de las proteínas recientemente identificadas, la investigación de la localización subcelular y el tráfico de la proteína en cuestión puede proporcionar importantes pistas sobre el probable rol / s del ^1,2 proteínas. El análisis bioinformático del transcriptoma del neocórtex en desarrollo ³ nos proporcionó una lista de genes que muestran expresión alterada durante ratón corticogenesis cerebro. Adoptamos entonces un enfoque knockout de genes para determinar que la proteína codificada por uno de estos genes, sez6, tiene un papel clave en el desarrollo de las neuronas. Hemos observado que el gen relacionado con la incautación-6, o Sez6, la proteína se encuentra en las dendritas en desarrollo y también está presente en las espinas dendríticas, estructuras especializadas en las dendritas que reciben e integran señales excitadoras. Además, cuando esta proteína es deficiente, las dendritas y las sinapsis excitadoras no se forman correctamente ^4. La isoforma dominante probable de la proteína tiene características de un transmembranreceptor de correo aunque, cuando la distribución subcelular de la proteína inmunomarcadas se examinó por microscopía confocal o microscopía inmunoelectrónica por la mayoría, si no todos, de la señal aparecido asociada con vesículas pequeñas en el compartimiento somatodendrítico con poco, o ningún, proteína marcada en la membrana plasmática en la superficie celular.

Con el fin de mostrar definitivamente que este receptor putativo con un gran dominio extracelular predicho es objeto de tráfico a la membrana plasmática, se adoptó un enfoque de células vivas utilizando el antisuero que habíamos generada a una porción extracelular de la proteína para etiquetar proteínas en la superficie celular. Al combinar este enfoque "anticuerpo de alimentación" con dos aplicaciones de anticuerpo secundario marcado con diferencialmente separados por una extensa etapa de bloqueo y un paso de permeabilización, pudimos identificar dos piscinas diferentes de proteínas que se distinguen por su unión a anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que soportan diferentes colgetiquetas rentes. Por lo tanto, hemos sido capaces de distinguir las proteínas que habían sido internalizados por endocitosis, durante la etapa de incubación de anticuerpos de la proteína que, o bien se quedaron en la superficie de la célula o se trafica a la superficie durante este período. Usando este método, se estableció que la proteína de interés es objeto de tráfico hacia y desde la superficie celular en las neuronas. Por lo tanto, esta técnica relativamente rápido y simple resultó más informativo que los métodos tradicionales de inmunocitoquímica o pre-incrustación de microscopía electrónica por inmunomarcaje, a pesar del hecho de que se utilizó el mismo antisuero policlonal de conejo para todas estas técnicas. Esta técnica es aplicable en general a cualquier proteína transmembrana proporcionado un buen anticuerpo que reconoce epítopos dominio extracelular está disponible. La técnica se ha usado previamente para estudiar el tráfico del receptor de la subunidad GluR1 del receptor de glutamato ^5.

Protocolo

1. Disociada del hipocampo Neurona Cultura

1. Preparar cubreobjetos (vidrio de borosilicato):
   1. Lavar con etanol al 100%.
   2. Deje secar al aire bajo irradiación UV.
   3. Escudo con poli-D-lisina (0,5 mg / ml en tampón de borato 0,15 M, durante la noche a 4 ° C).
   4. Al día siguiente (el día de la cultura) se lava 3 veces en PBS y luego cubra con laminina (2,5 g / ml, laminina de ratón naturales) + 5% v / v de suero de ternera fetal inactivado por calor (FCS) diluido en PBS durante 2 horas a 37 ° C.
2. Diseccionar embrionarias día 18 (E18) hipocampos de rata y recoger en PBS que contenía calcio y de magnesio, se enfrió en hielo. NOTA: todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Melbourne.
3. Preparar la papaína y soluciones de DNasa I del Kit de papaína de disociación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. Añadir 50 l solución de DNasa I a 1 ml de solución de papaína.
   2. NOTA: Una vezprimero preparada, la solución de papaína y las soluciones de DNasa I se pueden dispensar por separado en alícuotas (0,5 ml y 25 ml de alícuotas para la papaína y DNasa I, respectivamente) y se almacenaron a -20 ° C hasta que se necesite.
4. Eliminar la mayor cantidad posible de PBS y se incuba hipocampos (a partir de una camada de embriones) con 1 ml de papaína / DNasa I solución a 37 ° C durante 15-20 min. Agitar suavemente el tubo para mezclar el contenido dos veces durante el período de incubación.
5. Se tritura el tejido de hipocampo suavemente (evitando la generación de burbujas) con una pipeta Pasteur siliconizada 10-15x-pulido de llama hasta que se obtuvo una dispersión celular y pocos, si alguno, trozos de tejido no disociado permanecen.
6. Capa cuidadosamente la suspensión celular disociada en un cojín de 3 ml de 4% w / v de albúmina de suero bovino (BSA) en solución de Hanks más aditivos salina equilibrada (HBSS ^+; véase la Sección 1.6.1).
   1. Preparar esta solución gradiente por etapas mediante la disolución de la BSA a temperatura ambiente sin agitaciónanillo en HBSS que contenía 2 mM CaCl _2, 1 mM MgSO _4, 4 mM _NaHCO3 y glucosa 40 mM (HBSS ⁺⁾ luego de filtro estéril y se almacena a 4 ° C.
7. Centrífuga, 100 xg, 7 min en una centrífuga de sobremesa con un rotor basculante.
8. Eliminar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el pellet celular.
9. Resuspender las células sedimentadas suavemente con un pulida a la llama (siliconizado) pipeta Pasteur (o una punta de pipeta azul de 1 ml) en 1 ml de medio completo Neurobasal (con 2% B27, 0,5 mM de L-glutamina suplementado con 1% de FCS).
10. Cuente dos alícuotas 10 l usando un hemocitómetro (sólo NB contar las células en fase brillante como células "vivas").
11. Placa neuronas primarias sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos predispuestas (0,75-1 x 10 ^5/18 mm cubreobjetos en placa de 12 pocillos). Inmediatamente antes de la galvanoplastia, aspirar solución de laminina / suero sobrante de cubreobjetos y reemplazar con medio de cultivo de neuronas primario (véase más adelante). NB El n requeridaúmero de cubreobjetos necesita ser determinado de antemano como preparación cubreobjetos se comienza el día antes del cultivo (véase el paso 1.1).
12. Rata cultivo primario E18 neuronas del hipocampo de hasta 21 días in vitro (DIV) en medio Neurobasal, 2% B27, 0,5 mM de L-glutamina suplementado con 1% de FCS (inactivado por calor). Realizar un cambio de medio a medio a las 7 DIV y luego semanalmente. El fluorodesoxiuridina anti-mitótico / uridina se añade a 7 DIV; 1/1, 000 dilución de 10 mM de stock de cada nucleósido) para prevenir el crecimiento excesivo de la glía.

2. Anticuerpo La incubación con vivo neuronas

1. Durante la primera semana de la cultura, las neuronas están desarrollando árboles dendríticos y por semana 2-3, las neuronas han madurado lo suficiente como para estar pasando por ^6,7 sinaptogénesis.
   1. En seleccionados de tiempo experimental de puntos / s, aplique el anticuerpo primario a pocillos por triplicado que contienen las neuronas embrionarias primarias en cubreobjetos. Añadir una alícuota del anticuerpo directamente en el medio de cultivo delas neuronas primarias a la dilución final deseada Nota: En nuestro ejemplo, un antisuero policlonal de conejo producido contra una forma secretada de la proteína recombinante se diluyó 1/500 mediante la adición de 2 l a 1 ml de medio de cultivo en el pozo; una centrifugación durante 10 min , 13000 xg, RT puede incorporarse antes de tomar una alícuota de anticuerpo como esto eliminará cualquier partícula extraña y puede ayudar a reducir el fondo.
   2. Para los controles de suero preinmune, añadir una cantidad equivalente de suero preinmune (a la misma dilución final). Si no hay suero pre-inmune está disponible, agregue el volumen equivalente de medio Neurobasal o PBS (sin control del anticuerpo primario). Alternativamente, si un anticuerpo primario adecuado disponible que reconoce intracelular región / s de la proteína, este anticuerpo se puede añadir a un pocillo de control con el fin de probar la especificidad de la tinción de la superficie.
   3. Volver a las células a la incubadora de cultivo de 1-4 horas (este periodo de incubación puede ser determinada empíricamente). En nuestro experimeNTS, el anticuerpo estaba presente durante todo el período aunque el diseño experimental podría incorporar un pulso de anticuerpo seguido por un período de incubación adicional después de lavado (un experimento de pulso-caza) para evaluar el curso temporal de la internalización.
      Paso opcional: Esta incubación se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o incluso en hielo para reducir la tasa de internalización de proteína basal, si es necesario. Si se realiza en un entorno no-CO ₂ controlada, el medio debe ser cambiado a uno que no está tamponada con bicarbonato antes de la adición del anticuerpo / antisuero. PRECAUCIÓN: cultivos de neuronas maduras (> 14 días, y las neuronas de ratón embrionarias cultivadas especialmente) no toleran cambios de medio completo también.
2. Hemos utilizado los tiempos de incubación para esta etapa de internalización anticuerpo primario de 1 h, 2 h, 4 h y con buenos resultados, aunque el tiempo óptimo dependerá de la abundancia de la proteína de interés, así como la dinámica del tráfico de proteínas en la CELls en estudio.
   NOTA: Las imágenes de dos colores mostrados en resultados representativos se obtuvieron con una incubación de 1 hora a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos.
3. Después de la incubación durante el periodo deseado, aspirar fuera el medio que contiene anticuerpos. Lavar los pocillos suavemente pero rápidamente una vez con PBS a temperatura ambiente.

3. Aplicación anticuerpo secundario a fijos, unpermeabilized células

1. Fijar las neuronas con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente Nota: para obtener los mejores resultados, use fijador recién preparada; utilizar alternativamente corrección que se ha almacenado a -20 ° C y completamente descongelado para que ningún paraformaldehído precipitado es evidente . PRECAUCIÓN: fijador Paraformaldehyde debe estar preparado y manipulado de una campana de humos.
2. Retire solución de los pozos (transferir a contenedores de residuos líquidos en la campana de humos) y enjuague 3 veces con PBS.
   1. PASO OPCIONAL: Si lo desea, para ahorrar en reactivos de anticuerpos, los cubreobjetos puedeser eliminado cuidadosamente de la placa de 12 pocillos con unas pinzas y se coloca la celda de arriba abajo, sobre una lámina de Parafilm establecido en la base de una placa de cultivo desechable.
   2. Las soluciones pueden entonces ser pipetearon suavemente sobre los cubreobjetos de modo que estén completamente cubiertos sin la inundación solución sobre el borde del cubreobjetos sobre el Parafilm.
   3. Esta técnica es adecuada para incubaciones a corto plazo (1-2 h) sin embargo ya incubaciones (por ejemplo durante la noche) debe ser llevado a cabo en una cámara humidificada. Alternativamente, los cubreobjetos se pueden colocar de nuevo en los pocillos de la placa de 12 pocillos para la incubación durante la noche y el volumen añadida debe ser suficiente para asegurar que los cubreobjetos no se sequen.
3. Bloquear durante 30 minutos a temperatura ambiente con 5% de BSA en PBS (Nota: No agregue detergente en la solución de bloqueo en esta etapa, ya que es importante que las células no se permeabilizaron).
4. Con el fin de etiquetar proteína de la superficie antes de proceder con detección de la proteína internalizada, aplique la primera etiqueta fluorescente 2 º anticuerpo de elección.
   Nota: En el ejemplo descrito aquí, el antisuero primario se planteó en el conejo (anticuerpo in-house) para una isoforma secretada recombinante ^4. Por lo tanto, para la primera anticuerpo secundario para detectar la región extracelular de la isoforma transmembrana en la superficie de las neuronas unpermeabilized, se utilizó burro anti-conejo DyLight 649 (1/200 diluido en PBS que contenía 5% de BSA). Se recomienda centrifugar soluciones de anticuerpo secundario diluido (10 min, 13.000 xg, RT) antes de su uso.
5. Incubar los cubreobjetos durante 2 horas a temperatura ambiente.
6. Lavar cubreobjetos (en pozos), 2x 5 min con PBS.

4. El bloqueo con marcado en exceso Anticuerpo 2 °

1. Bloquear las neuronas unpermeabilized con una alta concentración (> 0,1 mg / ml) de anticuerpo no marcado 2 °.
   1. El anticuerpo 2 º sin etiqueta debe elevarse contra la especie en la queel anticuerpo primario se elevó (en este caso de conejo) durante la noche por incubación a temperatura ambiente.
   2. Para este protocolo, se utilizó un fragmento AffiniPure F _ab IgG de cabra anti-conejo (H + L) a una concentración de 0,13 mg / ml.
      NOTA: La incubación durante la noche se encontró que era crucial como un período de incubación más corto (2 horas) era insuficiente para el bloqueo completo de anticuerpo primario que no estaba plenamente obligado por el anticuerpo secundario marcado.
2. Lavar cubreobjetos (en pozos), 2x 5 min con PBS.
3. Después de esta etapa de bloqueo, después de fijar las células con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente. Lavar con PBS (2x) después de la eliminación de fijador (transferencia fijador para contenedores de residuos líquidos en campana de extracción).

5. Permeabilización y Aplicación de la Segunda Fluorescently conjugado 2 ° de Anticuerpos

1. Permeabilizar y bloquear las células con 5% de BSA en PBS que contenía 0,1% de Triton-X-100 en Tempe habitaciónRature durante 30 min.
2. Eliminar la solución de bloqueo (teniendo cuidado de que los cubreobjetos no se sequen). Agregue el 2 ° anticuerpo segunda fluorescencia conjugada marcada con un fluoróforo diferente.
   1. NOTA: Debe ser posible distinguir esta etiqueta fluoróforo de la utilizada anteriormente, dependiendo de los filtros de excitación / emisión disponibles en el microscopio confocal (ver más abajo).
   2. Para el ejemplo presentado en este protocolo, se usó un Alexa Fluor 488 burro conjugado anti-conejo de 2 ° anticuerpo (1/200 en PBS, 5% de BSA y 0,1% de Triton-X-100). Incubar 2 horas a temperatura ambiente y después se retira la solución de anticuerpo 2 º.
3. Lavar 3x cubreobjetos 5 min con PBS y, finalmente, se lava brevemente con agua desionizada.

6. Montaje e Imagen

1. Monte cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con un medio que contiene el montaje Antifade acuoso (por ejemplo VECTASHIELD) y dejar secar. Almacenar en la oscuridad a 4 ° C para oppreservación Timal de intensidad de la señal fluorescente.
2. Imagen immunostained células en un microscopio confocal.
   1. Filtros de excitación y emisión apropiados para la detección de las dos señales de fluoróforos deben estar disponibles.
   2. Si diferentes condiciones experimentales se van a comparar (por ejemplo, las tasas de internalización bajo despolarizadas ^8,9 o de control de las condiciones), asegúrese de que todos los replicados cubreobjetos de las diversas condiciones se crean imágenes con los mismos parámetros de adquisición de imágenes. La densidad integrada de las zonas habituales de interés o los atributos de puntos lagrimales (por ejemplo, número, tamaño) de las imágenes resultantes se puede medir utilizando el software estándar de análisis de imágenes (por ejemplo, Fiji / ImageJ, Metamorph).

Resultados

La técnica de inmunotinción fluorescente de dos colores que aquí se presenta es útil para el etiquetado de los dominios extracelulares de proteínas de transmembrana en las células vivas (que se muestra esquemáticamente en la Figura 1). Durante el período de incubación, las inmunoglobulinas se unen epítopos accesibles y una proporción de la población de moléculas de proteína, junto con anticuerpo unido, se endocitosis. Además, la proteína recién sintetizada puede llegar a la superficie d...

Discusión

La técnica descrita aquí es complementaria a la de la biotinilación de la superficie celular (revisado por Arancibia-Carcamo et al.) ¹² y es el método de elección para la preservación de la información sobre la localización subcelular de la proteína internalizada, proporcionado un anticuerpo primario adecuado a una epítopo extracelular está disponible. Además, la cuantificación de tráfico de proteínas / internalización en el tiempo se puede realizar (mediante la fijación de cubreobje...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206