ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化

要約

我々は、細胞外のエピトープに特異的なポリクローナル抗体を用いてニューロンを生体の表面上のタンパク質を標識するための方法を記載している。タンパク質、細胞表面上の抗体によって結合され、その後、エンドサイトーシスを介して内在化は、上の残りのタンパク質から区別、又はインキュベーション中に表面に輸送することができる。

要約

培養ニューロンにおける推定膜貫通受容体の細胞表面局在化を実証するために、我々は、タンパク質の細胞外部分に対して産生された特異的な一次抗体と生ニューロンの表面上のタンパク質を標識した。細胞を固定後、透過処理された場合の受容表面との間で売買されていることを考えると、両方の細胞表面と内部のタンパク質は、同じ標識された二次抗体によって検出される。ここでは、いずれかが細胞表面上に残存し、又は、この期間中に表面に輸送された抗体インキュベーション工程およびタンパク質の間にエンドサイトーシスによって内在化された標識タンパク質を示差的にするために、タンパク質輸送（「抗体送り」）を研究するために使用される方法を適合さ。タンパク質のこれらの2プールを区別する能力は、初期incubatio後、高濃度の非標識二次抗体と一晩ブロッキングステップを組み込むことによって可能になった蛍光標識された二次抗体と非透過ニューロンのN。異なる蛍光体で標識した蛍光二次抗体を用いて内部化プールの検出を可能にしたニューロンのブロッキング工程、透過処理の後に。我々はそれがあったことを明らかにし、この推定受容体の細胞内局在についての重要な情報を得ることができたこの技術を使用して、実際に、神経細胞における細胞表面に人身売買。この技術は、細胞外エピトープに適切な抗体を提供することが可能で、細胞型および細胞表面タンパク質の範囲に広く適用可能である。

概要

新たに同定されたタンパク質の機能を確立する上で、問題のタンパク質の細胞内局在や人身売買の調査は蛋白質^の1,2の可能性のある役割/ Sについての重要な手がかりを提供することができます。開発新皮質³のトランスクリプトームのバイオインフォマティクス解析は、マウス脳corticogenesis中に変更発現を示す遺伝子のリストを提供してくれました。次に、これらの遺伝子のうちの1つ、sez6によってコードされるタンパク質は、ニューロンの発達に重要な役割を有することを確認するために遺伝子ノックアウトアプローチを採用した。私たちは、発作関連遺伝子6、またはSez6、タンパク質は樹状突起の開発に位置しており、また、樹状突起棘、受信して興奮シグナルを統合し、樹状突起上の特殊な構造中に存在していることを観察した。このタンパク質が不足している場合にさらに、樹状突起および興奮性シナプスが正しく^4を形成することができない。タンパク質の考えが支配的アイソフォームはtransmembranの機能を備えていますE受容体は、免疫標識タンパク質の細胞内分布はほとんど共焦点顕微鏡によって、または免疫電子顕微鏡で調べたところ、が、全てではないが、信号の原形質膜上でラベルはほとんど、あるいは全く、タンパク質と細胞体のコンパートメントに小さな小胞に関連する登場細胞表面で。

明確に予測された大きな細胞外ドメインを有するこの推定上の受容体は原形質膜に輸送されることを示すために、我々は、細胞表面上のタンパク質を標識するタンパク質の細胞外部分に生成された抗血清を用いて生細胞のアプローチを採用した。広範なブロッキング工程および透過処理工程により分離示差的に標識された二次抗体の2つのアプリケーションは、この「抗体給餌」アプローチを組み合わせることで、異なるfluorescを有する蛍光標識二次抗体に結合することによって区別タンパク質の2つの異なるプールを識別することができたENTタグ。従って、我々は、細胞表面に残っまたはこの期間中に表面に輸送されたタンパク質のいずれかからの抗体のインキュベーション工程の間にエンドサイトーシスによって内在化されたタンパク質を区別することができた。この方法を用いて、関心対象のタンパク質が神経細胞で細胞表面との間で売買されていることを確立した。そのため、この比較的迅速かつ簡単な手法は、我々はすべてのこれらの技術に同じウサギポリクローナル抗血清を使用しているにもかかわらず、伝統的な免疫細胞化学法または事前に埋め込むイムノゴールド電子顕微鏡よりも多くの情報を証明した。この技術は、細胞外ドメインのエピトープを認識する優れた抗体が利用可能で提供される任意の膜貫通タンパク質に一般的に適用可能である。技術はグルタミン酸受容体のGluR1サブユニット⁵の受容体の輸送を研究するために以前に使用されています。

プロトコル

1。解離した海馬ニューロンの文化

1. カバースリップ（ホウケイ酸ガラス）を準備します。
   1. 100％エタノールで洗浄します。
   2. UV照射下で空気乾燥。
   3. ポリ-D-リジン（4℃で一晩、0.15Mホウ酸緩衝液中で0.5 mg / mlの、）でコーティング。
   4. 次の日（培養日）に対するラミニンでコーティング次いでPBSで3回洗浄し（2.5μgの個/ ml、天然マウスラミニン）で2時間、PBS中に希釈+ 5％（v / v）の熱不活化ウシ胎児血清（FCS） 37℃
2. 胎生18日（E18）ラット海馬を解剖し、カルシウムやマグネシウム、氷上で冷却を含むPBS中に収集します。注：動物に関連するすべての実験プロトコルは、メルボルン大学の動物倫理委員会によって承認された。
3. メーカーの指示に従ってパパイン解離キットからパパインとのDNase I溶液を調製する。
   1. 1ミリリットルパパイン溶液に50μLのDNase I溶液を追加します。
   2. 注：一度まず調製し、パパイン溶液およびDNase I溶液は別々に（それぞれ、パパインおよびDNase I 0.5 mlの25μlのアリコート）を一定分量に分注し、必要になるまで-20℃で保存してもよい。
4. 可能な限り、PBSを削除し、15〜20分間、37℃で1ミリリットルのパパイン/ DNアーゼI溶液（胚1リットルから）海馬をインキュベートする。優しく潜伏期間の間に二度内容物を混合するチューブをフリック。
5. 細胞分散液を得て、もしあれば、いくつかされるまで火炎研磨シリコン処理パスツールピペット10-15Xで軽く海馬組織（気泡の発生を回避すること）を粉末化し、解離していない組織の塊が残っている。
6. （; 1.6.1項を参照HBSS ^+）ハンクス平衡塩類溶液に加え、添加剤中の4％w / vウシ血清アルブミン（BSA）を3mlのクッションの上に解離し、細胞懸濁液を慎重にレイヤ。
   1. 撹拌せずに室温でBSAを溶解させることによってこのステップ勾配溶液を調製2のCaCl _2、1mMの_硫酸マグネシウム、4 mMのNaHCO ₃および40 mMグルコース（HBSS ^+）、4℃で、その後滅菌フィルターや店舗を含むHBSS中の環
7. 遠心分離器、100 XG、スイングアウトローターとベンチトップ遠心機で7分。
8. 細胞ペレットを吸引しないように注意して上清を除去します。
9. 1ミリリットル中に火炎研磨（シリコン処理）パスツールピペット（または1ミリリットル青ピペットチップ）で軽くペレット化した細胞を再懸濁し、完全な神経基本培地（2％B27を、0.5 mM L-グルタミン、1％FCSを添加した）。
10. （唯一の "ライブ"細胞として位相bright細胞をカウントNB）血球計数器を用いて210μlアリコートを数える。
11. 予め調製コーティングされたカバーガラス上でプレート一次ニューロン（12ウェルプレート中の0.75から1×10 ^5月 18日ミリメートルカバースリップ）。メッキの直前に、（下記参照）、カバースリップから過剰なラミニン/血清溶液を吸引し、一次神経細胞培養培地と交換してください。 NBに必要なNカバースリップは、カバースリップのアンバー調製物を培養前の日に開始されるように（ステップ1.1参照）を予め決定する必要がある。
12. 培養ラット初代E18 Neurobasal培地のin vitro（DIV）、2％のB27、1％FCS（熱不活性化）を補足した0.5 mM L-グルタミンで最大21日間、海馬ニューロン。その後7 DIV毎週の半分の培地交換を行う。抗有糸分裂フルオロデオキシウリジン/ウリジン、7 DIVで添加され、各ヌクレオシドの10mMストック）の1/1、000希釈はグリア過剰増殖を防止する。

2。ライブニューロンと抗体インキュベーション

1. 文化の最初の週の間に、神経細胞は、樹状アーバーを開発しているし、週2〜3で、神経細胞はシナプス形成^6,7を受けなければ、十分に成熟してきた。
   1. 選択された実験時間ポイント/ sで、カバーガラス上で、一次胚性神経細胞を含むウェルを三重に対する一次抗体を適用します。直接の培養液中に抗体の分量を追加所望の最終希釈注一次ニューロン：この例では、タンパク質の組換え分泌型に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清をウェルに培養培地1mlを2μLを添加することにより1/500に希釈し、10分間の遠心分離これは、任意の粒子状物質を除去し、背景を減らすことができますように、13,000 XG、RTは前の抗体の分量を取ってに組み込むことができる。
   2. 免疫前血清コントロールの場合、（同じ最終希釈に）免疫前血清と同等の量を追加します。全く免疫前血清が使用できない場合は、神経基本培地またはPBSを等量の（一次抗体なしのコントロール）を追加します。適切な一次抗体は、タンパク質の細胞内領域/秒を認識する利用可能な場合あるいは、この抗体は、表面染色の特異性を試験するために、対照ウェルに添加することができる。
   3. （このインキュベーション期間は経験的に決定されてもよい）1-4時間培養インキュベーター中に細胞を戻す。私たちのexperime中実験計画は、内部化の経時変化を評価するためにウォッシュアウトした後、さらに潜伏期間（パルスチェイス実験）に続いて、抗体のパルスを組み込むことができるが、NTSは、抗体は全期間存在していた。
      OPTIONAL STEP：このインキュベーションは、必要に応じて、基底タンパク質の内在化の速度を遅くするために、室温または氷上でさえ行うことができる。 CO ₂以外_の制御された環境で実行した場合、中、重炭酸塩、抗体/抗血清を添加する前にバッファリングされていないものに変更する必要があります。注意：熟ニューロン培養物（> 14日、特に培養したマウスの胚性神経細胞）が良く、フルメディアの変更を許容しない。
2. 最適な時間は、目的のタンパク質の豊富さに依存だけでなくなりますが、我々は良い結果を1時間、2時間、4時間、この一次抗体の内在化工程のためのインキュベーション時間を使用していたCEL中のタンパク質輸送のダイナミクス研究中のLS。
   NOTE：代表的な結果に示すデュアルカラー画像は、組織培養インキュベーター中、37℃で1時間のインキュベーションで得られた。
3. 所望の期間のインキュベーションの後、抗体含有培地を吸引する。室温で静かに急速に一度、PBSでウェルを洗浄します。

3。固定、非透過細胞への二次抗体のアプリケーション

1. リン酸緩衝液（pH7.2）中の4％パラホルムアルデヒドで神経細胞を固定し、室温（注）で5分：最良の結果を得るために、新たに調製された固定液を使用し、全く沈殿したホルムアルデヒドが明らかでないように交互に-20℃で保存し、完全に解凍されている修正プログラムを使用する。注意：パラホルムアルデヒド固定液を調製し、ドラフト内で処理する必要があります。
2. ウェル（ドラフト内の液体廃棄物容器への転送）から修正を削除し、PBSで3回すすいでください。
   1. オプションのステップ：必要に応じて、抗体試薬を節約するために、カバーグラスは、缶ピンセットで慎重に12ウェルプレートから除去し、使い捨て培養プレートの基部上に敷設パラフィルムのシート上に、細胞側を上向きにして配置される。
   2. 彼らは完全にパラフィルムの上にカバースリップの端に解氾濫なしでカバーされているように、解決策はその後カバースリップの上に静かにピペットでできます。
   3. この技術は、（ 例えば、一晩）加湿チャンバー内で行われるべきであるが、より長いインキュベーション短期インキュベーション（1〜2時間）に適している。代替的に、カバーガラスを一晩のインキュベーションのために戻った12ウェルプレートのウェル内に配置することができ、十分なボリュームがカバースリップが乾燥しないように添加されるべきである。
3. PBS中5％のBSA（：それは細胞が透過処理されないことが重要であるように、この段階でのブロッキング溶液に界面活性剤を追加しないでください）​​を用いて、室温で30分間ブロック。
4. DETECに進む前に、表面タンパク質を標識するためには、内在タンパク質のTiONからは、選択した最初の蛍光標識した2°抗体を適用します。
   注：ここで説明する例では、一次抗血清は、組換え分泌されたアイソフォーム⁴にウサギ（社内抗体）で育ちました。このように、非透過性ニューロンの表面上の膜貫通型アイソフォームの細胞外領域を検出するための第一の二次抗体のために、我々は、ロバ抗ウサギDylight 649（1/200、5％BSAを含有するPBSで希釈）を用いる。これは、使用前に希釈した二次抗体溶液を遠心分離（10分、13,000 XG、RT）することをお勧めします。
5. 室温で2時間撹拌カバースリップをインキュベートする。
6. （ウェル中）洗浄カバーグラスをPBSで2回5分。

4。過剰の非標識2°抗体でブロックする

1. ラベルのない2°抗体を高濃度（> 0.1 mg / ml）をして非透過ニューロンをブロックします。
   1. ラベルのない2°抗体は、種に対して提起されるべき一次抗体を室温で一晩インキュベーションすることによって（この場合はウサギに）上昇させた。
   2. このプロトコルについては、結合affiniPure F _ABフラグメントヤギ抗ウサギIgG（H + L）を、0.13 mg / mlの濃度で使用した。
      注：一晩のインキュベーションは、より短い潜伏期間（2時間）が完全に標識された二次抗体が結合したしなかった一次抗体の完全な遮断のためには不十分であったように非常に重要であることが判明した。
2. （ウェル中）洗浄カバーグラスをPBSで2回5分。
3. このブロッキング工程の後、リン酸緩衝液pH7.2、室温で5分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定後。 （ドラフト内の液体廃棄物容器への転送固定剤）固定液を除去した後、PBS（2×）で洗浄します。

5。第二に蛍光共役2°抗体の透過性と応用

1. 透過処理し、室温テンペ、0.1％トリトン-X-100を含むPBS中の5％BSAで細胞をブロックする30分間rature。
2. ブロッキング溶液を取り外します（カバースリップが乾燥しないように注意しながら）。第二の蛍光コンジュゲート2抗体°異なる蛍光でタグを追加します。
   1. NOTE：これは、共焦点顕微鏡上で利用可能な励起/発光フィルタに応じて、以前に使用したものと、このフルオロフォアタグを区別することが可能でなければならない（以下を参照）。
   2. このプロトコルで提示例えば、アレクサフルーア488結合ロバ抗ウサギ2°抗体（PBS中に1/200、5％BSAおよび0.1％トリトン-X-100）を用いた。室温で2時間インキュベートし、2°抗体溶液を除去します。
3. 洗浄は、PBSで3回5分間カバースリップし、最後に脱イオン水で簡単に洗浄する。

6。取り付けとイメージング

1. マウントは、水性封入剤を含む抗退色（ 例えば VECTASHIELD）でガラススライド上にカバースリップ乾燥させます。 OPのため4℃の暗所に保管して蛍光信号強度のtimal保全。
2. 画像は、共焦点顕微鏡で細胞を免疫染色した。
   1. 2発蛍光シグナルの検出のための適切な励起および発光フィルタが使用可能である必要があります。
   2. 異なる実験条件は、（脱分極^8,9または制御条件下での、内在化率）を比較する場合は、すべて同じ画像取得パラメータを用いて画像化された様々な条件からカバースリップを再現することを確認してください。標準的な関心領域又は得られた画像から涙点の属性（ 例えば、数、大きさ）の集積密度は、次いで、標準的な画像解析ソフトウェア（ 例えば、フィジー/ ImageJは、をMetamorph）を用いて測定することができる。

結果

ここで提示二色蛍光免疫染色技術は、（ 図1に概略的に示されている）生細胞における膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを標識するのに有用である。インキュベーション期間の間に、免疫グロブリンは、アクセス可能なエピトープに結合し、一緒に結合した抗体とタンパク質分子の集団の割合は、エンドサイトーシスされる。また、新たに合成されたタンパク質は、順方向トラ...

ディスカッション

ここに記載の技術は、（Arancibia-Càrcamo らによって検討）細胞表面ビオチン化¹²のものと相補的であり、それは内在化タンパク質の細胞内局在についての情報を保存するための選択方法であり、好適には一次抗体を設け細胞外エピトープは入手可能です。また、経時的なタンパク質輸送/内在化の定量は、タンパク質抽出物を調製する必要なく、（一次抗体と生細胞のイン?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206