Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

Résumé

Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l'anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l'incubation.

Résumé

Afin de démontrer la localisation à la surface cellulaire d'un récepteur transmembranaire putatif dans des neurones en culture, nous avons appelé la protéine sur la surface des neurones vivants avec un anticorps primaire spécifique dirigé contre une portion extracellulaire de la protéine. Étant donné que les récepteurs sont victimes de trafic vers et depuis la surface, si les cellules sont perméabilisées puis après fixation à la fois à la surface cellulaire et la protéine interne sera détecté par le même anticorps secondaire marqué. Ici, nous avons adapté une méthode utilisée pour étudier le trafic de la protéine («d'alimentation d'anticorps») de façon différentielle des protéines de l'étiquette qui a été internalisée par endocytose au cours de l'étape anticorps d'incubation et de protéines qui soit resté sur la surface de la cellule ou est d'un trafic à la surface au cours de cette période, . La capacité de distinguer ces deux groupes de protéines a été rendu possible grâce à l'incorporation d'une étape de blocage pendant la nuit avec l'anticorps secondaire non marqué très concentré après une incubatio initialen des neurones unpermeabilized avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence. Après l'étape de blocage, la perméabilisation des neurones admis détection de la piscine internalisée avec un anticorps secondaire fluorescent marqué avec un fluorophore différent. Grâce à cette technique, nous avons pu obtenir des informations importantes sur la localisation subcellulaire de ce récepteur putatif, révélant qu'il était, en effet, de la traite à la surface cellulaire dans les neurones. Cette technique est largement applicable à toute une gamme de types de cellules et des protéines de surface cellulaire, en fournissant un anticorps approprié à un épitope extracellulaire est disponible.

Introduction

En instituant la fonction des protéines nouvellement identifiées, l'enquête de la localisation subcellulaire et le trafic de la protéine en question peut fournir des indices importants sur le rôle probable / s de ^1,2 de protéine. L'analyse bioinformatique du transcriptome du néocortex développement ³ nous a fourni une liste de gènes présentant une expression altérée au cours de cerveaux de souris corticogenèse. Nous avons alors adopté une approche de coup de grâce de gène de s'assurer que la protéine codée par l'un de ces gènes, sez6, a un rôle clé dans le développement des neurones. Nous avons observé que le gène lié à la saisie-6, ou Sez6, la protéine se trouve dans les dendrites en développement et est également présent dans les épines dendritiques, des structures spécialisées sur les dendrites qui reçoivent et intègrent les signaux excitateurs. De plus, lorsque cette protéine est absente, les dendrites et les synapses excitateurs ne parviennent pas à former correctement ^4. L'isoforme dominante probable de la protéine présente des caractéristiques d'un transmembranrécepteur de l'e, bien que, lors de la distribution subcellulaire de la protéine immuno-a été examinée par microscopie confocale ou par microscopie immuno plupart, sinon la totalité, du signal apparu associé à de petites vésicules dans le compartiment somato-dendritique avec peu ou pas de protéine marquée sur la membrane plasmique à la surface de la cellule.

Afin de montrer définitivement que ce récepteur putatif avec un grand domaine extracellulaire prédit est traite à la membrane plasmique, nous avons adopté une approche de cellules vivantes en utilisant l'antisérum nous avions généré à une portion extracellulaire de la protéine à marquer la protéine à la surface cellulaire. En combinant cette approche "alimentation anticorps" avec deux applications d'anticorps secondaire différentielle marqué séparées par une étape de blocage vaste et une étape de perméabilisation, nous avons pu identifier deux piscines différentes de protéines qui se distinguent par liaison à des anticorps secondaires marqués par fluorescence portant Déess différentetags Ent. Ainsi, nous avons pu distinguer protéine qui avait été intériorisé par endocytose lors de l'étape d'incubation anticorps de la protéine qui soit resté sur la surface de la cellule ou a été victimes de la traite à la surface au cours de cette période. En utilisant cette méthode, nous avons établi que la protéine d'intérêt est un trafic à destination et à partir de la surface cellulaire dans les neurones. Par conséquent, cette technique relativement rapide et simple s'est avéré plus instructif que les méthodes d'immunocytochimie traditionnels ou pré-enrobage microscopie électronique immunologique, malgré le fait que nous avons utilisé le même antisérum polyclonal de lapin pour toutes ces techniques. Cette technique est généralement applicable à n'importe quelle protéine transmembranaire a fourni une bonne anticorps reconnaissant des épitopes de domaines extracellulaires est disponible. La technique a déjà été utilisée pour étudier le trafic de récepteur du récepteur de glutamate GluR1 sous-unité ^5.

Protocole

Une. Dissociée de l'hippocampe Neuron Culture

1. Préparer des lamelles de verre (borosilicate):
   1. Laver à l'éthanol à 100%.
   2. Sécher à l'air sous irradiation UV.
   3. Manteau de Poly-D-lysine (0,5 mg / ml dans un tampon de borate 0,15 M, pendant une nuit à 4 ° C).
   4. Le jour suivant (le jour de la culture), laver 3 fois dans du PBS puis enduire de la laminine (2,5 pg / ml, de la laminine de souris normal) + 5% v / v de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur (FCS) dilué dans du PBS pendant 2 h à 37 ° C.
2. Disséquer embryonnaires jour 18 (E18) hippocampes de rats et de recueillir dans PBS contenant du calcium et du magnésium, refroidi sur glace. REMARQUE: tous les protocoles expérimentaux impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité d'éthique animale de l'Université de Melbourne.
3. Préparer la papaïne et de solutions de DNase I de la papaïne dissociation Kit selon les instructions du fabricant.
   1. Ajouter la solution de 50 ul DNase I à 1 ml de solution de papaïne.
   2. REMARQUE: Une foisd'abord préparée, la solution de papaïne et les solutions DNase I peuvent être distribués séparément en portions aliquotes (0,5 ml et 25 uL d'aliquotes de la papaïne et de la DNase I, respectivement) et stockés à -20 ° C jusqu'à utilisation.
4. Enlever autant que possible PBS et incuber hippocampe (une litière à partir d'embryons) avec 1 ml de papaïne / solution de DNase I à 37 ° C pendant 15 à 20 min. Tapotez doucement le tube pour mélanger le contenu de deux fois au cours de la période d'incubation.
5. Triturer le tissu hippocampique doucement (en évitant la génération de bulles) avec une pipette Pasteur siliconée 10-15x-poli à la flamme jusqu'à ce que la dispersion de la cellule est obtenue et peu, s'il y en a, des morceaux de tissu restent non dissocié.
6. Couche avec précaution la suspension cellulaire dissociée sur un coussin de 3 ml de 4% p / v de sérum albumine bovine (BSA) dans la solution de Hanks Balanced Salt plus additifs (HBSS ^+, voir la section 1.6.1).
   1. Préparer cette solution de gradient par étape en dissolvant le BSA à température ambiante sans agitationanneau dans HBSS contenant 2 mM de _CaCl2, 1 mM MgSO _4, 4 mM NaHCO ₃ et 40 mM de glucose (HBSS ^+), puis filtre stérile et conserver à 4 ° C.
7. Centrifugeuse 100 xg, 7 min dans une centrifugeuse de paillasse avec un rotor swing-out.
8. Retirer le surnageant en prenant soin de ne pas aspirer le culot cellulaire.
9. Remettre en suspension le culot cellulaire en douceur avec une flamme poli (silicone) de pipette Pasteur (ou un bleu pointe de la pipette 1 ml) dans 1 ml de milieu Neurobasal complète (avec 2% de B27, 0,5 mM de L-glutamine supplémenté avec 1% de FCS).
10. Comptez deux aliquotes de 10 ul en utilisant un hématimètre (NB seulement compter les cellules en phase de lustrage et cellules "live").
11. Plate neurones primaires sur des lamelles de verre revêtues préparées à l'avance (0,75-1 x 10 ^5/18 mm lamelle en plaque de 12 puits). Immédiatement avant le placage, aspirer l'excès de solution de laminine / sérique de lamelles et le remplacer par un milieu de culture de neurones primaires (voir ci-dessous). NB Le n requisombre de lamelles doit être déterminé à l'avance que la préparation de la lamelle est commencée la veille de la culture (voir l'étape 1.1).
12. Culture rat primaire E18 Les neurones de l'hippocampe pour jusqu'à 21 jours in vitro (DIV) en milieu Neurobasal, 2% B27, 0,5 mM de L-glutamine additionné de 1% de FCS (inactivé par la chaleur). Effectuer un changement de la moitié de moyenne à 7 DIV et hebdomadaire par la suite. L'anti-mitotique fluorodésoxyuridine / uridine est ajouté à 7 DIV; 1/1, 000 dilution de 10 mM de chaque nucléoside) pour empêcher la prolifération des cellules gliales.

2. Incubation de l'anticorps avec Live neurones

1. Au cours de la première semaine de la culture, les neurones se développent tonnelles dendritiques et par semaine 2-3, les neurones ont suffisamment mûri pour être soumis à la synaptogenèse ^6,7.
   1. Au temps expérimental points / s, appliquer l'anticorps primaire des puits en triple contenant les neurones embryonnaires primaires sur des lamelles. Ajouter une fraction aliquote de l'anticorps directement dans le milieu de culture deles neurones primaires de la dilution finale désiré Remarque: Dans notre exemple, un antisérum polyclonal de lapin dirigé contre une forme sécrétée recombinante de la protéine ont été dilués au 1/500 en ajoutant 2 ul à 1 ml de milieu de culture dans les puits, une centrifugation pendant 10 min , 13 000 xg, RT peut être incorporé avant de prendre une aliquote d'anticorps que cela va enlever toute matière particulaire et peut aider à réduire le fond.
   2. Pour les témoins de sérum pré-immun, ajouter une quantité équivalente de sérum pré-immun (à la même dilution finale). Si pas de sérum pré-immun est disponible, ajouter le volume équivalent de milieu Neurobasal ou PBS (pas de contrôle de l'anticorps primaire). En variante, si un anticorps primaire approprié est disponible qui reconnaît la région intracellulaire / s de la protéine, cet anticorps peut être ajouté à un contrôle de puits dans le but de tester la spécificité de la coloration de la surface.
   3. Remettre les cellules dans l'incubateur de culture pendant 1-4 h (cette période d'incubation peut être déterminée empiriquement). Dans notre experiments, ​​l'anticorps était présent pendant toute la période, bien que la conception expérimentale pourrait incorporer une impulsion d'anticorps suivie d'une autre période d'incubation après lavage de départ (une expérience pulse-chase) afin d'évaluer l'évolution dans le temps de l'internalisation.
      Facultatif: Cette incubation peut être réalisée à température ambiante ou même sur de la glace pour ralentir le taux basal de l'internalisation de la protéine, si nécessaire. Si elle est effectuée dans un environnement non-contrôlé de CO _2, le milieu doit être remplacé par celui qui n'est pas en mémoire tampon bicarbonate avant l'addition de l'anticorps / antisérum. ATTENTION: Les cultures de neurones matures (> 14 jours, et en particulier en culture des neurones embryonnaires de souris) ne tolèrent pas bien les changements de moyennes complets.
2. Nous avons utilisé des temps d'incubation pour cette première étape de l'internalisation des anticorps de 1 h, 2 h et 4 h avec de bons résultats bien que le temps optimal dépend de l'abondance de la protéine d'intérêt ainsi que la dynamique de la traite des protéines dans la cells à l'étude.
   REMARQUE: Les images à deux couleurs représentées sur résultats représentatifs ont été obtenus avec une incubation de 1 heure à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire.
3. Après incubation pendant la période désirée, aspirer hors du milieu contenant l'anticorps. Laver les puits en douceur mais rapidement une fois avec du PBS à température ambiante.

3. Demande d'anticorps secondaire de cellules fixes, Unpermeabilized

1. Fixer les neurones avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate pH 7,2, 5 min à température ambiante Remarque: pour de meilleurs résultats, utilisez fixateur fraîchement préparé; également utiliser correctif qui a été stocké à -20 ° C et complètement décongelés afin que personne ne paraformaldéhyde précipité est évident . ATTENTION: fixateur Paraformaldéhyde doit être préparé et manipulé dans une hotte.
2. Retirer correctif à partir de puits (transfert de conteneur de déchets liquides dans une hotte) et rincer 3 fois avec PBS.
   1. Facultatif: Si vous le souhaitez, pour économiser sur les réactifs d'anticorps, les lamelles peuventêtre soigneusement retirée de la plaque de 12 puits avec une pince et placé du côté de la cellule-haut, sur une feuille de Parafilm prévue sur la base d'une plaque de culture jetable.
   2. Les solutions peuvent alors être déposés à la pipette doucement sur les lamelles couvre-objet de sorte qu'elles soient complètement couvertes sans l'injection d'une solution sur le bord de la lamelle couvre-objet sur le Parafilm.
   3. Cette technique est appropriée pour des incubations à court terme (1-2 h), cependant plus incubations (par exemple la nuit) devraient être effectuées dans une chambre humidifiée. En variante, les lamelles peuvent être placés de nouveau dans les puits de la plaque à 12 puits pour l'incubation pendant une nuit et un volume suffisants doivent être ajoutés afin de s'assurer que les lamelles ne se dessèchent pas.
3. Bloc pendant 30 min à température ambiante avec 5% de BSA dans du PBS (Remarque: Ne pas ajouter de détergent à la solution de blocage à ce stade, car il est important que les cellules ne sont pas perméabilisées).
4. Afin de marquer la protéine de surface avant de procéder à la détectiontion de la protéine intériorisée, appliquer le premier marqué par fluorescence 2 ° anticorps de choix.
   Remarque: Dans l'exemple décrit ici, l'antisérum primaire a été soulevée dans le lapin (anticorps en interne) à une isoforme sécrétée recombinante ^4. Ainsi, pour le premier anticorps secondaire pour détecter la région extracellulaire de l'isoforme transmembranaire à la surface des neurones unpermeabilized, nous avons utilisé âne anti-lapin DyLight 649 (1/200 dilué dans du PBS contenant 5% de BSA). Il est recommandé de centrifuger les solutions d'anticorps secondaire dilué (10 min, 13 000 xg, RT) avant de les utiliser.
5. Incuber les lamelles pendant 2 h à température ambiante.
6. Lavez lamelles (dans les puits), 2x 5 min avec du PBS.

4. Blocage avec excès vierge 2 ° anticorps

1. Bloquer les neurones unpermeabilized avec une forte concentration (> 0,1 mg / ml) de non marqué anticorps 2 °.
   1. L'anticorps 2 ° sans étiquette devrait être soulevée contre l'espèce dans laquellel'anticorps primaire a été élevée (dans ce cas le lapin) par incubation pendant une nuit à température ambiante.
   2. Pour ce protocole, un fragment F _ab AffiniPure Chèvre anti-lapin IgG (H + L) a été utilisé à une concentration de 0,13 mg / ml.
      NOTE: L'incubation d'une nuit a été jugé essentiel comme une période d'incubation plus court (2 heures) était insuffisante pour permettre un blocage complet de l'anticorps primaire qui n'a pas été entièrement fixé par l'anticorps secondaire marqué.
2. Lavez lamelles (dans les puits), 2x 5 min avec du PBS.
3. Après cette étape de blocage, après la fixation des cellules avec du paraformaldéhyde 4% dans un tampon phosphate pH 7,2, 5 min à température ambiante. Rincer avec du PBS (2x) après élimination du fixateur (transfert fixateur de réservoir de déchets liquides dans une hotte).

5. Perméabilisation et l'application de la deuxième fluorescence conjugué 2 ° anticorps

1. Et bloquer perméabiliser les cellules avec 5% de BSA dans du PBS contenant 0,1% de Triton-X-100 à la chambre temperature pendant 30 min.
2. Retirer la solution de blocage (en prenant soin de ce que les lamelles ne se dessèchent pas). Ajouter la 2 ° anticorps deuxième fluorescence conjugué marqué avec un fluorophore différent.
   1. REMARQUE: Il doit être possible de distinguer ce tag fluorophore de celui précédemment utilisé, en fonction des filtres d'excitation / émission disponibles sur le microscope confocal (voir ci-dessous).
   2. Pour l'exemple présenté dans ce protocole, un Alexa Fluor 488 âne conjugué anti-lapin 2 ° anticorps a été utilisé (1/200 dans du PBS, 5% de BSA et 0,1% de Triton-X-100). Incuber 2 heures à température ambiante, puis retirer la solution d'anticorps de 2 °.
3. Lavage des lamelles couvre-3x 5 min avec du PBS et, enfin, se laver rapidement à l'eau déminéralisée.

6. Montage et imagerie

1. Mont lamelles couvre sur des lames de verre avec un milieu contenant de montage antifade aqueuse (par exemple Vectashield) et laisser sécher. Conserver dans l'obscurité à 4 ° C pour oppréservation de timal de l'intensité du signal fluorescent.
2. Image en immunocolorée cellules sur un microscope confocal.
   1. Excitation et d'émission des filtres appropriés pour la détection des deux signaux de fluorophores doivent être disponibles.
   2. Si différentes conditions expérimentales doivent être comparés (par exemple, les taux d'internalisation de moins de ^8,9 dépolarisés ou les conditions de contrôle), veiller à ce que tous reproduisent des lamelles de différentes conditions sont imagées avec les mêmes paramètres d'acquisition d'images. La densité intégrée des régions standards d'intérêt ou les attributs de punctas (nombre, taille) des images résultant peut alors être mesurée en utilisant un logiciel d'analyse d'image standard (par exemple Fidji / ImageJ, Metamorph).

Résultats

La technique d'immuno-coloration fluorescente bicolore présenté ici est utile pour le marquage des domaines extracellulaires des protéines transmembranaires dans des cellules vivantes (représenté schématiquement sur ​​la figure 1). Au cours de la période d'incubation, les immunoglobulines se lient les épitopes accessibles et une proportion de la population de molécules de protéine, conjointement avec l'anticorps lié, est endocytose. En outre, la protéine nouvellement synthét...

Discussion

La technique décrite ici est complémentaire de celle de la biotinylation de la surface cellulaire (passé en revue par ARANCIBIA-carcamo et al.) ¹² et elle est la méthode de choix pour la conservation de l'information au sujet de la localisation subcellulaire de la protéine internalisé, pourvu d'un anticorps primaire approprié pour une épitope extracellulaire est disponible. En outre, la quantification du trafic de protéines / internalisation au fil du temps peut être effectué (en f...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206