라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

요약

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

초록

배양 된 신경에있는 추정상의 막 관통 수용체의 세포 표면 지역화을 입증하기 위해, 우리는 단백질의 세포 외 부분에 대해 발생하는 특정 일차 항체와 라이브 뉴런의 표면에 단백질을 표지. 세포를 고정 후 다음 세포 표면 및 내부 단백질이 동일한 레이블 차 항체에 의해 감지됩니다 permeabilized 경우 수용체가 표면과에서 인신 매매되는 것을 감안할 때. 여기서, 우리는 하나가 세포 표면에 남아 또는이 기간 동안 표면에 매매 된 항체 인큐베이션 단계와 단백질 중에 엔도 사이토 시스에 의해 내부화 되었었다 라벨 단백질을 차별적으로하는 단백질 매매 ( "항체 수유")을 연구하기 위해 사용되는 방법을 채택 . 단백질의 두 가지 풀을 구별하는 기능은 초기 incubatio 후 고농도의 레이블이없는 차 항체와 하룻밤 차단 단계의 결합을 통해 가능하게되었다형광 표지 된 이차 항체와 unpermeabilized 뉴런의 명. 다른 형광으로 표지 된 형광 차 항체로 내면화 풀의 검출을 허용하는 신경의 차단 단계, permeabilization 후. 우리는 그것이라고 밝혀,이 추정되는 수용체의 세포 내 위치에 대한 중요한 정보를 얻을 수가이 기술을 사용하여, 참으로, 신경 세포의 세포 표면에 인신 매매. 이 기술은 세포 에피토프에 적합한 항체를 제공하고, 세포의 종류와 세포 표면 단백질의 범위에 광범위하게 적용 할 수있는 것은 사용할 수 있습니다.

서문

새로 확인 된 단백질의 기능을 확립, 문제의 단백질의 세포 내 현지화 및 인신 매매의 조사는 단백질 ^1,2의 가능성이 역할 / S에 대한 중요한 단서를 제공 할 수 있습니다. 개발 신피질 ^3의 사체의 생물 정보학 분석은 마우스의 뇌 corticogenesis 동안 변경 발현을 보이는 유전자의 목록을 우리에게 제공했다. 우리는 이들 유전자 중 하나 sez6에 의해 코드되는 단백질이 신경 세포의 개발에 중요한 역할을하고 있음을 확인하기 위해 유전자 녹아웃 방식을 채택했다. 우리는 발작 관련 유전자 6, Sez6, 단백질이 개발 수상 돌기에 있으며 또한 돌기 쪽, 수신 및 흥분성 신호를 통합하는 수상 돌기에 전문 구조에 존재하는 것을 관찰했다. 이 단백질이 결여되는 경우 또한, 덴 드라이트 및 흥분성 시냅스 올바르게 ^(4)을 형성하지 못한다. 단백질의 가능성이 지배적 인 이소는 transmembran의 기능을 가지고 있습니다전자 수용체 immunolabeled 단백질의 세포 내 분포를 공 초점 현미경으로 또는 면역 전자 현미경으로 검사했을 때, 비록 전부는 아니더라도 대부분 신호의 세포막에 표시된 거의, 또는 전혀, 단백질 somatodendritic 구획에있는 작은 소포와 관련된 등장 세포 표면으로.

결정적 예측 대형 세포 외 도메인이 추정되는 수용체는 세포막에 매매되는 것을 보여주기 위하여, 우리는 세포 표면 단백질에 라벨 단백질의 세포 외 부분에 생성 한 항혈청을 사용하여 살아있는 세포 접근법을 채택 하였다. 광범위한 차단 단계와 permeabilization 단계로 구분하여 차별적으로 표지 된 이차 항체의 두 응용 프로그램이 "항체 공급"접근 방식을 결합함으로써, 우리는 형광 표지 된 이차 항체가 다른 fluoresc 베어링 바인딩에 의해 구별 단백질의 두 가지 풀을 식별 할 수 있었다천만에 태그. 따라서, 우리는 하나가 세포 표면에 남아 또는이 기간 동안 표면에 매매 된 단백질로부터의 항체 배양 단계 동안 엔도 사이토 시스에 의해 내부화 되었었다 단백질을 구별 할 수 있었다. 이 방법을 사용하여, 우리는 또한 단백질이 신경 세포에서 세포 표면에과에서 매매되도록 설치했다. 따라서이 비교적 빠르고 간단한 기술은 우리가 이러한 기술에 대해 동일한 토끼 폴리 클로 날 항혈청을 사용한다는 사실에도 불구하고, 기존의 면역 세포 화학 방법 또는 사전 내장 immunogold 전자 현미경보다 더 많은 정보를 증명했다. 이 기술은 세포 외 도메인의 항원을 인식하는 좋은 항체를 사용할 제공하는 횡단 단백질에 일반적으로 적용 할 수있다. 이 기술은 글루타민산 염 수용체에 대한 GluR1 서브 유닛 ⁵ 수용체 인신 매매를 연구하기 위해 이전에 사용되었습니다.

프로토콜

1. 해리 해마 신경 세포 문화

1. 커버 슬립 (붕규산 유리)를 준비 :
   1. 100 % 에탄올로 세척 할 것.
   2. UV 조사에 따라 공기 건조.
   3. 폴리-D-라이신 (4 박 ° C에서 0.15 M 붕산 버퍼에 0.5 ㎎ / ㎖)와 코트.
   4. 다음 날 (문화의 날) 라미닌으로 다음 코트 PBS에서 3 회 세척에 (2.5 ㎍ / ㎖, 자연 마우스 라미닌) + 5 % V / V를 열 - 불 활성화 된 태아 혈청 (FCS) 2 시간에 대한 PBS에 희석 37 ° C.
2. 배아 일 18 일 (E18) 쥐의 해마를 해부하고 칼슘과 마그네슘, 얼음에 냉장을 포함하는 PBS로 수집합니다. 주 : 동물을 포함한 모든 실험 프로토콜 멜버른 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다.
3. 제조업체의 지침에 따라 파파인 해리 키트 파파인과 DNA 분해 효소 I 솔루션을 준비합니다.
   1. 1 ㎖ 파파 용액에 50 ㎕의 DNA 분해 효소의 I 솔루션을 추가합니다.
   2. 참고 : 한 번첫 번째 준비, 파파인 솔루션과 DNA 분해 효소 I 솔루션은 개별적으로 (각각, 파파인과 DNA 분해 효소 I 0.5 ㎖ 및 25 ㎕의 분취 량)을 분취에 분배하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
4. 가능한 한 많은 PBS를 제거하고 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 1 ㎖ 파파 / DNA 분해 효소 I 솔루션 (배아의 한 쓰레기부터) 해마를 품어. 조심스럽게 배양 기간 동안 두 번 내용을 혼합 튜브를 가볍게.
5. 세포의 분산을 얻을 및있는 경우, 몇 때까지 불꽃 연마 실리콘 처리 파스퇴르 피펫 10 - 15 배에 부드럽게 해마 조직 (기포의 생성을 방지)를 씹다, 해리되지 않은 조직의 덩어리가 남아 있습니다.
6. 정중 행크스 균형 염 용액 플러스 첨가제 V 소 혈청 알부민 (BSA) / w 4 % 3 ㎖ 쿠션 위에 해리 된 세포 현탁액을 계층 (HBSS ^+; 섹션 1.6.1 참조).
   1. 교반없이 실온에서 BSA를 용해하여이 단계 구배 용액을 준비2 mM의 _{염화칼슘,} 1 ㎜ _망초, 4 mM의 _탄산 수소 나트륨과 40 mM의 포도당 (HBSS ⁺⁾ 4 ℃에서 후 살균 필터 및 저장을 포함 HBSS에 링
7. 원심 분리기 100 XG, 스윙 아웃 로터 벤치 톱 원심 분리기에서 7 분.
8. 상층 액은 세포 펠렛을 대기음하지 않도록주의하고 제거합니다.
9. 1 ml의 불꽃 연마 (실리콘 처리) 파스퇴르 피펫 (또는 1 ㎖ 블루 피펫 팁)으로 가볍게 펠렛 세포를 재현 탁 완료 Neurobasal 매체 (2 % B27와 함께, 0.5 ㎜의 L-글루타민 1 % FCS로 보충).
10. (만 "라이브"세포로 위상 밝은 세포를 계산 NB) 혈구를 사용하여 두 개의 10 μL 분취를 계산합니다.
11. preprepared 코팅 된 유리 커버 슬립 (12 웰 플레이트에 0.75-1 X 10 ⁵ / 18mm의 coverslip에)에 대한 기본 뉴런 플레이트. (아래 참조) 직전에 도금, 커버 슬립에서 초과 라미닌 / 혈청 솔루션을 기음과 주요 신경 세포 배양 배지로 교체. NB 필요한 N커버 슬립의 엠버는 coverslip에 준비가 이전의 문화에 일 시작 될 때 (단계 1.1 참조)를 미리 결정해야합니다.
12. 문화 쥐 차 E18 Neurobasal 매체 체외 (DIV), 2 % B27, 1 % FCS (열 불 활성화)로 보충 0.5 밀리미터 L-글루타민에서 최대 21 일 동안 해마의 신경 세포. 그 후부터는 매주 7 DIV와에 반 매체 변경을 수행합니다. 항 유사 분열 플루오로 데 옥시 우리 딘 / 딘은 7 DIV에 추가되며 각 뉴 클레오 시드의 10 mM의 주식)의 1 / 1, 000 희석 아교 세포 증식을 방지 할 수 있습니다.

2. 라이브 신경 세포와 항체 배양

1. 문화의 첫 주 동안, 신경 돌기 아버을 개발하고 일주일에 2-3로, 뉴런은 시냅스의 ^6,7을 진행해야하기에 충분히 성숙했다.
   1. 선택된 실험 시점 / s에서, 커버 슬립에 기본 배아 신경 세포를 포함하는 우물을 세중하는 일차 항체를 적용합니다. 직접의 문화 매체에 항체의 나누어지는 추가원하는 최종 희석 참고 차 뉴런 :이 예에서, 단백질의 재조합 분비 형태에 대해 제기 토끼 폴리 클로 날 항혈청은 잘에서 배지 1 ㎖로 2 μl를 첨가하여 1 / 500로 희석 된, 10 분 동안 원심 분리 13,000 XG, RT 전에이 같은 항체의 분취 량을 복용에 통합 될 수있는 것은 모든 입자상 물질을 제거하고 배경을 줄일 수 있습니다.
   2. preimmune 혈청 컨트롤의 경우, (같은 최종 희석) preimmune 혈청의 상당 금액을 추가합니다. 제공된 preimmune 혈청이없는 경우, Neurobasal 배지 또는 PBS의 등가 체적 (아니오 차 항체 제어)를 추가한다. 적절한 일차 항체는 단백질의 세포 내 영역 / 해제를 인식 가능한 경우 그 대안으로,이 항체는 잘 표면 염색의 특이성을 시험하기 위해 제어에 첨가 될 수있다.
   3. 1-4 시간의 문화 인큐베이터로 세포를 반환 (이 배양 기간은 경험적으로 결정될 수있다). 우리 experime에서실험 설계가 내면화의 시간 과정을 평가하기 위해 세척 아웃 후 추가 배양 기간 (펄스 추적 실험) 다음 항체의 펄스를 통합 할 수 있지만 국세청, 항체는 전체 기간 동안 존재했다.
      OPTIONAL STEP : 본 배양은 필요한 경우, 기저 단백질의 내재화 속도를 늦추기 위해 실온 또는 얼음 위에서 수행 될 수있다. 비-CO ₂ 제어 된 환경에서 수행하는 경우, 매체는 중탄산염 항체 / 항혈청의 첨가 전에 버퍼링되지 않는 한 변경되어야한다. 주의 : 성숙한 신경 세포 배양 (> : 14 일, 특히 배양 된 배아의 신경 세포)도 전체 매체 변경을 허용하지 않습니다.
2. 최적의 시간은 그 단백질의 풍부에 따라뿐만 아니라 않더라도 우리는 좋은 결과를 1 시간, 2 시간, 4 시간이 기본 항체 국제화 단계 배양 시간을 사용했습니다 CEL에있는 단백질 인신 매매의 역 동성연구중인 LS.
   참고 : 대표 결과에 표시되는 듀얼 컬러 이미지는 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간의 배양으로 얻을 수 있었다.
3. 원하는 기간 동안 배양 한 후, 항체 함유 매체를 대기음. 실온에서 PBS로 가볍게하지만 빠른 속도로 한 번 우물을 씻으십시오.

3. 고정, Unpermeabilized 세포에 이차 항체의 응용

1. 인산염 완충액 pH를 7.2에서 4 % 파라 포름 알데히드와 신경 세포를 수정, 실온 주에서 5 분 : 최상의 결과를 위해, 새로 제조 된 정착액을 사용하여, 더 침전 파라 포름 알데히드가 분명하지 않도록 대안 -20 ° C에 저장하고 완전 해동 된 수정 프로그램을 사용 . 주의 : 파라 포름 알데히드 정착 준비하고 흄 후드에서 처리되어야한다.
2. 우물 (흄 후드에서 액체 폐기물 용기로 전송)에서 수정 프로그램을 제거하고 PBS로 3 회 씻어.
   1. 선택적 단계 : 원하는 경우, 항체 시약을 절약하기 위해, 커버 슬립을 할 수신중하게 집게로 12 - 웰 플레이트에서 제거하고 처분 할 수있는 문화 판의 기지에 배치 파라 필름의 시트에, 셀 사이드 업을 배치.
   2. 그들이 완전히 파라 필름 상에 커버 슬립의 가장자리 위로 용액 범람없이 적용되도록 해법은 커버 슬립 상에 부드럽게 피펫 팅 될 수있다.
   3. 이 기술은 (예를 들면 밤새) 가습 챔버 내에서 수행되어야하지만 이상 배양 단기간 배양 (1-2 시간)에 적합하다. 대안 적으로, 커버 슬립 위로 밤새 인큐베이션 충분한 볼륨의 12 - 웰 플레이트의 웰에 배치 될 수 커버 슬립이 건조하지 않도록 추가되어야한다.
3. PBS에서 5 % BSA (: 그것은 세포가 permeabilized되지 않습니다 중요하기 때문에이 단계에서 차단 솔루션에 세제를 추가하지 마십시오)와 실온에서 30 분 동안 차단합니다.
4. 검 색을 진행하기 전에 표면 단백질에 레이블을하기 위해내면화 된 단백질의 기는 선택의 첫 번째 찬란 2 ° 항체를 적용합니다.
   참고 : 여기에 설명 된 예에서 기본 항혈청 재조합 분비 이소 ⁴ 토끼 (사내 항체)에서 제기되었다. 따라서 unpermeabilized 뉴런의 표면에 막 횡단 이소 형의 세포 외 영역을 검출하는 제 차 항체에 대해, 우리는 당나귀 항 - 토끼 Dylight 649 (5 % BSA를 함유하는 PBS에 희석 1 / 200)을 사용. 그것은 사용하기 전에 희석 차 항체 솔루션 (10 분 13,000 XG, RT)을 원심 분리하는 것이 좋습니다.
5. 실온에서 2 시간 동안 커버 슬립을 배양한다.
6. PBS와 (우물)의 coverslips를 세척, 배 5 분.

4. 초과 레이블이없는 2 ° 항체로 차단

1. 레이블이없는 2 ° 항체의 높은 농도 (> 0.1 ㎎ / ㎖)와 unpermeabilized 신경을 차단합니다.
   1. 레이블이없는 2 ° 항체 종에 대해 제기되어야하는차 항체는 실온에서 배양 밤새 (이 경우 토끼) 제기됐다.
   2. 이 프로토콜의 경우, F AffiniPure _{AB 단편} 염소 항 - 토끼의 IgG (H + 용의 L)가 0.13 ㎎ / ㎖의 농도로 사용 하였다.
      참고 : 하룻밤 배양이 짧은 잠복기 (2 시간)와 같은 중요한 것으로 나타났다 완전히 표시 이차 항체에 의해 구속되지 않은 차 항체의 완전 차단을 위해 충분했다.
2. PBS와 (우물)의 coverslips를 세척, 배 5 분.
3. 이 차단 단계 후, 인산염 완충액 pH가 7.2, 실온에서 5 분의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 후 고정합니다. (흄 후드에서 액체 폐기물 용기로 전송 정착액) 정착액 제거 후 PBS (2X)로 씻어.

5. 둘째 찬란 복합 2 ° 항체의 Permeabilization 및 응용 프로그램

1. 투과 룸 템피에서 0.1 % 트리톤 - X-100을 함유하는 PBS에서 5 % BSA와 세포를 차단30 분 동안 rature.
2. 차단 솔루션 (커버 슬립이 건조하지 않도록주의하면서)를 제거합니다. 다른 형광 태그 두 번째 찬란 - 복합 2 ° 항체를 추가합니다.
   1. 주 : (아래 참조) 공 초점 현미경에서 사용 가능한 여기 / 방출 필터에 따라, 이전에 사용 하나에서이 형광 태그를 구별 할 수 있어야한다.
   2. 이 프로토콜에 제시된 예를 들어, 알렉사 플 루어 488 - 복합 당나귀 안티 - 토끼 2 ° 항체 (1 / PBS에서 200, 5 % BSA, 0.1 % 트리톤 - X-100)을 사용 하였다. 실온에서 2 시간을 품어 후 2 ° 항체 솔루션을 제거합니다.
3. 세척 PBS로 3 배 5 분을 커버 슬립과, 마지막으로, 탈 이온수로 간단히 세척한다.

6. 설치 및 이미징

1. 마운트 수성 장착 매체 포함 antifade (예 VECTASHIELD)와 유리 슬라이드에 coverslips를 건조 할 수 있습니다. 영업 이익은 4 ° C에서 어둠에 보관형광 신호 강도의 timal 보존.
2. 이미지는 공 초점 현미경 세포를 면역 염색.
   1. 두 형광 신호의 검출에 적합한 여기 및 방출 필터를 사용할 수 있어야합니다.
   2. 다른 실험 조건 (감극 ^8,9 또는 제어 상태에서 예를 들어, 내재화 비율) 비교 될 경우, 모두 동일한 이미지 수집 매개 변수를 이미지화하는 다양한 조건에서의 coverslips를 복제했는지 확인하십시오. 표준 관심 영역 또는 결과 이미지에서 puncta에 특성 (예 번호, 크기)의 집적 밀도는 표준 이미지 분석 소프트웨어 (예 피지 / ImageJ에, Metamorph의)을 사용하여 측정 할 수있다.

결과

여기에 제시된 가지 색의 형광 면역 염색 기법 (그림 1에 개략적으로 도시) 살아있는 세포의 막 횡단 단백질의 세포 외 도메인을 라벨에 유용합니다. 인큐베이션 기간 동안, 면역 글로불린은 액세스 에피토프에 결합하고 함께 결합 된 항체와 단백질 분자의 인구의 비율은, endocytosed된다. 또, 새로 합성 된 단백질은 순방향 매매를 통해 세포 표면에 도달 할 수 있고, 재활용 단백질 분자?...

토론

여기에 설명 된 기술은 (가 Arancibia-Càrcamo 등. 리뷰) 세포 표면의 바이오 티 닐화 ^(12)의 보완이며 그것은 내면화 단백질의 세포 내 현지화에 대한 정보를 보존하기위한 선택의 방법, 적절한 일차 항체에 제공 세포 에피토프를 사용할 수 있습니다. 또, 시간 경과에 단백질 매매 / 내재화의 정량 단백질 추출물을 준비 할 필요없이 (일차 항체와 생균 배양에 걸쳐 서로 다른 시간에 커버 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206