תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

Summary

אנו מתארים שיטה לתייג חלבון על פני השטח של תאי עצב חיים באמצעות נוגדן polyclonal ספציפי לאפיטופים תאיים. החלבון קשור בנוגדן על פני התא, ולאחר מכן הפנים באמצעות אנדוציטוזה ניתן להבחין בין החלבון שנותר ב, או נסחרים ל, את פני השטח במהלך הדגירה.

Abstract

על מנת להדגים את הלוקליזציה של הקולטן הטרנסממברני המשוערת בנוירונים בתרבית על פני קרום התא, שכינינו את החלבון על פני השטח של תאי עצב חיים עם נוגדן ראשוני ספציפי שהועלה נגד חלק תאי של החלבון. בהתחשב בכך שקולטנים נסחרים ולמפני השטח, אם תאי permeabilized לאחר קיבוע אז גם על פני קרום התא והחלבון פנימי יזוהו על ידי אותו נוגדנים משני שכותרתו. כאן, אנו מותאמים שיטה המשמשת ללימודי סחר בחלבון ("האכלת נוגדן") לדיפרנציאלי חלבון תווית שהופנם על ידי אנדוציטוזה במהלך שלב הדגירה נוגדנים והחלבונים שגם נשאר על פני התא או נסחר אל פני השטח בתקופה זו . היכולת להבחין בין שתי בריכות של חלבון אלה התאפשרה באמצעות השילוב של צעד חסימת לילה עם נוגדנים משני ללא תווית מרוכזת מאוד לאחר אינקובטורים ראשונייםn של נוירונים unpermeabilized עם נוגדנים משני fluorescently שכותרתו. לאחר חסימת הצעד, permeabilization של נוירונים אפשרו זיהוי של הבריכה הפנימה עם נוגדנים משני ניאון שכותרתו עם fluorophore שונה. השימוש בטכניקה זו היינו יכול לקבל מידע חשוב על מיקום subcellular של קולטן המשוערת זו, חושף כי זה היה, אכן, נסחרים לעל פני קרום התא בתאי עצב. טכניקה זו היא החלים רחבה למגוון של סוגי תאים וחלבונים על פני קרום התא, מתן נוגדן מתאים לאנטיגן תאי הוא זמין.

Introduction

בהקמת הפונקציה של חלבונים שזוהו לאחרונה, חקירה של הלוקליזציה וסחר subcellular של החלבון מדובר יכולה לספק רמזים חשובים על התפקיד / ים הסביר של ^1,2 החלבון. ניתוח bioinformatic של transcriptome של הניאוקורטקס פיתוח ³ סיפק לנו רשימה של גנים תערוכת ביטוי השתנה במהלך corticogenesis מוח עכבר. לאחר מכן, אנו אימצנו גישת נוקאאוט הגנטי כדי לוודא שהחלבון מקודד על ידי אחד מהגנים האלה, sez6, יש לו תפקיד מפתח בהתפתחות תאי עצב. אנו הבחנו כי הגן הקשור לתפיסה 6, או Sez6, החלבון ממוקם בדנדריטים פיתוח ונוכח גם בקוצים הדנדריטים, מבנים מיוחדים על דנדריטים שיקבלו ולשלב אותות מעוררים. יתר על כן, כאשר חלבון זה הוא חסר, דנדריטים וסינפסות המעוררות לא מצליחים ליצור בצורה נכונה ^4. יש איזופורם הדומיננטי הסביר של חלבון תכונות של transmembranקולט דואר אם כי, כאשר חלוקת subcellular של חלבון immunolabeled נבדקה על ידי מיקרוסקופיה confocal או על ידי מיקרוסקופ immunoelectron רוב, אם לא כולם, של האות הופיעה קשור עם שלפוחיות קטנות בתא somatodendritic עם מעט, או לא, חלבון הנקרא על קרום הפלזמה על פני התא.

כדי להראות בודאות כי קולטן המשוערת זה עם תחום תאי גדול ניבא הוא נסחר קרום הפלזמה, אימצנו גישה לחיות תאים באמצעות נסיוב היינו נוצר לחלק החוץ תאי של החלבון לתייג חלבון על פני שטח התא. על ידי שילוב של גישה זו "נוגדני האכלה" עם שני יישומים של נוגדנים משני באופן דיפרנציאלי שכותרתו מופרדים על ידי צעד חסימה נרחב וצעד permeabilization, היינו יכול לזהות שתי בריכות שונות של חלבון מכובד על ידי קשירה לנוגדנים משני fluorescently שכותרתו נושאים fluoresc שונהתגיות אף אוזן גרון. לפיכך, היינו יכול להבחין חלבון שהופנם על ידי אנדוציטוזה במהלך שלב הדגירה נוגדן מחלבון כי גם נשאר על פני התא או נסחר אל פני השטח בתקופה זו. באמצעות שיטה זו, הקמנו שהחלבון של עניין הוא נסחר ומתא השטח בתאי עצב. לכן, טכניקה יחסית מהירה ופשוט זה הוכיחה יותר אינפורמטיבי יותר מאשר שיטות immunocytochemistry מסורתיות או במיקרוסקופ אלקטרונים immunogold מראש הטבעה, למרות שהשתמשנו באותו נסיוב הארנב polyclonal לכל הטכניקות הללו. טכניקה זו היא בדרך כלל החלה על כל חלבון הטרנסממברני סיפקה נוגדן טוב להכיר אפיטופים תחום תאיים הוא זמין. הטכניקה הייתה בשימוש בעבר כדי ללמוד סחר בקולטן של למקטע GluR1 קולטן הגלוטמט ^5.

Protocol

1. ניתק בהיפוקמפוס Neuron תרבות

1. הכן את coverslips (זכוכית ורוסיליקט):
   1. שטוף ב100% אתנול.
   2. אוויר יבש תחת קרינת UV.
   3. מעיל עם פולי-D-ליזין (0.5 מ"ג / מיליליטר ב0.15 M חיץ borate, הלילה בשעה 4 ° C).
   4. ביום למחרת (היום של תרבות) לשטוף 3x ב PBS אז מעיל עם laminin (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר, laminin עכבר טבעי) + 5% בסרום v v / חום מומת עוברי עגל (FCS) מדולל PBS לשעה 2 ב 37 ° C.
2. לנתח hippocampi חולדה יום 18 (E18) העוברית ולאסוף לתוך PBS המכיל סידן ומגנזיום, מקורר בקרח. הערה: כל פרוטוקולי הניסוי כרוכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים מאוניברסיטת מלבורן.
3. הכן את פפאין ופתרונות DNase אני מקיט פפאין דיסוציאציה על פי הוראות היצרן.
   1. הוסף 50 μl אני DNase פתרון לפתרון מיליליטר פפאין 1.
   2. הערה: ברגעהכינו ראשון, פתרון פפאין ופתרוני DNase אני יכול להימכר בנפרד לaliquots (0.5 מיליליטר ו25 aliquots μl לפפאין ואני DNase, בהתאמה) ומאוחסנים ב -20 ° C עד צורך.
4. להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר ודגירת hippocampi (מהמלטה אחת של עוברים) עם פפאין 1 מיליליטר / DNase אני פתרון ב37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות. בעדינות קפיצית הצינור לערבב את התוכן פעמיים בתקופת הדגירה.
5. Triturate הרקמות בהיפוקמפוס בעדינות (הימנעות הדור של בועות) עם טפטפת 10-15x פסטר siliconized להבה מלוטשת עד פיזור תאים מתקבל וכמה, אם בכלל, נתחים של רקמת undissociated יישארו.
6. שכבה בזהירות את ההשעיה התא ניתק מעל כרית 3 מיליליטר של 4% w / אלבומין בסרום שור v (BSA) בפתרון הנקס מלח מאוזן בתוספת תוספים (HBSS ^+; ראה סעיף 1.6.1).
   1. הכן פתרון הדרגתי שלב זה על ידי המסת BSA בטמפרטורת חדר ללא מערבביםטבעת בHBSS המכילה 2 מ"מ CaCl _2, 1 מ"מ MgSO _4, 4 מ"מ NaHCO ₃ ו40 גלוקוז מ"מ (HBSS ⁺⁾ ואז סינון סטרילי ולאחסן ב 4 ° C.
7. צנטריפוגה, 100 XG, 7 דקות בצנטריפוגה ספסל העליונה עם הרוטור את הנדנדה.
8. הסר את supernatant נזהר שלא לשאוב את התא גלולה.
9. Resuspend תאי pelleted בעדינות עם מלוטש להבה (siliconized) פיפטה פסטר (או קצה פיפטה כחול 1 מיליליטר) ב 1 מיליליטר בינוני Neurobasal מלא (עם 2% B27, L-גלוטמין 0.5 מ"מ בתוספת 1% FCS).
10. לספור שני aliquots 10 μl באמצעות hemocytometer (NB רק לספור תאי שלב בהיר כמו תאים "חיים").
11. פלייט נוירונים עיקרי על coverslips preprepared המצופה הזכוכית (.75-1 x 10 ^5/18 coverslip מ"מ ב12 גם צלחת). מייד לפני ציפוי, לשאוב עודף פתרון laminin / סרום מcoverslips ולהחליף עם מדיום תרבות נוירון העיקרי (ראה בהמשך). נ.ב. n הנדרשחום אדמדם של coverslips צריך להיקבע מראש כהכנת coverslip היא החלה היום לפני התרבות (ראה שלב 1.1).
12. עכברוש התרבות העיקרי E18 נוירונים בהיפוקמפוס עד 21 ימים במבחנה (DIV) במדיום Neurobasal, 2% B27, L-גלוטמין 0.5 מ"מ בתוספת 1% FCS (חום מומת). לבצע שינוי בינוני חצי שעת 7 DIV ושבועי לאחר מכן. Fluorodeoxyuridine / uridine אנטי mitotic מתווסף ב7 DIV; 1/1, 000 דילול של 10 מניית מ"מ של כל נוקלאוזידים) כדי למנוע צמיחת יתר גליה.

2. נוגדן דגירה עם Live נוירונים

1. במהלך השבוע בתרבות הראשון, נוירונים מתפתחים סוכות הדנדריטים ועד השבוע 2-3, הנוירונים הבשילו מספיק כדי להיות עוברים ^6,7 synaptogenesis.
   1. בשלב / s זמן ניסוי שנבחרה, להחיל את הנוגדן הראשוני לעותק משולש בארות המכילות נוירונים עובריים ראשוניים על coverslips. הוספת aliquot של הנוגדן ישירות לתוך מדיום התרבותנוירונים העיקרי להערת הדילול הסופית הרצויה: בדוגמא שלנו, נסיוב ארנב polyclonal הועלה נגד צורה מופרשת רקומביננטי של החלבון היה מדולל 1/500 על ידי הוספת 2 μl עד 1 מיליליטר של מדיום התרבות היטב; צנטריפוגה עבור 10 דקות , 13,000 XG, RT ניתן לשלב לפני נטילת aliquot של נוגדנים כמו זה יהיה להסיר כל חומר חלקיקים ויכול לעזור להפחית את הרקע.
   2. לפקדי סרום preimmune, להוסיף כמות שווה של סרום preimmune (לאותו דילול סופי). אם לא סרום preimmune זמין, להוסיף הנפח שווה של מדיום Neurobasal או PBS (אין שליטת נוגדן ראשונית). לחלופין, אם נוגדן ראשוני מתאים זמין שמכיר אזור תאית / s של החלבון, נוגדן זה ניתן להוסיף לפקד גם על מנת לבדוק ספציפי של צביעת פני השטח.
   3. להחזיר את התאים לתרבות החממה ל1-4 שעות (תקופת דגירה זה עשויה להיקבע באופן אמפירי). בexperimeNTS, הנוגדן היה נוכח לכל התקופה אם כי עיצוב ניסיוני יכול לשלב דופק של נוגדן ואחרי תקופה נוספת דגירה לאחר לשטוף החוצה (ניסוי דופק צ'ייס) כדי להעריך את מהלך הפנמת הזמן.
      שלב אופציונלי: דגירה זה יכול להתבצע בטמפרטורת חדר או אפילו על קרח כדי להאט את קצב הפנמת חלבון בסיסי, במידת צורך. אם מבוצע בסביבה שאינו CO ₂ מבוקרת, הבינוני צריך להיות שונה לאחד שאינו ביקרבונט שנאגרו לפני תוספת של הנוגדן / נסיוב. זהירות: למבוגרים תרבויות נוירון (> 14 ימים, ונוירונים עכבר במיוחד בתרבית עוברית) לא לסבול שינויים בינוניים היטב.
2. יש לנו בשימוש פעמים דגירה של שלב זה ראשוני נוגדן הפנמה של 1 שעות, 2 שעות, 4 שעות ועם תוצאות טובות אם כי הזמן האופטימלי יהיה תלוי בשפע של החלבון של עניין, כמו גם הדינמיקה של סחר בחלבון בcells תחת מחקר.
   הערה: התמונות כפול הצבע שמוצגים בנציג התוצאות התקבלו עם דגירה של השעה 1 ב37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה.
3. לאחר דגירה לתקופה הרצויה, לשאוב את המדיום המכיל נוגדנים. לשטוף את הבארות בעדינות אך במהירות פעם עם PBS בטמפרטורת חדר.

3. יישום שני נוגדנים לתאים קבועים, Unpermeabilized

1. תקן את הנוירונים עם paraformaldehyde 4% בpH חיץ פוספט 7.2, 5 דקות בטמפרטורת חדר הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמשו מקבע מוכנים טרי, או לחלופין להשתמש בתיקון שכבר מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס ולגמרי מופשרים, כך שאף paraformaldehyde זירז ניכר . זהירות: מקבע Paraformaldehyde צריך להיות מוכן וטפל במנדף.
2. הסר לתקן מבארות (העברה למכל פסולת נוזלית במנדף) ולשטוף 3x עם PBS.
   1. שלב אופציונלי: אם תרצו, כדי לחסוך בחומרים כימיים נוגדן, coverslips יכוללהסיר בזהירות מהצלחת 12 גם עם מלקחיים והניח את תא בצד למעלה, על גיליון של Parafilm הניח על הבסיס של צלחת תרבות חד פעמית.
   2. אז יכולים להיות pipetted פתרונות בעדינות על coverslips כך שהם מכוסים לגמרי בלי הצפת הפתרון מעבר לקצה coverslip לParafilm.
   3. טכניקה זו מתאימה לincubations לטווח קצר (1-2 hr) לעומת זאת כבר incubations (למשל בלילה) צריכה להתבצע בתא humidified. לחלופין, ניתן להציב את coverslips בחזרה לתוך הבארות של צלחת 12 גם לדגירת הלילה ונפח מספיק יש להוסיף על מנת להבטיח את coverslips לא יתייבש.
3. בלוק ל30 דקות בטמפרטורת חדר עם BSA 5% ב-PBS (שים לב: אל תוסיף חומר ניקוי לפתרון החסימה בשלב זה כפי שהוא חשוב כי התאים אינם permeabilized).
4. כדי לתייג חלבון פני השטח לפני שתמשיך עם גלאיםtion של חלבון מופנם, להחיל 2 ° הנוגדן שכותרתו הראשון fluorescently של בחירה.
   הערה: בדוגמא שתוארה כאן, נסיוב העיקרי גדל בארנב (נוגדן בתוך הבית) לאיזופורם המופרש רקומביננטי ^4. כך, משני הנוגדנים הראשונים לזהות את האזור תאי של איזופורם הטרנסממברני על פני השטח של תאי עצב unpermeabilized, השתמשנו DyLight נגד ארנב חמור 649 (1/200 מדוללים PBS המכיל BSA 5%). מומלץ צנטריפוגות פתרונות מדולל נוגדנים משני (10 דקות, 13,000 XG, RT) לפני השימוש.
5. דגירה coverslips עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר.
6. לשטוף coverslips (בבארות), 2x 5 דקות עם PBS.

4. חסימה עם נוגדן 2 ° ללא תווית עודף

1. חסום את הנוירונים unpermeabilized עם ריכוז גבוה (> 0.1 מ"ג / מיליליטר) של נוגדן 2 ° ללא תווית.
   1. נוגדן 2 ° ללא תווית צריך להיות מורם נגד המינים שביהנוגדן הראשוני הועלה (במקרה זה ארנב) על ידי לילה דגירה בטמפרטורת חדר.
   2. עבור פרוטוקול זה, שבר AffiniPure F _ab IgG עיזים נגד ארנב (L H +) היה בשימוש בריכוז של 0.13 מ"ג / מיליליטר.
      הערה: הדגירה הלילה נמצאה כחיוני כתקופה קצרה יותר דגירה (2 שעות) לא הספיקה לחסימה של נוגדן ראשוני שלא היה קשור באופן מלא על ידי הנוגדנים משני שכותרתו מלאה.
2. לשטוף coverslips (בבארות), 2x 5 דקות עם PBS.
3. לאחר שלב חסימה זו, שלאחר לתקן את התאים עם paraformaldehyde 4% בpH פוספט חיץ 7.2, 5 דקות בטמפרטורת חדר. יש לשטוף עם PBS (2x) לאחר הסרת המקבע (מקבע העברה למכל פסולת נוזלית במנדף).

5. Permeabilization ויישום של הנוגדן השני fluorescently שמצומדת 2 °

1. Permeabilize ולחסום את התאים עם BSA 5% ב-PBS מכיל 0.1% Triton-X-100 בטמפה החדרrature ל30 דקות.
2. הסר את הפתרון לחסימה (מטפל שcoverslips לא יתייבש). מוסיף את 2 ° הנוגדן השני fluorescently מצומדות מתויג עם fluorophore שונה.
   1. הערה: זה יכול להיות אפשרי כדי להבדיל את תג fluorophore זו מזו ששמשה בעבר, בהתאם למסנני עירור / פליטה נגיש במיקרוסקופ confocal (ראה להלן).
   2. לדוגמא שהוצגה בפרוטוקול זה, נוגדני אלקסה פלואוריד חמור 488 מצומדות נגד הארנב 2 ° שימשו (1/200 ב-PBS, BSA 5% ו0.1% Triton-X-100). דגירה 2 שעות בטמפרטורת חדר ולאחר מכן להסיר את פתרון נוגדן 2 מעלות.
3. לשטוף coverslips 3x 5 דקות עם PBS, ולבסוף, לשטוף בקצרה עם מים deionized.

6. הרכבה והדמיה

1. הר coverslips על שקופיות זכוכית עם antifade מימיים הרכבה בינונית מכיל (למשל Vectashield) ולאפשר לו להתייבש. חנות בחושך ב C ° 4 לאופשימור timal של עוצמת אות ניאון.
2. תמונת immunostained תאים במיקרוסקופ confocal.
   1. מסנני עירור והפליטה מתאימים לזיהוי של שני אותות fluorophore חייבים להיות זמינים.
   2. אם תנאי ניסוי שונים הם להיות בהשוואה (לדוגמא, שיעורי הפנמה תחת ^8,9 או שליטת תנאי depolarized), להבטיח כי כל לשכפל coverslips מהתנאים השונים הם צילמו עם אותם הפרמטרים רכישת התמונה. הצפיפות המשולבת של אזורים סטנדרטיים של עניין או תכונות puncta (לדוגמא מספר, גודל) מהתמונות שהתקבלו לאחר מכן ניתן למדוד באמצעות תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית (למשל פיג'י / ImageJ, Metamorph).

תוצאות

טכניקת immunostaining הניאון כפול צבע המוצגת כאן היא שימושית לתיוג תחומים תאיים של חלבונים הטרנסממברני בתאים חיים (המוצג באופן סכמטי באיור 1). במהלך תקופת הדגירה, נוגדנים נקשרים אפיטופים נגישים ושיעור האוכלוסייה של מולקולות חלבון, יחד עם נוגדן מאוגד, הוא endocytosed. בנ?...

Discussion

הטכניקה המתוארת כאן היא משלימה לזו של biotinylation על פני קרום התא (נסקר על ידי Arancibia-Càrcamo et al.) ¹² וזה שיטת בחירה של שמירת מידע על לוקליזציה subcellular של החלבון הפנים, ובלבד נוגדן ראשוני מתאים ל epitope תאי הוא זמין. בנוסף, לכמת את סחר חלבון / הפנמה לאורך זמן יכול להתבצע (על ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206