Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Zusammenfassung

Um die Zelloberflächen-Lokalisierung eines mutmaßlichen Transmembran-Rezeptor in kultivierten Neuronen demonstrieren, das Protein markiert man auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen primären Antikörper gegen einen extrazellulären Teil des Proteins erhöht. Da die Rezeptoren an und von der Oberfläche gehandelt, wenn Zellen werden permeabilisiert, dann nach der Fixierung sowohl der Zelloberfläche und interne Protein um denselben markierten sekundären Antikörper nachgewiesen werden. Hier passten wir eine Methode verwendet, um Proteintransport ("Antikörper Zeit") zu studieren, um Label-Protein, das während der Antikörper-Inkubation Schritt und Protein, die entweder blieb auf der Zelloberfläche oder wurde in dieser Zeit an die Oberfläche Handel durch Endozytose internalisiert worden war differentiell . Die Fähigkeit, diese beiden Pools von Protein unterscheiden durch den Einbau einer Übernachtblockierungsschritt mit hochkonzentrierten unmarkierten sekundären Antikörpers nach einer anfänglichen incubatio möglich wurden der permeabilisierten Neuronen mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper. Nach dem Blockierungsschritt, Permeabilisierung der Neuronen erlaubt Detektion des internalisierten Pool mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörpers mit einem anderen Fluorophor markiert. Mit dieser Technik konnten wir wichtige Informationen über die subzelluläre Lage dieses mutmaßlichen Rezeptor zu erhalten, offenbart, dass es in der Tat auf der Zelloberfläche in Neuronen gehandelt. Diese Technik ist allgemein anwendbar auf einen Bereich von Zelltypen und Zelloberflächen-Proteine, die eine geeignete Antikörpers an ein extrazelluläres Epitop ist.

Einleitung

Bei der Festlegung der Funktion der neu identifizierten Proteine, Untersuchung der subzellulären Lokalisation und Menschenhandel des Proteins in Frage wichtige Hinweise auf die wahrscheinliche Rolle / s des Proteins ^1,2 bieten. Bioinformatische Analyse des Transkriptoms der Entwicklungs Neocortex ³ hat uns mit einer Liste von Genen veränderte Expression während der Maushirn Kortikogenese zeigt. Dann nahm eine Gen-Knockout-Ansatz, um festzustellen, dass das Protein durch eines dieser Gene, sez6 codiert, hat eine Schlüsselrolle in der Neuronenentwicklung. Wir beobachteten, dass die Beschlagnahme-verwandtes Gen 6 oder Sez6, Protein ist in der Entwicklung Dendriten und ist auch in dendritischen Dornen, spezialisierte Strukturen auf Dendriten, die Aufnahme und Integration von erregenden Signale vorhanden. Darüber hinaus, wenn dieses Protein fehlt, Dendriten und Synapsen nicht einwand ⁴ zu bilden. Die wahrscheinliche dominante Isoform des Proteins hat die Eigenschaften eines TransmembranE-Rezeptor, obwohl, wenn die subzelluläre Verteilung von immunmarkierten Proteins wurde durch konfokale Mikroskopie oder Immun-Elektronenmikroskopie untersucht die meisten, wenn nicht alle, der das Signal erschien mit kleinen Bläschen in der somatodendritischen Fach mit wenig oder kein Protein auf der Plasmamembran markiert zugehörigen an der Zelloberfläche.

Um endgültig zu zeigen, dass diese mutmaßlichen Rezeptor mit einem vorhergesagten großen extrazellulären Domäne in der Plasmamembran gehandelt hat man eine Lebendzell-Ansatzes unter Verwendung des Antiserums wir an einen extrazellulären Teil des Proteins erzeugt hatte, um Protein auf der Zelloberfläche zu markieren. Durch die Kombination dieser "Antikörper Fütterung" Ansatz mit zwei Anwendungen der differentiell markierten sekundären Antikörper, der durch eine umfassende Sperrschritt und einem Schritt Permeabilisierung getrennt waren wir in der Lage, zwei verschiedene Pools von Protein unterschieden durch Bindung an fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper tragen verschiedene fluoreszier identifizierenent-Tags. So konnten wir Protein, das während der Antikörper-Inkubation Schritt von Protein, das entweder blieb auf der Zelloberfläche oder wurde während dieser Zeit auf die Oberfläche Handel durch Endozytose internalisiert worden war, zu unterscheiden. Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir, dass das Protein von Interesse wird zu und von der Zelloberfläche in Neuronen gehandelt. Daher hat sich diese relativ schnell und einfache Technik informativer als traditionelle Methoden Immunzytochemie oder vorge Einbettung Immunelektronenmikroskopie, trotz der Tatsache, dass wir verwendeten die gleiche polyklonalen Kaninchen-Antiserum für alle diese Techniken. Diese Technik ist allgemein anwendbar auf irgendeine Transmembranprotein ein gutes Antikörper Epitope erkennen, die extrazelluläre Domäne ist. Die Technik bereits verwendet wurde, um die Rezeptorhandel der Glutamat-Rezeptor-Untereinheit GluR1 ⁵ zu studieren.

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Protokoll

1. Dissoziierte Hippocampus Neuron Kultur

1. Bereiten Deckgläser (Borosilikatglas):
   1. In 100%-igem Ethanol waschen.
   2. Luft trocknen unter UV-Bestrahlung.
   3. Mantel mit Poly-D-Lysin (0,5 mg / ml in 0,15 M Borat-Puffer, über Nacht bei 4 ° C).
   4. Am nächsten Tag (Tag der Kultur) 3x waschen in PBS dann Mantel mit Laminin (2,5 ug / ml, Natur Maus Laminin) + 5% v / v hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS) in PBS für 2 Stunden bei 37 ° C.
2. Präparieren Sie embryonalen Tag 18 (E18) Rattenhippokampi und sammeln in PBS Calcium und Magnesium, auf Eis gekühlt enthält. Hinweis: Alle Versuchsprotokolle mit Tieren wurden von der Tierethikkommission der Universität von Melbourne genehmigt.
3. Vorbereitung der Papain und DNase I-Lösungen aus der Dissoziation Papain-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
   1. In 50 ul DNase I-Lösung zu 1 ml Papain-Lösung.
   2. HINWEIS: Sobaldzuerst hergestellt wird, kann das Papain-Lösung und die DNase I-Lösungen getrennt in Aliquots werden (0,5 ml und 25 &mgr; l Aliquots für Papain und DNase I bezeichnet) und bei -20 ° C bis zum Gebrauch gelagert.
4. Entfernen Sie so viel wie möglich PBS und Inkubation hippocampi (aus einem Wurf von Embryonen) mit 1 ml Papain / DNase I-Lösung bei 37 ° C für 15-20 min. Flick vorsichtig das Rohr, um die Inhalte während der Inkubationszeit zweimal mischen.
5. Man verreibt den Hippocampus-Gewebe sanft (die Vermeidung der Erzeugung von Bläschen) mit einer flammpolierten Pasteurpipette silikonisierten 10-15x, bis Zelldispersion erhalten wird, und wenige, wenn überhaupt, Gewebestücke von undissoziierten bleiben.
6. Sorgfältig Schicht dissoziierten Zellsuspension über eine 3 ml Kissen von 4% w / v Rinderserumalbumin (BSA) in Hanks ausgewogener Salzlösung plus Additive (HBSS ^+, siehe Abschnitt 1.6.1).
   1. Bereiten diese Stufengradienten Lösung durch Auflösen des BSA bei Raumtemperatur ohne RührenRing in HBSS mit 2 mM CaCl _2, 1 mM MgSO _{4, 4} mM NaHCO ₃ und 40 mM Glucose (HBSS ⁺⁾ dann Sterilfilter und bei 4 ° C
7. Zentrifuge, 100 g, 7 min in einer Tischzentrifuge mit Ausschwingrotor.
8. Entfernen der Überstand man aufpassen, nicht das Zellpellet abzusaugen.
9. Resuspendieren der pelletierten Zellen vorsichtig mit einem flamm poliert (silikonisiert) Pasteur-Pipette (oder eine 1 ml Pipettenspitze blau) in 1 ml komplette Neurobasalmedium (mit 2% B27, 0,5 mM L-Glutamin mit 1% FCS).
10. Graf zwei 10 ul Aliquots mit einer Zählkammer (NB zählen nur phasen hellen Zellen als "Live"-Zellen).
11. Platte primäre Neuronen auf vorbereitete beschichtete Deckgläschen (0,75 bis 1 x 10 ^5/18 mm Deckgläschen in 12-Well-Platte). Unmittelbar vor der Beschichtung, saugen überschüssiges Laminin / Serum-Lösung von Deckgläsern und ersetzen mit primären Neuronenkulturmedium (siehe unten). NB Die erforderliche nUmbra von Deckgläsern muss im Voraus bestimmt, wie Deckglas Zubereitung wird am Tag vor der Kultur begonnen werden (siehe Schritt 1.1).
12. Kultur primären Ratten-Hippocampusneuronen E18 bis zu 21 Tagen in vitro (DIV) in Neurobasalmedium, 2% B27, 0,5 mM L-Glutamin mit 1% FCS (hitzeinaktiviert) ergänzt. Führen Sie eine Halbmediumwechsel bei 7 DIV und danach wöchentlich. Die anti-mitotische Fluordeoxyuridin / Uridin wird auf 7 DIV hinzugefügt, 1/1, 000 Verdünnung von 10 mM von je Nukleosid) an Gliazellen übermäßiges Wachstum zu verhindern.

2. Antikörper Inkubation mit Live-Neuronen

1. Während der ersten Woche in Kultur werden Neuronen entwickeln dendritischen Dornen und 2-3 Wochen, haben Neuronen ausreichend gereift unterziehen Synaptogenese ^6,7.
   1. An ausgewählten Versuchszeitpunkt / s, wenden Sie den primären Antikörper in die Vertiefungen mit primären embryonalen Neuronen auf Deckgläsern verdreifachen. Hinzufügen eines Aliquots der Antikörper direkt in das Kulturmedium vondie primären Neuronen auf die gewünschte Endverdünnung Anmerkung: In diesem Beispiel wird ein polyklonaler Kaninchen-Antiserum gegen ein rekombinantes sezernierten Form des Proteins erhöht wurde 1/500 durch Zugabe von 2 &mgr; l bis 1 ml Kulturmedium verdünnt, und, ein Zentrifugation für 10 min , 13.000 xg, RT kann vor der Einnahme einen aliquoten Teil des Antikörpers, wie dieses integriert sein wird er Partikel zu entfernen und kann dazu beitragen, Hintergrund.
   2. Der Präimmunserum Kontrollen füge eine äquivalente Menge von Präimmunserum (in der gleichen Endverdünnung). Wenn kein Präimmunserum vorhanden ist, fügen Sie die gleichwertige Menge von Neurobasal Medium oder PBS (kein primärer Antikörper-Kontrolle). Alternativ, wenn eine geeignete primäre Antikörper ist, die intrazelluläre Region / Regionen des Proteins erkennt dieser Antikörper kann auch mit einer Steuer um Spezifität der Oberflächenfärbung testen zugesetzt werden.
   3. Rückgabe der Zellen zu dem Kulturbrutschrank für 1-4 Stunden (dieser Inkubationszeit kann empirisch bestimmt werden). In unserem experiments wurde der Antikörper für den gesamten Zeitraum vorhanden, obwohl die Versuchsanordnung konnte eine Puls-Antikörper, gefolgt von einer weiteren Inkubation nach dem Auswaschen (a Pulse-Chase-Experiment) enthalten, um den Zeitverlauf der Internalisierung beurteilen.
      OPTIONAL: Diese Inkubation kann bei Raumtemperatur oder auf Eis durchgeführt werden, um die Rate der basalen Protein Internalisierung verlangsamen, falls erforderlich. Wenn in einem Nicht-CO _{2-kontrollierten} Umgebung durchgeführt wird, sollte das Medium, eine, die nicht gepuffert Bicarbonat vor der Zugabe der Antikörper / Antiserum geändert werden. ACHTUNG: Ältere Neuronenkulturen (> 14 Tage und besonders kultivierten embryonalen Maus-Neuronen) keine Vollmediumwechsel gut vertragen.
2. Wir haben Inkubationszeit für diesen primären Antikörper Internalisierung Schritt von 1 h, 2 h und 4 h mit guten Ergebnissen verwendet werden, obwohl die optimale Zeit auf Abundanz des Proteins von Interesse sowie die Dynamik abhängig von den Proteintransport in der CELls im Studium.
   HINWEIS: Die zweifarbige Bilder in Repräsentative Ergebnisse gezeigt, wurden mit einer Inkubation von 1 h bei 37 º C in einem Gewebekultur-Inkubator erhalten.
3. Nach Inkubation für den gewünschten Zeitraum, absaugen, die den Antikörper enthaltende Medium. Sanft aber schnell wieder waschen die Vertiefungen mit PBS bei Raumtemperatur.

3. Sekundäre Antikörper Anwendung auf Fest, permeabilisierten Zellen

1. Fix Neuronen mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer pH 7,2, 5 min bei Raumtemperatur Hinweis: Die besten Ergebnisse erzielen Sie mit frisch zubereiteten Haarfestiger; alternativ Update, das bei -20 ° C gelagert wurde und aufgetaut vollständig, so dass keine ausgefallenen Para ist offensichtlich . ACHTUNG: Paraformaldehyd Fixiermittel sollten bereit und in einem Abzug gehandhabt werden.
2. Entfernen fix aus Brunnen (Übernahme in Abfallbehälter im Abzug) und spülen 3x mit PBS.
   1. OPTIONAL: Wenn gewünscht, auf Antikörper-Reagenzien zu sparen, können die Deckgläservorsichtig von der Platte mit 12 Vertiefungen mit einer Pinzette entfernt werden, und platziert Zell Seite nach oben, auf ein Blatt Parafilm auf der Basis eines Einweg-Kulturplatte gelegt.
   2. Lösungen können dann leicht auf die Deckgläser pipettiert werden, so dass sie völlig ohne Lösungsüberflutung über den Rand des Deckglases auf den Parafilm abgedeckt sind.
   3. Diese Technik eignet sich für Kurzzeit-Inkubation (1-2 Std.) jedoch mehr Inkubationen (zB über Nacht) sollte in einer feuchten Kammer durchgeführt werden. Alternativ können die Deckgläser wieder in die Vertiefungen der 12-Well-Platte für die Inkubation über Nacht und ausreichendes Volumen gegeben werden sollte hinzugefügt werden, dass die Deckgläser nicht austrocknen.
3. Block für 30 min bei Raumtemperatur mit 5% BSA in PBS (Anmerkung: Sie Waschmittel in der Blockierungslösung in dieser Phase nicht hinzu, da es wichtig, dass die Zellen nicht permeabilisiert).
4. Um Oberflächenprotein, bevor Sie fortfahren mit UVEK beschriftention von internalisierten Protein, gelten die erste fluoreszenzmarkierten 2 ° Antikörper der Wahl.
   Anmerkung: In dem hier beschriebenen Beispiel wurde das primäre Antiserum in Kaninchen (in-house-Antikörper) einen rekombinanten sezernierten Isoform ⁴ angehoben. So kann der erste sekundäre Antikörper an die extrazelluläre Region des Trans Isoform auf der Oberfläche der permeabilisierten Neuronen nachzuweisen, haben wir Esel-Anti-Kaninchen-Dylight 649 (um 1/200 verdünnt in PBS mit 5% BSA). Es wird empfohlen, verdünnten sekundären Antikörperlösungen (10 min, 13.000 xg, RT) vor Gebrauch zentrifugiert.
5. Die Deckgläser Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
6. Deck waschen (in Brunnen), 2x 5 min mit PBS.

4. Blockieren mit Excess unbeschriftet 2 ° Antikörper

1. Blockieren die permeabilisierten Neuronen mit einer hohen Konzentration (> 0,1 mg / ml) von unmarkiertem 2 ° Antikörper.
   1. Das unmarkierte 2 ° Antikörper sollte gegen die Spezies gezüchtet werden, in denenDer primäre Antikörper wurde durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur erhöht (in diesem Fall Kaninchen).
   2. Für dieses Protokoll wurde AffiniPure F _ab-Fragment Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (H + L) in einer Konzentration von 0,13 mg / ml verwendet.
      HINWEIS: Die Inkubation über Nacht wurde festgestellt, entscheidend, da eine kürzere Inkubation (2 h) zu sein war nicht ausreichend für eine vollständige Blockierung des primären Antikörpers, der nicht vollständig von dem markierten sekundären Antikörper gebunden wurde.
2. Deck waschen (in Brunnen), 2x 5 min mit PBS.
3. Nach dieser Blockierungsschritt, nach Fixierung der Zellen mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer pH 7,2, 5 min bei Raumtemperatur. Spülen mit PBS (2x) nach der Entfernung der Fixierungsmittel (Fixiermittel Transfer zum Abfallbehälter im Abzug).

5. Permeabilisierung und Anwendung des Zweiten Fluoreszenz-konjugierte Antikörper 2 °

1. Permeabilisiert und blockieren die Zellen mit 5% BSA in PBS, enthaltend 0,1% Triton-X-100 bei Raumtemperatur für 30 min.
2. Blocking-Lösung (darauf achten, dass die Deckgläser nicht austrocknen). In der zweiten fluoreszenz konjugierten 2 ° Antikörper mit einem anderen Fluorophor markiert.
   1. HINWEIS: Es muß möglich sein, diese Fluorophor-Markierung von dem vorher verwendeten unterscheidet, abhängig von den verfügbaren Anregungs / Emissionsfilter auf der konfokalen Mikroskop (siehe unten).
   2. Für die in diesem Protokoll vorgestellten Beispiel wurde ein Alexa Fluor 488-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-2 °-Antikörper verwendet (um 1/200 in PBS, 5% BSA und 0,1% Triton-X-100). Inkubation 2 h bei Raumtemperatur entfernen Sie dann das 2 °-Antikörperlösung.
3. Wash Deckgläser 3x 5 min mit PBS und schließlich kurz waschen mit entsalztem Wasser.

6. Montage-und Imaging

1. Berg Deckgläser auf Glasobjektträger mit einem wässrigen Medium mit Montageantifade (zB Vectashield) und trocknen lassen. Shop im Dunkeln bei 4 ° C für optimal Erhaltung der Fluoreszenzsignalintensität.
2. Bildimmun Zellen auf einem konfokalen Mikroskop.
   1. Geeigneten Anregungs-und Emissionsfilter zur Detektion von zwei Fluorophor-Signale zur Verfügung stehen.
   2. Wenn verschiedene experimentelle Bedingungen (zB Internalisierung Raten unter depolarisierten ^8,9 oder Kontrollbedingungen) verglichen werden, sicherzustellen, dass alle replizieren Deckgläser aus den verschiedenen Bedingungen sind mit den gleichen Bildaufnahmeparameter abgebildet. Die integrierte Dichte der Standardregionen von Interesse oder der puncta Attribute (zB Anzahl, Größe) aus den resultierenden Bilder können dann mit Standard-Bildanalyse-Software (z. B. Fiji / ImageJ, Metamorph) gemessen werden.

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Ergebnisse

Die Zweifarben-Fluoreszenz Immunfärbetechnik präsentierten nützlich zur Markierung von extrazellulären Domänen von Transmembran-Proteinen in lebenden Zellen (in 1 schematisch gezeigt). Während der Inkubationszeit, die Immunglobuline binden zugängliche Epitope und ein Anteil der Bevölkerung von Proteinmolekülen zusammen mit gebundenem Antikörper wird durch Endozytose aufgenommen. Zusätzlich kann neu synthetisierten Proteins an die Zelloberfläche über Terminhandel zu erreichen und recycelt Pr...

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Diskussion

Die hier beschriebene Technik ist komplementär zu der Biotinylierung der Zelloberfläche (durch Arancibia-Carcamo et al. Bewertung) ¹² und es ist die Methode der Wahl für die Bewahrung von Informationen über die subzelluläre Lokalisation des internalisierten Protein, sofern eine geeignete primäre Antikörper an ein extrazelluläres Epitop ist. Darüber hinaus kann die Quantifizierung von Proteintransport / Internalisierung über die Zeit (durch Fixieren Deck zu verschiedenen Zeiten während der ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206