Дифференциальный Маркировка клеточной поверхности и интернализированных белков после антитела Кормление Живая культивируемых нейронов

Резюме

Мы опишем способ маркировать белка на поверхности живых нейронов использованием конкретного поликлональные антитела к эпитопам внеклеточных. Белок связаны антитела на поверхности клеток и впоследствии усвоены через эндоцитоз можно отличить от оставшихся на белок, или продают в, поверхности во время инкубации.

Аннотация

Для того чтобы продемонстрировать клеточной поверхности локализацию предполагаемого рецептора трансмембранного в культивируемых нейронах, мы меченый белок на поверхности живых нейронов с конкретным первичного антитела против повышенной внеклеточной части белка. Учитывая, что рецепторы продают в и от поверхности, если клетки проницаемыми после фиксации затем оба клеточной поверхности и внутренний белок будет обнаружен тот же меченого вторичного антитела. Здесь мы адаптирован метод, используемый для изучения оборота белка ("кормления антитело") дифференциально метки белок, который был усвоен эндоцитоза во время стадии инкубации антитело и белка, которые либо остались на поверхности клетки или был предметом торговли на поверхность в течение этого периода . Способность различать эти два пула белка стало возможным благодаря включению ночного шага блокирующего с высококонцентрированных немеченного вторичным антителом после начального incubatioп unpermeabilized нейронов с флуоресцентно-меченого вторичного антитела. После стадии блокирования проницаемости нейронов разрешенных обнаружение интернализованной бассейн с флуоресцентным вторичным антителом, меченным другом флуорофора. Используя эту технику, мы смогли получить важную информацию о внутриклеточной локализации этого предполагаемого рецептора, показывая, что это было, действительно, продаются в поверхности клетки в нейронах. Эта методика широко применимы к ряду типов клеток и белков клеточной поверхности, обеспечивая соответствующее антитело с внеклеточным эпитопом доступен.

Введение

При установлении функцию недавно идентифицированных белков, исследование субклеточном локализации и торговли белка в вопрос может дать важную информацию о вероятной роли / с белковой ^1,2. Биоинформационный анализ транскриптома развивающегося неокортекса ³ предоставил нам список генов вл ющие экспрессию во время мыши мозга corticogenesis. Мы тогда приняли ген нокаут подход констатировать, что белок, кодируемый одной из этих генов, sez6, играет ключевую роль в развитии нейронов. Мы наблюдали, что ген, связанных с захватом 6, или Sez6, белок находится в развивающихся дендритов и также присутствует в дендритных шипов, специализированных структур на дендритах, которые получают и интегрируют возбуждающие сигналы. Кроме того, когда этот белок отсутствует, дендриты и возбуждающих синапсов сбоев в ⁴ образуют. Вероятной доминирующим изоформы белка имеет черты transmembranе рецептор хотя, когда внутриклеточное распределение белка immunolabeled была исследована с помощью конфокальной микроскопии или иммуноэлектронной микроскопии большинство, если не все, из сигнала оказалось, связанный с мелких пузырьков в somatodendritic отсека с небольшим или нет, белка меченного на плазматической мембране на клеточной поверхности.

Для того, чтобы окончательно показать, что это предполагаемый рецептор с предсказанной большой внеклеточного домена продают в плазматической мембране, мы использовали подход живых клеток с использованием антисыворотки мы сгенерированный к внеклеточной части белка для обозначения белка на клеточной поверхности. Объединив эту "антитело кормления" подход с двумя приложениями дифференциально-меченого вторичного антитела, разделенных широким шагом блокирующего и шаг пермеабилизации, мы смогли выделить два различных бассейнов белка, отличающихся путем связывания с флуоресцентной меченные вторичные антитела, помеченные разными fluorescЛОР теги. Таким образом, мы смогли выделить белок, который был усвоен эндоцитоза во время стадии инкубации антитело из белка, который либо оставалась на поверхности клетки или был предметом торговли на поверхность в течение этого периода. С помощью этого метода было установлено, что белок, представляющий интерес, продают в и из клеточной поверхности в нейронах. Таким образом, это относительно быстрый и простой метод оказался более информативным, чем традиционные методы иммуноцитохимии или предварительно вложения immunogold электронной микроскопии, несмотря на то, что мы использовали ту же кролик поликлональной антисыворотки для всех этих методов. Этот метод обычно применимы к любому трансмембранного белка при условии хорошей антитело, распознающее внеклеточные эпитопы домена доступен. Метод был использован ранее для изучения торговлей рецептора рецептора глутамата GluR1 субъединицы ^5.

протокол

1. Диссошиэйтед гиппокампа Нейрон Культура

1. Подготовка покровные (боросиликатного стекла):
   1. Стирать в 100%-ном этаноле.
   2. Воздух сухой при УФ-облучении.
   3. Coat с Poly-D-лизина (0,5 мг / мл в 0,15 М боратного буфера в течение ночи при 4 ° С).
   4. На следующий день (день культуры) промыть 3 раза в PBS затем слой с ламинина (2,5 мкг / мл, природный мышь ламинин) + 5% объем / объем инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FCS) разводили в PBS в течение 2 ч при 37 ° С.
2. Проанализируйте эмбриональных день 18 (E18) крыса гиппокампа и собирать в PBS, содержащий кальций и магний, охлажденные на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: все экспериментальные протоколы с участием животных были одобрены этическим комитетом животного из Университета Мельбурна по.
3. Подготовьте папаин и решения ДНКаза I из комплекта Папаин диссоциации в соответствии с инструкциями изготовителя.
   1. Добавить 50 мкл ДНКазы I решение до 1 мл раствора папаина.
   2. ПРИМЕЧАНИЕ: После того, каксначала получают раствор папаин и растворы ДНКазы I могут быть отдельно разливали в виде аликвот (0,5 мл и 25 мкл аликвоты для папаина и ДНКазой I, соответственно) и хранили при -20 ° С до использования.
4. Удалить столько, насколько это возможно PBS и инкубируют гиппокампе (от одного помета эмбрионов) с 1 мл папаин / ДНКазы I растворе при 37 ° С в течение 15-20 мин. Аккуратно вылить трубку для перемешивания содержимого дважды в течение инкубационного периода.
5. Растирают ткани гиппокампа нежно (избегая поколение пузырьков) с огненно-полированной силицированного пипетки Пастера 10-15х, пока дисперсия клетка не получается, и лишь немногие, если таковые имеются, куски недиссоциированной ткани остаются.
6. Осторожно слой диссоциированной клеточной суспензии в течение 3 мл подушке 4% вес / об бычьего сывороточного альбумина (BSA) в сбалансированном растворе соли Хэнка плюс добавки (HBSS ^+, см. раздел 1.6.1).
   1. Подготовьте ступенчатого градиентного раствора путем растворения BSA при комнатной температуре с перемешиванием безкольцо в HBSS, содержащем 2 мМ CaCl _2, 1 мМ MgSO _4, 4 мМ NaHCO3 _и 40 мМ глюкозы (HBSS ^+), то стерильный фильтр и хранят при температуре 4 ° С.
7. Центрифуга 100 XG, 7 мин в лабораторной центрифуге с колебательного ротора.
8. Удалить супернатант стараясь не аспирации осадок клеток.
9. Ресуспендируют осажденные клетки осторожно пламени полированный (силиконизированный) пипетки Пастера (или 1 мл синий наконечника пипетки) в 1 мл полной Neurobasal среды (2% B27, 0,5 мМ L-глутамина с добавлением 1% FCS).
10. Всего два 10 мкл аликвоты с помощью гемоцитометра (NB рассчитывать только клетки поэтапного ярко, как «живых» клеток).
11. Plate первичных нейронов на preprepared покрытием покровные стекла (0.75-1 х 10 ^5/18 мм покровное в 12-луночный планшет). Непосредственно перед покрытием, аспирации избыточного ламинин / сыворотки раствор из покровных и заменить первичной культуре нейронов среды (см. ниже). NB требуется нхариус из покровных должна быть определена заранее, так как подготовка Покровное началась за день до культуры (см. шаг 1.1).
12. Культура крыса первичной E18 нейроны гиппокампа на срок до 21 дней в пробирке (DIV) в Neurobasal среды, 2% B27, 0.5 мм L-глутамина с добавлением 1% FCS (инактивированной нагреванием). Выполните половину изменение средней в 7 DIV и неделю после него. Антимитотический fluorodeoxyuridine / уридин добавлен в DIV 7, 1/1, 000 разбавление 10 мМ исходного каждого нуклеозида), чтобы предотвратить чрезмерно быстрый рост глиальных.

2. Антитела Инкубационный с живой нейронов

1. В течение первой недели в культуре, нейроны развиваются дендритные беседки и недели 2-3, нейроны созрели достаточно, переживает синаптогенеза ^6,7.
   1. На отдельных экспериментальных момент времени / с, применить первичное антитело в тройные лунки, содержащие первичные эмбриональные нейроны на покровные. Добавить аликвоту антитела непосредственно в культуральной средепервичные нейроны до нужной конечной разбавления Примечание: В нашем примере кроличьи поликлональные антисыворотки против рекомбинантного секретируемого формы белка разводили 1/500 добавлением 2 мкл на 1 мл культуральной среды в хорошо; центрифугирование в течение 10 мин , 13000 XG, РТ могут быть включены до принятия аликвоты антитела, как это будет удалить все твердые частицы и может помочь уменьшить фон.
   2. Для предиммунной сыворотки управления, добавить эквивалентное количество преиммунной сывороткой (к одинаковому конечному разбавлению). Если нет неиммунную сыворотки не доступен, добавьте эквивалентный объем Neurobasal среды или PBS (без управления первичное антитело). Кроме того, если подходит первичное антитело доступно, который распознает внутриклеточную область / сек белка, это антитело может быть добавлен к элементу управления также с целью проверки специфичности окрашивания поверхности.
   3. Вернуться клетки в питательную инкубатор для 1-4 часов (это инкубационный период может быть определена эмпирически). В нашем experimeНТС, антитело присутствовал в течение всего периода, хотя опытно-конструкторских может включать пульс антител с последующим дальнейшим инкубационного периода после вымывания (эксперимент импульсно-погони) для оценки временной ход интернационализации.
      Необязательной стадии: Эта инкубации можно проводить при комнатной температуре или даже на льду, чтобы замедлить скорость базального интернализации белка, если это необходимо. Если выполняется в не-СО ₂ контролируемой среде, среда должна быть изменена, чтобы тот, который не бикарбонат буферном перед добавлением антител / антисыворотки. ВНИМАНИЕ: Зрелые нейронные культуры (> 14 дней, и в частности, культивируемые мышиных эмбриональных нейронов) не терпят полный изменения средних хорошо.
2. Мы использовали времени инкубации в течение этого первичного антитела интернализации шагом 1 ч, 2 ч и 4 ч с хорошими результатами, хотя оптимальное время будет зависеть от избытка белка, представляющего интерес, а также динамика оборота белка в CELлс в стадии изучения.
   Примечание: двойной цветные изображения, показанные на репрезентативные результаты были получены при инкубации в течение 1 часа при 37 ° С в инкубаторе для тканевых культур.
3. После инкубации в течение желаемого периода, аспирация от антител, содержащих среду. Промыть лунки осторожно, но быстро один раз ЗФР при комнатной температуре.

3. Вторичным антителом Применение к фиксированной, Unpermeabilized клеток

1. Fix нейроны 4% параформальдегидом в фосфатного буфера рН 7,2, 5 мин при комнатной температуре Примечание: для достижения наилучших результатов используйте свежеприготовленный фиксатором; альтернативно использовать исправление, которая хранилась при -20 ° С и полностью размороженной, чтобы ни осажденный параформальдегиде не видно . ВНИМАНИЕ: Параформальдегид фиксатор должны быть подготовлены и обработаны в вытяжной шкаф.
2. Удалить исправление из колодцев (перенос в контейнере жидких отходов в вытяжной шкаф) и промыть 3 раза с PBS.
   1. Необязательный шаг: При желании сэкономить на реагентов антител, покровные можетбыть тщательно удалена из 12-луночного планшета щипцами и помещали клеток стороной вверх, на листе Parafilm, установленной на основе одноразового культурального планшета.
   2. Растворы могут быть пипеткой осторожно на покровные так, чтобы они были полностью покрыты без раствора затопления через край покровного стекла на парафильмом.
   3. Этот метод подходит для краткосрочных инкубации (1-2 ч), однако больше инкубации (например, на ночь) следует проводить во влажной камере. Альтернативно, покровные может быть помещен обратно в лунки 12-луночного планшета для инкубации в течение ночи и достаточного объема должны быть добавлены для того, чтобы покровные не высыхают.
3. Блок течение 30 мин при комнатной температуре с 5% БСА в PBS (Примечание: Не следует добавлять моющее средство в блокирующем растворе на этой стадии, поскольку важно, что клетки не проницаемыми).
4. Для того, чтобы маркировать поверхностный белок, прежде чем приступить детекторовТион интернализованных белка, нанесите сначала дневно с надписью 2 ° антитела выбора.
   Примечание: В примере, описанном здесь, первичный Антисыворотку вырос в кролика (в доме антител) к рекомбинантной секретированного изоформы ^4. Таким образом, для первого вторичного антитела для выявления внеклеточной области трансмембранного изоформы на поверхности нейронов unpermeabilized мы использовали осла против кроличьего DyLight 649 (1/200 разводили в PBS, содержащего 5% бычий сывороточный альбумин). Рекомендуется центрифуге разбавленных растворов вторичными антителами (10 мин, 13 000 XG, РТ) перед использованием.
5. Инкубируйте покровные в течение 2 ч при комнатной температуре.
6. Вымойте покровные (в скважинах), 2x 5 мин с PBS.

4. Блокировка с избытка немеченого 2 ° антитела

1. Блок по unpermeabilized нейроны с высокой концентрацией (> 0,1 мг / мл) немеченого 2 ° антитела.
   1. Немеченый 2 ° антитела должны быть подняты против видов, у которыхПервичные антитела повышали (в данном случае кролика) путем инкубации в течение ночи при комнатной температуре.
   2. Для этого протокола, AffiniPure F _AB фрагмент козьих антител против кроличьего IgG (H + L) была использована в концентрации 0,13 мг / мл.
      Примечание: инкубации в течение ночи было установлено, что важно, поскольку более короткий период инкубации (2 ч) недостаточно для полной блокировки первичного антитела, которые не были полностью связанного меченого вторичного антитела.
2. Вымойте покровные (в скважинах), 2x 5 мин с PBS.
3. После этой стадии блокирования после фиксации клеток с 4% параформальдегидом в фосфатном буфере с рН 7,2, 5 мин при комнатной температуре. Промыть PBS (2 раза) после удаления фиксатора (передача фиксирующего к емкости жидких отходов в вытяжной шкаф).

5. Пермеабилизации и применение антитела Во-вторых флуоресцентно Конъюгированные 2 °

1. Проницаемыми и блокировать клетки с 5% БСА в PBS, содержащем 0,1% Тритон-X-100 при комнатной температура в течение 30 мин.
2. Снимите блокирующий раствор (следите, чтобы покровные не высыхают). Добавьте второй флуоресцентной-сопряженную 2 ° антитела теги отдельной флуорофором.
   1. ПРИМЕЧАНИЕ: Должна быть возможность отличить этот флуорофора тег из одного ранее использовались, в зависимости от доступных фильтров возбуждения / эмиссии на конфокальной микроскопии (см. ниже).
   2. Для примера, представленного в этом протоколе было использовано Alexa Fluor 488-конъюгированного осел анти-кролик 2 ° антитело (1/200 в PBS, 5% BSA и 0,1% Triton-X-100). Выдержите 2 часа при комнатной температуре, затем убрать решение 2 ° антител.
3. Wash покровные 3x 5 мин с PBS и, наконец, кратко промыть деионизированной водой.

6. Монтаж и обработка изображений

1. Гора покровные на стеклах с водным монтажа среде, содержащей antifade (например Vectashield) и дать высохнуть. Хранить в темном месте при температуре 4 ° С в течение опtimal сохранение интенсивности флуоресцентного сигнала.
2. Изображение иммуноокрашиванию клеток на конфокальной микроскопии.
   1. Соответствующие возбуждения и излучения фильтры для обнаружения двух флуорофоров сигналов должны быть доступны.
   2. Если различные экспериментальные условия должны быть сравнены (например, интернализация ставки по деполяризованных ^8,9 или контрольных условиях), убедитесь, что все повторить покровные от различных условий которые изображаются с теми же параметрами захвата изображений. Интегрированный плотность стандартных регионах, представляющих интерес или атрибутов Puncta (например, количество, размер) от полученных изображений, то можно измерить с помощью стандартного программного обеспечения для анализа изображений (например, Фиджи / ImageJ, Metamorph).

Результаты

Методика флуоресцентный иммунное окрашивание двух цветов, представленные здесь полезно для маркировки внеклеточные домены трансмембранных белков в живых клетках (схематически показано на фиг.1). Во время инкубационного периода, иммуноглобулины связать доступные эпитопы и д...

Обсуждение

Техника, описанная здесь дополняет, что из клеточной поверхности биотинилирования (обзор Arancibia-Carcamo др..) ^12, и это является методом выбора для сохранения информации о субклеточном локализации интернализованной белка, при условии подходящей первичное антитело к внеклеточный ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206