Etichettatura differenziale di Cell-superficie e interiorizzato Proteine ​​dopo Antibody Alimentazione dal vivo colture di neuroni

Riepilogo

Descriviamo un metodo per etichettare proteina sulla superficie dei neuroni viventi utilizzando un anticorpo policlonale specifico per epitopi extracellulari. Proteina legata per l'anticorpo sulla superficie cellulare e successivamente internalizzato tramite endocitosi può essere distinta dalla proteina rimanente, o trafficate, la superficie durante l'incubazione.

Abstract

Per dimostrare la localizzazione superficie cellulare di un recettore transmembrana in neuroni in coltura, abbiamo etichettato la proteina sulla superficie dei neuroni vivi con un anticorpo primario specifico sollevato contro una porzione extracellulare della proteina. Dato che i recettori sono trafficate da e verso la superficie, se le cellule vengono permeabilizzate dopo fissazione quindi sia sulla superficie cellulare e proteine ​​interna verrà rilevato dal medesimo anticorpo secondario marcato. Qui, abbiamo adattato un metodo utilizzato per studiare traffico di proteine ​​("alimentazione anticorpo") per differenzialmente proteina etichetta che era stato internalizzato per endocitosi in fase di incubazione anticorpo e proteina che sia rimasto sulla superficie cellulare o è stato oggetto di traffico alla superficie durante questo periodo . La capacità di distinguere queste due piscine di proteine ​​è stato reso possibile attraverso l'incorporazione di un passo di blocco durante la notte con l'anticorpo secondario marcato altamente concentrato, dopo un iniziale incubation di neuroni unpermeabilized con un anticorpo secondario fluorescente marcato. Dopo il blocco, passo, permeabilizzazione dei neuroni consentiti rilevamento della piscina internalizzato con un anticorpo secondario fluorescente marcato con un fluoroforo diverso. Utilizzando questa tecnica siamo riusciti ad ottenere importanti informazioni circa la posizione subcellulare di questo recettore putativo, rivelando che si trattava, infatti, di tratta alla superficie cellulare nei neuroni. Questa tecnica è ampiamente applicabile ad una gamma di tipi di cellule e proteine ​​di superficie cellulare, fornendo un anticorpo adatto ad un epitopo extracellulare è disponibile.

Introduzione

Nello stabilire la funzione delle proteine ​​di nuova identificazione, indagine della localizzazione subcellulare e il traffico della proteina in questione può fornire importanti indizi circa il probabile ruolo / s del ^1,2 proteine. L'analisi bioinformatica del trascrittoma della neocorteccia di sviluppo ³ ci ha fornito una lista di geni che presentano espressione alterata durante il mouse corticogenesi cervello. Abbiamo quindi adottato un approccio del gene knockout per accertare che la proteina codificata da uno di questi geni, sez6, ha un ruolo chiave nello sviluppo del neurone. Abbiamo osservato che il gene sequestro legati 6, o Sez6, la proteina si trova a dendriti di sviluppo ed è presente anche nelle spine dendritiche, le strutture specializzate in dendriti che ricevono e integrano segnali eccitatori. Inoltre, quando questa proteina viene a mancare, dendriti e sinapsi eccitatorie non riescono a formare correttamente ^4. L'isoforma dominante probabile della proteina ha caratteristiche di un transmembrane recettore anche se, quando la distribuzione subcellulare di proteine ​​immunolabeled stata esaminata mediante microscopia confocale o mediante microscopia immunoelettronica maggior parte, se non tutti, del segnale apparso associato con piccole vescicole nel vano Somatodendritic con poca o nessuna, proteina marcata sulla membrana plasmatica sulla superficie cellulare.

Per dimostrare definitivamente che questo recettore putativo con un grande dominio extracellulare predetto viene trafficata alla membrana plasmatica, abbiamo adottato un approccio live-cell usando l'antisiero avevamo generato ad una porzione extracellulare della proteina di etichettare proteine ​​sulla superficie cellulare. Combinando questo approccio "anticorpo alimentazione" con due applicazioni di anticorpo secondario differenziale marcato separati da un ampio passo di blocco ed una fase di permeabilizzazione, siamo stati in grado di identificare due diverse piscine di proteine ​​distinte legandosi agli anticorpi secondari fluorescenti marcate cuscinetto diverso fltags ENT. Così, siamo stati in grado di distinguere proteina che era stato internalizzato per endocitosi in fase anticorpo incubazione da proteine ​​che sia rimasto sulla superficie cellulare o è stato oggetto di traffico alla superficie durante questo periodo. Usando questo metodo, abbiamo stabilito che la proteina di interesse viene trafficata da e superficie cellulare nei neuroni. Pertanto, questa tecnica relativamente veloce e semplice dimostrato più informativo rispetto ai metodi tradizionali immunocitochimica o pre-embedding microscopia elettronica immunogold, nonostante il fatto che abbiamo usato lo stesso antisiero policlonale di coniglio per tutte queste tecniche. Questa tecnica è generalmente applicabile a qualsiasi proteina transmembrana fornito una buona anticorpo che riconosce epitopi dominio extracellulare è disponibile. La tecnica è stata utilizzata in precedenza per studiare traffico recettore del recettore glutammato GluR1 subunità ^5.

Protocollo

1. Dissociato ippocampale Neuron Cultura

1. Preparare coprioggetto (vetro borosilicato):
   1. Lavare in etanolo al 100%.
   2. Aria secca sotto irraggiamento UV.
   3. Coat con poli-D-lisina (0,5 mg / ml in 0,15 M tampone borato, una notte a 4 ° C).
   4. Il giorno successivo (il giorno della cultura) lavare 3 volte in PBS poi cappotto con laminina (2,5 mg / ml, mouse naturale laminina) 5% di siero di vitello + v / v di calore-inattivato fetale (FCS) diluito in PBS per 2 ore a 37 ° C.
2. Sezionare embrionali giorno 18 (E18) ippocampo di ratto e raccogliere in PBS contenente calcio e magnesio, refrigerati su ghiaccio. NOTA: tutti i protocolli sperimentali su animali sono stati approvati dal Comitato delle Università di Melbourne etico degli animali.
3. Preparare soluzioni di DNasi I papaina e dal kit di papaina dissociazione secondo le istruzioni del produttore.
   1. Aggiungere 50 microlitri soluzione di DNasi I per 1 ml di soluzione papaina.
   2. NOTA: una voltaprima preparata, la soluzione papaina e le soluzioni di DNasi I possono essere somministrati separatamente in aliquote (0,5 ml e 25 microlitri aliquote di papaina e DNasi I, rispettivamente) e conservati a -20 ° C fino al momento dell'uso.
4. Rimuovere il più possibile PBS e incubare dell'ippocampo (da una cucciolata di embrioni) con 1 ml papaina / DNasi soluzione a 37 ° C per 15-20 min. Flick delicatamente la provetta per mescolare il contenuto due volte durante il periodo di incubazione.
5. Triturare il tessuto dell'ippocampo delicatamente (evitando la generazione di bolle) con una pipetta Pasteur siliconata 10-15x fiamma lucidata fino ad ottenere dispersione cellulare e poche, se del caso, pezzi di tessuto non dissociato rimangono.
6. Strato con cautela la sospensione cellulare dissociato su un cuscino 3 ml del 4% w / v albumina di siero bovino (BSA) in Hanks soluzione salina bilanciata più additivi (HBSS ^+; vedi Sezione 1.6.1).
   1. Preparare questa soluzione passo gradiente sciogliendo la BSA a temperatura ambiente senza agitazioneAnello in HBSS contenente 2 mM CaCl _2, 1 MgSO mm _4, 4 NaHCO mm ₃ e glucosio mm 40 (HBSS ⁺⁾ poi filtro sterile e conservare a 4 ° C.
7. Centrifuga, 100 xg, 7 min in una centrifuga da banco con rotore swing-out.
8. Rimuovere il surnatante facendo attenzione a non aspirare il pellet.
9. Risospendere le cellule pellet delicatamente con un lucido fiamma (siliconata) pipetta Pasteur (o 1 ml blu puntale) in 1 ml di mezzo completo Neurobasal (con il 2% B27, 0.5 mM L-glutammina integrato con 1% FCS).
10. Conta due aliquote 10 microlitri utilizzando un emocitometro (NB solo contare le celle in fase brillante come cellule "live").
11. Piatto neuroni primari su vetrini rivestiti già predisposti (0,75-1 x 10 ^5/18 millimetri coprioggetto in 12-pozzetti). Immediatamente prima di placcatura, aspirare la soluzione laminina / siero in eccesso dal coprioggetto e sostituirlo con terreno di coltura neurone primario (vedi sotto). NB Il n necessariaumero di coprioggetto deve essere determinata in anticipo come preparazione vetrino è iniziata il giorno precedente alla cultura (vedi punto 1.1).
12. Cultura ratto primario E18 neuroni dell'ippocampo per un massimo di 21 giorni in vitro (DIV) in Neurobasal medio, 2% B27, 0.5 mM L-glutammina supplementato con 1% FCS (inattivato con il calore). Eseguire un cambiamento mezza mezzo alle 7 DIV e poi settimanalmente. L'anti-mitotico fluorodeossiuridina / uridina è aggiunto 7 DIV, 1/1, 000 diluizione di 10 stock mM di ciascun nucleoside) per prevenire la crescita eccessiva gliale.

2. Incubazione di Live neuroni

1. Durante la prima settimana di cultura, i neuroni stanno sviluppando pergole dendritiche e per settimana 2-3, i neuroni hanno maturato sufficiente essere in fase di synaptogenesis ^6,7.
   1. Al selezionati time sperimentale di punti / s, applicare l'anticorpo primario di triplicare pozzetti contenenti neuroni embrionali primarie sul coprioggetto. Aggiungere un volume dell'anticorpo direttamente nel mezzo di coltura dii neuroni primari alla diluizione finale desiderato Nota: In questo esempio, un antisiero policlonale di coniglio diretto contro una forma secreta della proteina ricombinante è stato diluito 1/500 con l'aggiunta di 2 ml di 1 ml di terreno di coltura in bene; una centrifugazione per 10 min , 13.000 xg, RT può essere incorporato prima di prendere una aliquota di anticorpo come questo sarà rimuovere particelle e può aiutare a ridurre sfondo.
   2. Per i controlli di siero preimmune, aggiungere una quantità equivalente di siero preimmune (alla stessa diluizione finale). Se nessun siero preimmune è disponibile, aggiungere il volume equivalente di Neurobasal media o PBS (senza controllo anticorpo primario). In alternativa, se un anticorpo primario adatto è disponibile che riconosce intracellulare regione / s della proteina, questo anticorpo può essere aggiunto a un controllo bene per testare specificità della colorazione superficiale.
   3. Riportare le cellule per l'incubatore culturale per 1-4 ore (il periodo di incubazione può essere determinato empiricamente). Nel nostro experimeNTS, l'anticorpo era presente per l'intero periodo anche se il disegno sperimentale potrebbe integrare un impulso di anticorpo seguito da un ulteriore periodo di incubazione dopo wash-out (un esperimento pulse-chase) per valutare l'andamento temporale di internalizzazione.
      Passaggio facoltativo: Questo incubazione può essere eseguita a temperatura ambiente o anche su ghiaccio per rallentare il tasso di basale proteina interiorizzazione, se necessario. Se eseguita in un ambiente non controllato CO _2, il terreno deve essere cambiato in uno che non è bicarbonato buffer prima aggiunta di anticorpo / antisiero. ATTENZIONE: colture di neuroni maturi (> 14 giorni, e in particolare colture di neuroni embrionali di topo) non tollerano i cambiamenti completi di medie bene.
2. Abbiamo usato tempi di incubazione per questo anticorpo primario internalizzazione passo di 1 ora, 2 ore, 4 ore e con buoni risultati anche se il tempo ottimale dipenderà abbondanza della proteina di interesse e le dinamiche di traffico di proteine ​​nel cells in fase di studio.
   NOTA: Le immagini a due colori visualizzati in Risultati rappresentativi sono stati ottenuti con una incubazione di 1 ora a 37 ° C in un incubatore di coltura tissutale.
3. Dopo incubazione per il periodo desiderato, aspirare via il mezzo contenente anticorpi. Lavare i pozzetti delicatamente ma rapidamente una volta con PBS a temperatura ambiente.

3. Anticorpo secondario Applicazione ai fissi, celle Unpermeabilized

1. Fissare i neuroni con il 4% paraformaldeide in tampone fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente Nota: per i migliori risultati, utilizzare fissativo preparato al momento, in alternativa utilizzare correzione che è stata conservata a -20 ° C e completamente scongelati in modo che nessun paraformaldeide precipitato è evidente . ATTENZIONE: fissativo Paraformaldeide dovrebbe essere preparata e gestita in una cappa aspirante.
2. Rimuovere fix da pozzi (trasferimento nel contenitore rifiuti liquidi in cappa) e sciacquare 3x con PBS.
   1. PASSO OPTIONAL: Se lo si desidera, per risparmiare sui reagenti anticorpi, i coprioggetti puòessere accuratamente rimosso dalla piastra 12 pozzetti con una pinza e collocato cellula-side-up, su un foglio di Parafilm prevista sulla base di una piastra di coltura monouso.
   2. Le soluzioni possono poi essere pipettati delicatamente sul coprioggetto in modo da essere completamente coperta senza inondazioni soluzione oltre il bordo del vetrino sul parafilm.
   3. Questa tecnica è adatta per incubazioni breve termine (1-2 hr) tuttavia più incubazioni (ad esempio durante la notte) deve essere effettuata in una camera umidificata. In alternativa, i coprioggetti possono essere riposti nei pozzetti della piastra 12 pozzetti per la notte di incubazione e volume sufficiente devono essere aggiunti per garantire che i coprioggetti non si seccano.
3. Blocco per 30 min a temperatura ambiente con il 5% BSA in PBS (Nota: non aggiungere detersivo per la soluzione di saturazione in questa fase, è importante che le cellule non sono permeabilizzate).
4. Per etichettare proteina di superficie prima di procedere con ricozione di proteine ​​interiorizzata, applicare il primo fluorescente 2 ° anticorpi di scelta.
   Nota: Nell'esempio qui descritto, l'antisiero primario è stata sollevata nel coniglio (anticorpo in-house) ad una isoforma secreta ricombinante ^4. Così, per il primo anticorpo secondario per rilevare la regione extracellulare della isoforma transmembrana sulla superficie dei neuroni unpermeabilized, abbiamo usato asino anti-coniglio DyLight 649 (1/200 diluito in PBS contenente 5% BSA). Si consiglia di centrifugare soluzioni diluite di anticorpo secondario (10 min, 13.000 XG, RT) prima dell'uso.
5. Incubare i coprioggetti per 2 ore a temperatura ambiente.
6. Lavare coprioggetto (in pozzi), 2x 5 minuti con PBS.

4. Blocco con eccesso Unlabeled 2 ° Antibody

1. Bloccare i neuroni unpermeabilized ad alta concentrazione (> 0,1 mg / ml) di anticorpo non marcato 2 °.
   1. L'anticorpo non marcato ° 2 deve essere sollevata contro la specie in cuil'anticorpo primario è stata sollevata (in questo caso coniglio) mediante incubazione per una notte a temperatura ambiente.
   2. Per questo protocollo, AffiniPure F _ab frammento IgG di capra anti-coniglio (H + L) è stato utilizzato ad una concentrazione di 0,13 mg / ml.
      NOTA: La notte di incubazione è risultato essere cruciale come un periodo di incubazione più breve (2 ore) era insufficiente per il completo blocco di anticorpo primario che non è stato completamente vincolata dalla anticorpo secondario marcato.
2. Lavare coprioggetto (in pozzi), 2x 5 minuti con PBS.
3. Dopo questa fase di blocco, post-fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in tampone fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente. Risciacquare con PBS (2x) dopo la rimozione di fissativo (trasferimento fissativo al contenitore dei rifiuti liquidi in cappa).

5. Permeabilizzazione e applicazione della anticorpo Seconda fluorescenza coniugato 2 °

1. Permeabilize e bloccare le cellule con 5% BSA in PBS contenente 0,1% Triton-X-100 a camera temperatura per 30 min.
2. Rimuovere la soluzione di saturazione (facendo attenzione che i vetrini non si seccano). Aggiungere il secondo fluorescente coniugato 2 ° anticorpo etichettato con un fluoroforo diverso.
   1. NOTA: Deve essere possibile distinguere questo tag fluoroforo da quello utilizzato in precedenza, a seconda dei filtri di eccitazione / emissione disponibili sul microscopio confocale (vedi sotto).
   2. Per l'esempio presentato in questo protocollo, un Alexa Fluor 488 asino coniugato anti-coniglio 2 ° anticorpo è stato usato (1/200 in PBS, 5% BSA e 0,1% Triton-X-100). Incubare 2 ore a temperatura ambiente, quindi rimuovere la soluzione di anticorpi 2 °.
3. Lavare 3x coprioggetto 5 minuti con PBS e, infine, Lavare rapidamente con acqua deionizzata.

6. Montaggio e Imaging

1. Mount coprioggetto su vetrini con un mezzo contenente il montaggio antifade acquosa (ad es Vectashield) e lasciare asciugare. Conservare al buio a 4 ° C per optimal conservazione della intensità del segnale fluorescente.
2. Immagine immunostained celle di un microscopio confocale.
   1. Opportuni filtri di eccitazione ed emissione per il rilevamento dei due segnali fluoroforo devono essere disponibili.
   2. Se diverse condizioni sperimentali devono essere confrontati (per esempio, i tassi di internalizzazione sotto depolarizzati ^8,9 o controllo condizioni), in modo che tutti replicano vetrini delle varie condizioni vengono esposte con gli stessi parametri di acquisizione dell'immagine. La densità integrata delle regioni standard di interesse o attributi puncta (ad esempio, numero, dimensione) delle immagini risultanti possono quindi essere misurata utilizzando il software di analisi di immagine standard (ad esempio, Fiji / ImageJ, Metamorph).

Risultati

Il bicolore tecnica immunoistochimica fluorescente qui presentato è utile per etichettare domini extracellulari di proteine ​​transmembrana in cellule viventi (mostrato schematicamente in figura 1). Durante il periodo di incubazione, le immunoglobuline si legano epitopi accessibili e una parte della popolazione di molecole proteiche, insieme con anticorpo legato, è endocitosi. Inoltre, le proteine ​​di nuova sintesi può raggiungere la superficie cellulare attraverso un traffico di andata e mo...

Discussione

La tecnica qui descritta è complementare a quella di biotinylation superficie cellulare (valutato da Arancibia-Carcamo et al.) ¹² ed è il metodo di scelta per conservare informazioni sulla localizzazione subcellulare della proteina internalizzato, disponibile un anticorpo primario adatto ad un epitopo extracellulare è disponibile. Inoltre, la quantificazione del traffico di proteine ​​/ internalizzazione nel tempo può essere eseguita (fissando coprioggetto in momenti diversi durante l'inc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
Fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
Uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm Round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206