Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

Resumo

Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.

Resumo

A fim de demonstrar a localização da superfície da célula de um receptor transmembranar putativo em neurónios em cultura, que marcado a proteína na superfície dos neurónios vivos com um anticorpo primário específico criado contra uma porção extracelular da proteína. Dado que os receptores são de tráfico de e para a superfície, se as células são permeabilizadas após a fixação, em seguida, tanto na superfície celular e da proteína interna irá ser detectada pelo mesmo anticorpo secundário marcado. Aqui, nós adaptamos um método utilizado para estudar o tráfico de proteína ("alimentação anticorpo") para a proteína diferencialmente etiqueta que tinham sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpo e proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período . A capacidade de distinguir estas duas piscinas de proteína tornou-se possível através da incorporação de um passo de bloqueio durante a noite com anticorpo secundário sem rótulo altamente concentrada após um incubatio inicialn de neurónios unpermeabilized com um anticorpo secundário marcado por fluorescência-. Após o bloqueio de fase, a permeabilização dos neurónios permitiram a detecção da piscina internalizado com um anticorpo secundário fluorescente marcada com um fluoróforo diferente. Usando esta técnica nós fomos capazes de obter informações importantes sobre a localização subcelular deste receptor putativo, revelando que ele era, de fato, traficadas para a superfície celular em neurônios a. Esta técnica é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células e proteínas da superfície celular, proporcionando um anticorpo adequado para um epitopo extracelular está disponível.

Introdução

Ao estabelecer a função das proteínas recém-identificadas, a investigação da localização subcelular e do tráfico da proteína em questão pode fornecer pistas importantes sobre o provável papel / s de ^1,2 proteína. Análise bioinformática do transcriptoma do neocórtex desenvolver ³ nos forneceu uma lista de genes que apresentam expressão alterada durante rato corticogenesis cérebro. Em seguida, adoptou uma abordagem gene knockout para determinar que a proteína codificada por um destes genes, sez6, tem um papel chave no desenvolvimento neuronal. Observou-se que o gene relacionado com Apreensão 6, ou Sez6, proteína está localizado em dendritos em desenvolvimento e também está presente nas espinhas dendriticas, as estruturas especializadas em dendritos que recebem e integram sinais excitatórios. Além disso, quando esta proteína está ausente, os dendritos e sinapses excitatórias falhar para formar correctamente ^4. A isoforma dominante provável da proteína tem características de um transmembrane do receptor embora, quando a distribuição sub-celular da proteína immunolabeled foi examinada por microscopia confocal ou por microscopia imunoelectrónica a maioria, se não a totalidade, do sinal apareceram associadas a pequenas vesículas no compartimento somatodendrítico com pouco, ou nenhum, proteína marcada na membrana plasmática na superfície da célula.

A fim de demonstrar definitivamente que este receptor putativo com um grande domínio extracelular predito é de tráfico para a membrana plasmática, que adoptou uma abordagem em células vivas, utilizando o anti-soro que havia gerado a uma porção extracelular da proteína para identificar a proteína na superfície da célula. Ao combinar esta abordagem "alimentação anticorpo", com duas aplicações de anticorpo secundário marcado diferencialmente separados por um passo de bloqueio grande e um passo de permeabilização, fomos capazes de identificar dois conjuntos diferentes de proteínas que se distinguem por ligação a anticorpos secundários marcados fluorescentemente rolamento fluores diferenteetiquetas rentes. Assim, nós fomos capazes de distinguir a proteína que tinha sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpos a partir de proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período. Usando este método, foi estabelecido que a proteína de interesse é de tráfico de e para a superfície da célula em neurónios. Portanto, essa técnica relativamente rápido e simples mostrou-se mais informativo do que os métodos tradicionais ou imunocitoquímica microscopia eletrônica de imuno pré-incorporação, apesar do fato de que usamos o mesmo anti-soro policlonal de coelho para todas estas técnicas. Esta técnica é geralmente aplicável a qualquer proteína transmembranar prevista uma boa anticorpo que reconhece os epítopos de domínio extracelular é acessível. A técnica tem sido utilizada anteriormente para estudar o tráfico do receptor do receptor de glutamato GluR1 subunidade ^5.

Protocolo

1. Dissociated Hippocampal Neuron Cultura

1. Prepare lamelas (vidro borosilicato):
   1. Lavar com 100% de etanol.
   2. Ar seco sob irradiação UV.
   3. Revestimento com poli-D-lisina (0,5 mg / ml em tampão de borato de 0,15 M, durante a noite a 4 ° C).
   4. No dia seguinte (dia de cultura) lavar 3x em PBS, em seguida, o revestimento com laminina (2,5 ug / ml, rato natural, laminina) + 5% v / v de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (FCS) diluído em PBS durante 2 horas a 37 ° C.
2. Dissecar embrionárias dia 18 (E18) hipocampo de ratos e recolher em PBS contendo cálcio e magnésio, arrefecidas em gelo. Nota: Todos os protocolos experimentais envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Melbourne.
3. Prepare a papaína e soluções de DNase I do kit de dissociação de papaína de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Adicionar uma solução de 50 ul de ADNase I a 1 ml de solução de papaína.
   2. NOTA: Uma vezprimeiro preparada, a solução de papaína e as soluções de DNase I pode ser suspensa em separado em alíquotas (0,5 mL e 25 mL alíquotas para a papaína e DNase I, respectivamente) e armazenadas a -20 ° C até ser necessário.
4. Remover o máximo possível de PBS e incubar hipocampo (a partir de uma ninhada de embriões) com 1 ml de papaína / ADNase I solução a 37 ° C durante 15-20 min. Agite suavemente o tubo para misturar os conteúdos duas vezes durante o período de incubação.
5. Tritura-se o tecido do hipocampo suavemente (evitando a geração de bolhas) com uma pipeta de Pasteur siliconizada 10-15x chama-polido até a dispersão de células é obtida e poucas, se alguma, os pedaços de tecido permanecem dissociadas.
6. Camada cuidadosamente a suspensão de células dissociadas através de uma almofada de 3 ml de 4% w / v de albumina de soro bovino (BSA) em solução salina equilibrada de Hanks mais aditivos (HBSS ^+; ver secção 1.6.1).
   1. Preparar esta solução gradiente passo a dissolução da BSA, à temperatura ambiente, sem agitaçãoanel em HBSS contendo 2 mM de _CaCl2, 1 mM _MgSO4, 4 mM de _NaHCO3 e 40 mM de glucose (HBSS ⁺⁾ depois de filtro estéril e armazenar a 4 ° C.
7. Centrífuga, 100 xg, 7 min em uma centrífuga de bancada com um rotor swing-out.
8. Remover o sobrenadante com cuidado para não aspirar o pellet celular.
9. Ressuspender as células peletizadas suavemente com uma polida à chama (siliconizada) pipeta de Pasteur (ou um 1 ml azul ponta de pipeta) em 1 ml de meio Neurobasal completo (com 2% B27, 0,5 mM de L-glutamina, suplementado com 1% de FCS).
10. Contagem duas alíquotas de 10 ul usando um hemocitômetro (apenas NB contagem de células de fase brilhante como células "ao vivo").
11. Placa neurônios primários sobre preprepared lamínulas de vidro revestidos (0,75-1 x 10 ^5/18 milímetros lamela em 12 poços da placa). Imediatamente antes do plaqueamento, aspirar o excesso de solução de laminina / soro de lamelas e substitua com meio de cultura de neurónios primários (ver abaixo). NB O n necessárioúmero de lamelas precisa ser determinado com antecedência como preparação lamela é iniciado no dia anterior à cultura (veja o passo 1.1).
12. Cultura de rato primária E18 neurónios do hipocampo para até 21 dias in vitro (DIV) em meio Neurobasal, 2% B27, 0,5 mM de L-glutamina, suplementado com 1% de FCS (inactivado pelo calor). Realizar uma mudança de meia meio às 7 DIV e, semanalmente. O anti-mitótico fluorodesoxiuridina / uridina é adicionado a 7 DIV, 1/1, 000 a diluição de 10 mM estoque de cada nucleósido) para evitar o crescimento excessivo da glia.

2. Incubação de anticorpos com o Live Neurônios

1. Durante a primeira semana de cultura, os neurônios estão se desenvolvendo árvores dendríticas e por semana 2-3, neurônios amadureceram o suficiente para ser submetido a sinaptogênese ^6,7.
   1. No selecionados tempo experimental de ponto / s, aplicar o anticorpo primário para triplicar poços contendo neurônios embrionários primários sobre lamínulas. Adicionar uma parte alíquota do anticorpo directamente para o meio de cultura deos neurónios primários para a diluição final desejada Nota: No nosso exemplo, um anti-soro policlonal de coelho criado contra uma forma segregada da proteína recombinante foi diluída 1/500 por adição de 2 ul de 1 ml de meio de cultura no poço; uma centrifugação durante 10 min , 13.000 xg, RT pode ser incorporado antes de tomar uma alíquota de anticorpo como isso irá remover partículas e pode ajudar a reduzir o fundo.
   2. Para os controlos de soro pré-imune, adicionar uma quantidade equivalente de soro pré-imune (para a mesma diluição final). Se não está disponível soro pré-imune, adicionar o volume equivalente de meio Neurobasal ou PBS (controlo sem anticorpo primário). Alternativamente, se um anticorpo primário adequado está disponível, que reconhece a região intracelular / s da proteína, este anticorpo pode ser adicionado a um poço de controlo, a fim de testar a especificidade da coloração de superfície.
   3. Devolver as células para a incubadora de cultura durante 1-4 h (este período de incubação pode ser determinado empiricamente). No nosso experiments, ​​o anticorpo estava presente durante todo o período, embora o delineamento experimental poderia incorporar um pulso de anticorpo seguida por um novo período de incubação após o wash-out (um experimento de pulso-caça) para avaliar o curso de tempo de interiorização.
      Etapa opcional: A incubação pode ser realizada à temperatura ambiente ou até mesmo sobre gelo para reduzir a taxa de internalização proteína basal, se necessário. Se realizada em um ambiente _não-CO2 controlado, o meio deve ser alterado para um que não é o bicarbonato tamponado antes da adição do anticorpo / anti-soro. CUIDADO: culturas de neurônios maduros (> 14 dias, e particularmente em cultura de neurônios de rato embrionárias) não toleram mudanças médio completo bem.
2. Nós temos utilizado tempos de incubação para este passo de internalização do anticorpo primário de 1 hora, 2 horas, 4 horas e com bons resultados, embora o tempo óptimo dependerá abundância da proteína de interesse, bem como a dinâmica do tráfego de proteínas no cells em estudo.
   NOTA: As imagens dupla de cor mostrados no Resultados representativos foram obtidos com um período de incubação de 1 hora a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos.
3. Após incubação durante o período desejado, aspirar fora o meio contendo o anticorpo. Lavar os poços cuidadosamente mas rapidamente, uma vez com PBS à temperatura ambiente.

3. Aplicação anticorpo secundário para fixos, células Unpermeabilized

1. Fix neurónios com 4% de paraformaldeído em tampão fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente Nota: para obter os melhores resultados, usar fixador recém-preparado, em alternativa utilizar correcção que foi armazenada a -20 ° C e descongeladas por completo, de modo que não paraformaldeído precipitado é evidente . CUIDADO: fixador paraformaldeído devem ser preparados e manuseados em uma coifa.
2. Remover correção de poços (transferir para recipiente de resíduos líquidos na coifa) e lavar 3x com PBS.
   1. PASSO OPCIONAL: Se desejar, para economizar reagentes de anticorpos, as lamelas podemser cuidadosamente removido da placa de 12 poços com uma pinça e colocado célula do lado do plano, para uma folha de Parafilm colocada sobre a base de uma placa de cultura descartável.
   2. As soluções podem ser então pipetada suavemente sobre as lamelas de cobertura de modo a que eles estão completamente cobertas, sem o alagamento solução sobre a extremidade da lamela para o Parafilm.
   3. Esta técnica é adequada para as incubações a curto prazo (1-2 hr) no entanto mais incubações (por exemplo durante a noite), deve ser levada a cabo numa câmara humidificada. Alternativamente, as lamelas podem ser colocados de volta para os poços da placa de 12 poços para a incubação durante a noite e o volume suficiente deve ser adicionado para garantir que as lamelas não secam.
3. Bloco durante 30 min à temperatura ambiente com 5% de BSA em PBS (Nota: Não adicionar detergente para a solução de bloqueio, nesta fase, uma vez que é importante que as células não sejam permeabilizadas).
4. A fim de marcar a proteína de superfície, antes de prosseguir com o detectorção de proteína internalizada, aplique a primeira fluorescente etiquetado 2 ° anticorpo de escolha.
   Nota: No exemplo aqui descrito, o anti-soro primário foi aumentado em coelho (anticorpo em casa) com uma isoforma segregada recombinante ^4. Assim, para o primeiro anticorpo secundário para detectar a região extracelular da isoforma transmembranar na superfície de neurónios unpermeabilized, utilizamos de burro anti-coelho Dylight 649 (1/200 diluídos em PBS contendo BSA a 5%). Recomenda-se a centrifugar soluções de anticorpo secundário diluído (10 min, 13.000 xg, temperatura ambiente) antes de usar.
5. Incubar as lamelas durante 2 horas à temperatura ambiente.
6. Lavar as lamelas (em poços), 2x 5 min com PBS.

4. O bloqueio com excesso não marcado 2 ° Anticorpo

1. Bloquear os neurónios unpermeabilized com uma concentração elevada (> 0,1 mg / ml) de anticorpo não marcado de 2 °.
   1. O anticorpo não marcado 2 ° deve ser levantada contra as espécies em queo anticorpo primário foi elevada (neste caso de coelho) por uma noite de incubação à temperatura ambiente.
   2. Para este protocolo, AffiniPure F _ab fragmento de IgG de cabra anti-coelho (H + L) foi utilizado a uma concentração de 0,13 mg / ml.
      NOTA: A incubação durante a noite foi considerado crucial como um período de incubação mais curto (2 h) era insuficiente para o bloqueio completo do anticorpo primário que não foi totalmente ligado pelo anticorpo secundário marcado.
2. Lavar as lamelas (em poços), 2x 5 min com PBS.
3. Após esta etapa de bloqueio, após a fixar as células com paraformaldeído a 4% em tampão fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente. Lavar com PBS (2x) após a remoção do fixador (transferência fixador de recipiente de resíduos líquidos na coifa).

5. Permeabilização e Aplicação da Segunda fluorescência Conjugado 2 ° Antibody

1. Permeabilizar as células e bloquear com BSA a 5% em PBS contendo 0,1% de Triton-X-100, no quarto temperatura de 30 min.
2. Remover a solução de bloqueio (tomando cuidado para que as lamelas não secar). Adicionar o segundo fluorescente conjugado com 2 ° o anticorpo marcado com um fluoróforo diferente.
   1. NOTA: deve ser possível distinguir esta tag fluoróforo do utilizado anteriormente, de acordo com os filtros de excitação / emissão disponíveis no microscópio confocal (ver abaixo).
   2. Para o exemplo apresentado no presente protocolo, uma Alexa Fluor 488-burro anti-coelho conjugado 2 ° anticorpo foi usado (1/200 em PBS, BSA a 5% e 0,1% de Triton-X-100). Incubar 2 horas à temperatura ambiente, em seguida, remover a solução de anticorpo 2 °.
3. Lavar lamelas 3x 5 minutos, com PBS e, por fim, lavar brevemente com água desionizada.

6. Montagem e Imagem

1. Monte lamelas em lâminas de vidro com um meio contendo montagem antifade aquosa (por exemplo Vectashield) e deixar secar. Loja no escuro a 4 ° C para opTimal preservação da intensidade do sinal fluorescente.
2. Imagem histoquímica células em um microscópio confocal.
   1. Excitação e emissão de filtros adequados para a detecção dos dois sinais de fluoróforo deve estar disponível.
   2. Se diferentes condições experimentais devem ser comparadas (por exemplo, as taxas de internalização sob despolarizados ^8,9 ou controle de condições), garantir que todos os replicar lamelas das várias condições são fotografados com os mesmos parâmetros de aquisição de imagem. A densidade integrada das regiões de interesse normais ou os atributos puncta (por exemplo, o número, tamanho) das imagens resultantes podem então ser medida utilizando software de análise de imagem padrão (por exemplo, Fiji / ImageJ, Metamorph).

Resultados

A dupla cor técnica imunocoloração fluorescente aqui apresentado é útil para a marcação de domínios extracelulares de proteínas transmembranares, em células vivas (mostrado esquematicamente na Figura 1). Durante o período de incubação, as imunoglobulinas ligam epítopos acessíveis e uma parte da população das moléculas de proteína, juntamente com o anticorpo ligado, é sujeita a endocitose. Além disso, a proteína sintetizada pode atingir a superfície da célula através de tráfico ...

Discussão

A técnica aqui descrita é complementar à da biotinilação da superfície celular (revisto por Arancibia-CARCAMO et al.) ¹² e é o método de escolha para preservar a informação sobre a localização subcelular da proteína internalizado, proporcionado um anticorpo primário adequado para uma epitopo extracelular está disponível. Em adição, a quantificação de proteína tráfico / internalização ao longo do tempo pode ser realizada (por lamelas, que fixa em diferentes momentos ao longo da...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS with Ca and Mg	Invitrogen	14040182
Neurobasal medium	Invitrogen	21103-049
B27 supplement	Invitrogen	17504-044
L-glutamine	Invitrogen	25030-081
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical Corporation	PDS
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich Australia	A9418
Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red	Invitrogen (Gibco)	14175-079
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich Australia	P0899
Natural mouse laminin	Invitrogen	23017-015	Thaw on ice prior to making aliquots
Fetal bovine serum HyClone	Thermo Fisher
fluorodeoxyuridine	Sigma Aldrich Australia	F0503
uridine	Sigma Aldrich Australia	U3003
18 mm round glass coverslips	Menzel Gläser	CB00180RA1
VECTASHIELD aqueous mounting medium	Vector Laboratories	H1400
Donkey anti-rabbit Dylight 649	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-495-152
AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-007-003
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich Australia	P6148	TOXIC - handle in fume hood
Triton-X-100	Sigma Aldrich Australia	T8787
Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody	Invitrogen - Molecular Probes	A21206