أسرع الغربية في المدينة: لمسة عصرية على تحليل كلاسيكي غربي وصمة عار

Summary

هذا البروتوكول يستكشف أحدث التطورات في أداء تحليلات لطخة غربية. هذه التعديلات رواية توظف نظام هلام مكرر تريس مع 35 دقيقة الكهربائي تشغيل الوقت، جافة نظام نقل النشاف 7 دقائق، والأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري والتصوير الذي يولد دقة أعلى، والجودة، والحساسية، وتحسين دقة البيانات الغربية.

Abstract

لا تزال تستخدم تقنيات لطخة غربية التي أنشئت أصلا في أواخر 1970s بنشاط اليوم. ومع ذلك، وهذه الطريقة التقليدية للالنشاف الغربية لديها العديد من السلبيات التي تشمل دقة منخفضة الجودة، والعصابات زائفة، وانخفاض حساسية، وضعف النزاهة البروتين. التطورات الحديثة قد تحسنت بشكل كبير جوانب عديدة من بروتوكول لطخة غربية القياسية لإنتاج بيانات نوعية وكمية أعلى. نظام هلام مكرر تريس، بديلا لنظام Laemmli التقليدية، ويولد أفضل فصل البروتين والقرار، ويحافظ على سلامة البروتين، ويقلل الكهربائي لفترة 35 دقيقة التشغيل. وعلاوة على ذلك، فإن النظام النشاف الجاف iBlot، ويحسن بشكل كبير من فعالية وسرعة نقل البروتين إلى غشاء في 7 دقائق، والذي هو على النقيض من الأساليب نقل البروتين التقليدية التي غالبا ما تكون غير فعالة أكثر مع أوقات نقل طويلة. في تركيبة مع هذه التعديلات المبتكرة، البروتين دetection باستخدام نتائج التصوير بالأشعة تحت الحمراء الفلورسنت في ذات جودة أعلى وأكثر دقة وبيانات متسقة بالمقارنة مع تقنية النشاف الغربية القياسية من معان كيميائي. هذه التكنولوجيا يمكن الكشف عن مستضدات مختلفة في وقت واحد اثنين على نفس الغشاء من خلال الاستفادة من اللونين الأصباغ القريب من الأشعة تحت الحمراء التي تصور في قنوات مختلفة الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، والخطي واسعة النطاق الديناميكي التصوير الفلورسنت يسمح لتقدير الدقيق للنطاقات على حد سواء القوي والضعيف البروتين. وهكذا، يصف هذا البروتوكول التحسينات الرئيسية لطريقة النشاف الغربية الكلاسيكية، والتي هذه التطورات إلى زيادة كبيرة في نوعية البيانات مع خفض كثيرا من الوقت أداء هذه التجربة.

Introduction

وقد تم تطوير هذه التقنية من النشاف الغربية الأولى بين عامي 1977 و 1979 من أجل خلق أفضل طريقة للكشف عن البروتينات باستخدام الأجسام المضادة ^1-3. هذا الإجراء يستخدم الكهربي نقل البروتينات من الهلام إلى الغشاء من SDS-PAGE مع البروتينات الهدف تصور باستخدام الأجسام المضادة الثانوي والكشف عنها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية، أو ناتج التفاعل البيروكسيديز ^3. وبالتالي، لا تزال تستخدم على نطاق واسع نفس هذه المبادئ الأساسية في البروتوكولات لطخة غربية اليوم. ومع ذلك، هذه التقنية النشاف الغربية الكلاسيكية يفعل الحاضر العديد من العيوب، مثل أوقات الشدة المدى الكهربائي، دقة منخفضة وشرائح البروتين الاصطناعي، وقابلية للتحلل البروتين، وحساسية محدودة فضلا عن ضعف جودة البيانات ^4. لذا، يصف هذا البروتوكول السلف وتحسينات كبيرة لإجراء طخة غربية القياسية التي يولد البيانات النوعية والكمية أكثر دقة.

"> نظام Laemmli لفصل مجموعة واسعة من البروتينات باستخدام SDS-PAGE هو النظام الأكثر استخداما على نطاق واسع هلام لالنشاف الغربية ^5. على الرغم من شعبية هذا النظام النشاف الغربية، ويمكن هذا الأسلوب يؤدي إلى تشويه الفرقة، وفقدان القرار، و نطاقات زائفة ^4. هذا قد يكون نتيجة لنزع الأمين والألكلة من البروتينات نظرا لارتفاع درجة الحموضة (9.5) من هلام فصل، عودة التأكسد انخفاض السندات ثاني كبريتيد بسبب حالة الأكسدة متفاوتة من هلام، والانقسام من aspartyl-prolyl السندات الببتيد بسبب تسخين البروتين في Laemmli العازلة (درجة الحموضة 5.2) ^4،6. نظام هلام مكرر تريس، التي تعمل في درجة الحموضة محايد (7.0)، ويوفر فوائد كبيرة على النظام Lamemmli. يحسن هذا النظام الاستقرار البروتين، ويقلل التعديلات البروتين، ويحافظ على البروتينات في ولاياتهم انخفاض، ويمنع aspartyl-prolyl الانقسام خلال الكهربائي، والأهم من ذلك، الكهربائي تشغيل الوقت هو 35 دقيقة ^4،6،7. وبالإضافة إلى ذلك، رنظام هلام انه مكرر تريس تنتج أيضا العصابات أكثر وضوحا، وارتفاع القرار، والانفصال، وزيادة حساسية مما أدى إلى المزيد من البيانات الموثوقة ^4.

بالتزامن مع نظام هلام مكرر تريس، يستخدم النظام النشاف الجاف iBlot عالية القوة الميدانية والتيارات إلى الحد بشكل كبير من الوقت نقل البروتينات من الهلام على الأغشية خلال 7 دقائق ^8. ويستند هذا النظام على طريقة نقل النشاف الجاف الذي يولد نقل أكثر كفاءة وموثوق بها من البروتينات ^8. لمقارنة تفصيلية لفعالية نظام التحويل iBlot إلى أنظمة نقل التقليدية يرجى الرجوع إلى الموقع التالي: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . فإنه يستخدم أنود والكاثود المكدس، والتي تتألف من مصفوفة هلام التي تحتوي على مخازن النقل المناسب، والتي تكون بمثابة خزانات أيون ^8. أثناء عملية النقل، التحليل الكهربائي للماء يساعد على منع توليد الأكسجين من الأنود النحاس مما أدى إلى نقل بروتين أكثر اتساقا دون التسبب في تشويه الفرقة ^8. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام نقل أيضا يزيد من سرعة نقل عن طريق تقليل المسافة بين أقطاب ^8.

على الرغم من أن لمعان كيميائي هو الأسلوب الأكثر شيوعا والتقليدية للكشف عن البروتين لطخة غربية التحليلات، وهما لونا الأشعة تحت الحمراء كشف الفلورسنت يحسن إلى حد كبير حساسية، والجودة، ودقة البيانات لطخة غربية. يستخدم هذا الأسلوب الكشف بالأشعة تحت الحمراء ليزر الإثارة في اثنين من موجات الأمثل، 700 نانومترو 800 نانومتر، لتوليد صورة بيانات واضحة مع نسبة أكبر إشارة إلى الضوضاء وأعلى حساسية ^9. وبالتالي، يمكن تصور اثنين من البروتينات المستهدفة في وقت واحد على نفس الغشاء باستخدام نانومتر 700 و 800 نانومتر القنوات كشف الفلورسنت. الأهم من ذلك، والنطاق الديناميكي الخطي مضان الأشعة تحت الحمراء يسمح للتحليل الكمي الدقيق للنطاقات البروتين سواء القوي والضعيف ^9. علاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول مزايا وتحسينات هائلة على تقنية النشاف الغربية الكلاسيكية من خلال خفض الكهربائي ومرات نقل هذه التجربة دون المساس فعالية هذه العمليات وذلك باستخدام الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري لإنتاج أكبر لطخة غربية البيانات النوعية والكمية.

Protocol

1. إعداد الخلية لست الجامعة من خلية ثقافة

1. وضع أطباق زراعة الخلايا على الجليد وإضافة PBS الباردة مع 5 ملي EDTA (مثلا 5 مل من برنامج تلفزيوني مع 5 ملي EDTA/10 سم ² لوحة). إزالة الخلايا الملتصقة من الطبق باستخدام مكشطة الخلية ومن ثم نقل تعليق خلية إلى الباردة أنبوب 15 مل المخروطية.
2. بيليه تعليق خلية بواسطة السرعة المنخفضة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة (230 x ج) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. وضع أنابيب مخروطية على الجليد ونضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
3. غسل بيليه مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مع 5 ملي EDTA ونقل تعليق خلية إلى 1.5 مل الباردة أنبوب الطرد المركزي. تعليق سريع تدور في 13،000 دورة في الدقيقة (13،226 XG) لمدة 10 ثانية لتكوير الخلايا. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه ومكان أنابيب على الجليد.
4. resuspend وبيليه في 25-200 ميكرولتر (اعتمادا على حجم بيليه، أي لمدة 3 × 10 ⁶ خلايا إضافة ~ 150 ميكرولتر من العازلة RIPA) فيRIPA العازلة (50 ملي تريس، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.5 ملي EDTA، 10 ملي ناف، 0.1٪ SDS، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 1٪ NP-40) التي تحتوي على الأنزيم البروتيني وأضاف طازجة ومثبطات إنزيم الفوسفاتيز بتركيز نهائي 2X. لفترة وجيزة دوامة كل أنبوب واحتضان لمدة 20-30 دقيقة التعليق على الجليد. ملاحظة: هناك العديد من مخازن تحلل والتي يمكن استخدامها لاستخراج البروتينات، والتي تختلف في قدرتها على ذوبان البروتينات وقوة على تغيير طبيعة المنظفات (أي SDS، تريتون X-100، أو NP-40). العازلة RIPA مفيد لإعداد لست] خلية كاملة وتعطيل البروتين البروتين التفاعلات.
5. لإنشاء جزء آخر النووية، لست] أجهزة الطرد المركزي في 14،000 دورة في الدقيقة (15339 x ج) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل طاف لأنبوب جديد دون تعطيل بيليه ومكان أنابيب التخصيب النووي على الجليد. ملاحظة: بيليه التخصيب النووي قد فصل أيضا من الأنبوب أثناء استخراج طاف. لتجنب جمع بيليه التخصيب النووي، ضع طرف ماصة مباشرة طn لبيليه التخصيب النووي لزجة واستدراجه حتى مع ماصة من أجل التخلص منه.
6. تحديد تركيزات البروتين من كل عينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام هذه المقايسات البروتين الكمي كما BCA أو برادفورد.

2. عينة إعداد والكهربائي

1. إعداد كل عينة وفقا للجدول التالي المبين أدناه. كبديل، يمكن أن تستخدم أيضا β-المركابتويثانول في تركيز النهائي من 2.5٪. ومع ذلك، يجب إضافة عامل مختزل لكل عينة تصل إلى ساعة قبل تحميل هلام. مجموع الحسابات عن الاختلافات حجم pipetting لمع فقط 20 ميكرولتر من كل عينة أعدت تحميلها لكل بئر.

   REAGENT	نموذج تخفيض
   البروتين عينة	X ميكرولتر
   4X LDS العازلة عينة	6 ميكرولتر
   500 نانومتر DTT الأحمرucing كيل	2.4 ميكرولتر
   المياه منزوع الأيونات	ما يصل إلى 15.6 ميكرولتر
   اجمالى حجم التداول	24 ميكرولتر

2. عينات الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في حين أن العينات يتم تسخين، وإعداد 1،000 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل العازلة (50 مل 20x وزارة التربية والعلم أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت بالإضافة إلى 950 مل من الماء منزوع الأيونات). اجتماعات الأطراف تشغيل عازلة يحل البروتينات متوسطة الحجم بين 14-200 كيلو دالتون، في حين MES تشغيل المخزن المؤقت يحل البروتينات الوزن الجزيئي أصغر بين 2-200 كيلو دالتون مع انخفاض الباكاف الحمضية، والذي يسمح للMES تشغيل مؤقت لتشغيل أسرع من اجتماعات الأطراف ^4. وبالتالي، هذه المخازن المؤقتة اثنين والمتناقضة الآثار على هجرة الأيونات داخل هلام التراص الذي يؤدي إلى اختلافات في فصل العصابات البروتين ^4. جانبا والجمع بين 200 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت مع 500 ميكرولتر من مضادات الأكسدة، والتي سيتم استخدامها لملء الغرفة العازلة العلوي من الحد الأدنىط خلية وحدة الكهربائي.
3. حالما يتم الانتهاء من عينات التدفئة، وعينات تدور بسرعة قبل وضعها على الجليد.
4. لتجميع مسبقة الصنع المواد الهلامية مكرر تريس في وحدة مصغرة الخليوي لالكهربائي اتباع تعليمات الشركة المصنعة. ملاحظة: التأكد من أنها موجهة لكل هلام في مثل هذه الأزياء التي أقصر (أصغر) الكاسيت كل هلام يواجه الداخل نحو العازلة الأساسية والمواد الهلامية هي مستوى والضغط بإحكام ضد العازلة الأساسية لتجنب تسرب من غرفة المخزن العلوي.
5. ملء الغرفة العازلة العلوي مع 200 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل العازلة التي تحتوي على مضادات الأكسدة والغرفة السفلى العازلة وحدة مصغرة الخليوي مع حوالي 600 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت. يمكن حفظ اضافية 200-300 مل من العازلة على التوالي لاستخدامها لاحقا. ومع ذلك، فمن غير المستحسن لإعادة تدوير العازلة المستخدمة أثناء التشغيل الكهربائي مثل الرقم الهيدروجيني ونوعية المخزن المؤقت يمكن تغييرها.
6. تحميل 20 ميكرولتر من كل عصيدة البروتينلو في كل بئر. إذا باجتزاء الغشاء في مختلف شرائط من أجل تحقيق عن الأجسام المضادة متعددة (أي أكثر من 2)، فمن المستحسن للغاية لتحميل 2-5 ميكرولتر من مستوى البروتين prestained في الآبار الأول والأخير من كل الجل لأن هذا سيكون بمثابة قطع أدلة لفصل أجزاء مختلفة من الغشاء دون التأثير على التصوير من العصابات البروتين.
7. المواد الهلامية في تشغيل 200 V المستمر لمدة 35 دقيقة مع تيار المتوقعة من 110-125 مللي أمبير / هلام في بداية و70-80 مللي أمبير في هلام في نهاية المطاف. الكهربائي اكتمال عندما يهاجر الصبغة تتبع لسلك البلاتين على طول العازلة الأساسية.

3. نقل البروتين باستخدام نظام التنشيف iBlot الجاف

1. تماما فصل المواد الهلامية-مصغرة عن طريق كسر الجانبين المستعبدين من الكاسيت (و يمكن أن تنتج ضوضاء طقطقة). تجاهل أقصر (أصغر) لوحة ونقل بعناية الجل من أطول (مشقوق) لوحة في وعاء مع الماء منزوع الأيونات وإزالة الجزء السميك القدمين من هلام الموجود في الجزء السفلي. ملاحظة: في حالات نادرة، وهلام قد نعلق على لوحة أقصر بدلا من أطول وفترة زمنية محددة لوحة. في هذه الحالة، تجاهل لفترة أطول، لوحة فترة زمنية محددة وإزالة الجزء السميك القدمين من هلام الموجود في الجزء السفلي. ثم، ونقل بعناية الجل من لوحة أقصر في الماء منزوع الأيونات.
2. تجميع القطب الموجب والسالب مداخن نقل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: تقديم كل النيتروسليلوز أو PVDF الأغشية عالية الجودة وكفاءة نقل البروتينات ومتوافقة مع كشف الفلورسنت ^8. ومع ذلك، غشاء PVDF لديها القدرة ملزمة أعلى (240 ميكروغرام / سم ³⁾ من النيتروسليلوز (200 ميكروغرام / سم ^{3) 8.}
3. إزالة بعناية وأي فقاعات الهواء المحبوس أو بين جل وغشاء لأن هذا منع أي تشويه للنطاقات البروتين أثناء عملية النقل. ملاحظة: لا تقليم الغشاء أو TRANSFإيه كومة لتتناسب مع حجم الجل الخاص بك وهذا سوف يسبب الاتصال المباشر بين القطب الموجب والسالب المداخن.
4. بعد تجميع صحيح مداخن نقل على الجهاز النشاف الجاف، حدد البرنامج الجهد المناسب (أي البرنامج 3: 20 V لمدة 7 دقائق) وتبدأ عملية النقل. ملاحظة: البروتينات أكبر من 150 كيلو دالتون تميل تهاجر ببطء أكثر، وربما تتطلب وقتا أطول من نقل 8-10 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، سوف الحضانة مسبقة من هلام في الإيثانول 20٪ لمدة 5-10 دقيقة تساعد أيضا على تحسين كفاءة نقل هذه البروتينات الكبيرة. مرة واحدة في برنامج نقل كاملة، سوف تغلق الجهاز تلقائيا الحالي. فمن الأفضل لإزالة الغشاء فورا والشروع في إجراءات حجب لضمان أفضل كشف عن البروتين وتجنب جفاف الغشاء.

4. الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري

1. كتلة الغشاء (ق) في ما لا يقل عن 0.8 مل / سم ² من أوديسي حجب العازلة (لا تقم بإضافة توين 20) لمدة 1 ساعة أوبين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ويمكن أيضا غشاء (ق) يكون قد تم حظره مع الحليب الجاف الخالي، ولكن هذا قد يسبب الخلفية أعلى وتتداخل مع الكشف عن البروتين.
2. احتضان الغشاء (ق) في الأجسام المضادة الأولية في التركيز المطلوب في أوديسي حظر مؤقت مع 0.1٪ توين 20 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. للكشف عن اللونين، والتي هي تصور اثنين من مستضدات مختلفة على نفس وصمة عار، ويجب أن تستمد اثنين من الأجسام المضادة الأولية من مختلف الأنواع المضيفة، وأضاف في وقت واحد لغشاء (ق). ملاحظة: قبل احتضان الغشاء (ق) في الأجسام المضادة الأولية، وغشاء (ق) يمكن مقطوع الى قطع مختلفة من أجل تحقيق عن الأجسام المضادة متعددة (أي أكثر من 2) على نفس الغشاء.
3. يغسل الغشاء (ق) 3X لمدة 10 دقيقة في TBS بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 مع الهز لطيف.
4. احتضان الغشاء (s) مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى في التخفيف من 1:20،000 للقناة 700 نانومتر و1:6،000-1:10،000 للقناة 800 نانومتر في Odysseذ حظر مؤقت مع 0.1٪ توين 20 لمدة 30-60 دقيقة (تفرخ غشاء (ق) لمدة أطول من 1 ساعة قد تزيد الخلفية). حماية الغشاء (ق) من الضوء. ملاحظة: في حاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية التي يمكن جنيها من الأنواع المضيفة نفس كل واحد من الأجسام المضادة الأولية والمسمى مع fluorophores مختلفة.
5. يغسل الغشاء (ق) 3X لمدة 10 دقيقة في TBS بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 مع الهز لطيف. حماية الغشاء (ق) من الضوء.
6. غشاء (ق) قد تكون جافة أو تخزينها في أي TBS أو برنامج تلفزيوني بدون توين 20 في 4 درجات مئوية حتى الممسوحة ضوئيا والمصورة مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء. سوف إشارة الفلورسنت تبقى مستقرة لعدة أشهر إذا محمية بشكل صحيح من الضوء.

النتائج

اللونين مضان الأشعة تحت الحمراء بالكشف عن العصابات القوية والضعيفة على حد سواء على نفس الغشاء مع زيادة في الحساسية وإشارة إلى نسبة الضوضاء أعلى لإنتاج واضحة الصور لطخة غربية. ومن الأمثلة على النتائج النموذجية التي تم إنشاؤها بواسطة اللونين الكشف طخة غربية تصور في ك?...

Discussion

الخطوات الحاسمة في توليد عالية الجودة، والبقع الغربية الكمي وفقا لهذا البروتوكول هي التالية: 1) قياس تركيزات البروتين؛ 2) إعداد العينات؛ 3) منع الغشاء و؛ 4) ذات جودة وعيار الأجسام المضادة الأولية.

دقة قياس تركيزات البروتين الكلي يم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A