Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll untersucht die neuesten Fortschritte bei der Durchführung von Western-Blot-Analysen. Diese neuen Änderungen setzen eine Bis-Tris-Gel-System mit einer 35 min Elektrophorese Laufzeit, einer 7 min-Dry-Blotting Transfersystem und Infrarot-fluoreszierende Protein Erkennung und Bildgebung, höhere Auflösung, Qualität, Empfindlichkeit und verbesserte Genauigkeit der West Daten erzeugt.

Zusammenfassung

Die Western-Blot-Techniken, die ursprünglich in den späten 1970er Jahren gegründet wurden, sind auch heute noch aktiv genutzt. Diese traditionelle Methode des Western-Blot hat jedoch mehrere Nachteile, die Auflösung geringer Qualität, Störbänder, verminderte Empfindlichkeit und schlechte Integrität Protein enthalten. Jüngste Fortschritte haben sich drastisch verbessert, zahlreiche Aspekte des Standards Western-Blot-Protokoll, um höhere qualitative und quantitative Daten zu erzeugen. Die Bis-Tris-Gel-System, eine Alternative zu den herkömmlichen Laemmli-System, erzeugt bessere Protein Trennung und Auflösung, hält Proteinintegrität und reduziert die Elektrophorese zu 35 min Laufzeit. Darüber hinaus ist die iBlot Dry-Blotting-System, verbessert deutlich die Wirksamkeit und Geschwindigkeit der Proteintransfer auf die Membran in 7 min, was im Gegensatz zu den traditionellen Methoden, die Proteintransfer häufig ineffizient mit langen Übertragungszeiten ist. In Kombination mit diesen hoch innovativen Modifikationen, Protein Detection mit Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung führt zu höherer Qualität, genauer und konsistenter Daten im Vergleich zu den Standard-Western-Blot-Technik der Chemilumineszenz. Diese Technologie kann gleichzeitig erfassen zwei verschiedene Antigene auf derselben Membran unter Verwendung von Zweifarben-Nah-Infrarot-Farbstoffen, die in unterschiedlichen Fluoreszenzkanäle visualisiert werden. Darüber hinaus ermöglicht die präzise Quantifizierung der starken und schwachen Proteinbanden die Linearität und großen Dynamik des Fluoreszenz-Bildgebung. So beschreibt dieses Protokoll die wichtigsten Verbesserungen des klassischen Western-Blot-Verfahren, bei dem diese Fortschritte die Qualität der Daten deutlich zu erhöhen, während die Leistungszeit dieses Experiments stark reduziert.

Einleitung

Die Technik der Western-Blot wurde erstmals zwischen 1977 und 1979, um eine bessere Methode zum Nachweis von Proteinen mit Hilfe von Antikörpern ^3.1 erstellen entwickelt. Dieses Verfahren verwendet elektrophoretischen Transfer von Proteinen an Membranen, die aus SDS-PAGE-Gelen mit Zielproteinen visualisiert mit Sekundärantikörper und durch Autoradiographie, UV-Licht oder einem Peroxidase-Reaktionsprodukt ³ detektiert. Somit sind diese gleichen Grundprinzipien sind noch weitgehend in der heutigen Western-Blot-Protokolle verwendet. Allerdings ist diese klassische Western-Blot-Technik derzeit viele Nachteile, wie langsam Elektrophorese-Laufzeiten, niedrige Auflösung und künstliche Proteinbanden, die Anfälligkeit für Proteinabbau und begrenzte Empfindlichkeit als auch schlechte Datenqualität ^4. Daher beschreibt dieses Protokoll signifikante Fortschritte und Verbesserungen der Standard-Western-Blot-Verfahren, die genauer qualitative und quantitative Daten erzeugt.

"> Der Laemmli-System für die Trennung ein breites Spektrum von Proteinen mittels SDS-PAGE ist die am häufigsten verwendete Gel-System für ^{Western-Blot-5.} Trotz der Beliebtheit des Western-Blot-System, kann diese Methode in der Bandverzerrung, Verlust der Auflösung, und führen Störbänder ^4. Dies kann eine Folge der Desaminierung und Alkylierung von Proteinen aufgrund der hohen pH-Wert (9,5) des Trenngel, Reoxidation des reduzierten Disulfidbindungen aufgrund der unterschiedlichen Redox-Zustand des Gels, und die Spaltung der Aspartyl-Prolyl sein Peptidbindungen durch Erwärmen des Proteins in Laemmli-Puffer (pH 5,2) ^4,6. Die Bis-Tris-Gel-System, das bei einem neutralen pH-Wert (7,0) arbeitet, bietet erhebliche Vorteile gegenüber dem Lamemmli System. Dieses System verbessert die Proteinstabilität, minimiert Proteinmodifikationen, behält Proteine ​​in ihren reduzierten Zuständen verhindert Aspartyl-Prolyl-Spaltung während der Elektrophorese, und noch wichtiger, ist der Elektrophorese-Laufzeit 35 min ^4,6,7. Zusätzlich ter Bis-Tris-Gel-System produziert auch schärfer Bands, höhere Auflösung und Trennung, und erhöhte Empfindlichkeit, was zu zuverlässigeren Daten ^4.

In Verbindung mit der Bis-Tris-Gel-System, verwendet der iBlot Dry-Blotting-System hohe Feldstärke und Ströme, um die Übertragungszeit von Proteinen aus Gelen deutlich reduzieren auf Membranen innerhalb von 7 min ^8. Dieses Übertragungssystem ist auf dem trockenen Blotting-Verfahren, die eine effiziente und zuverlässige Übertragung von Proteinen auf der Basis ⁸ erzeugt. : Für einen detaillierten Vergleich der Wirksamkeit der iBlot Transfersystem zu den herkömmlichen Übertragungssystemen finden Sie in der folgenden Website http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Es verwendet eine Anode und Kathode Stapel, die aus einer Gelmatrix, die die entsprechenden Übertragungspuffer, die als Ionen Reservoirs ⁸ handeln enthält bestehen. Während der Übertragung, hilft die Wasserelektrolyse, die Erzeugung von Sauerstoff aus der Kupferanode, was zu einer konsistenteren Proteintransfer ohne Verzerrung Band ⁸ zu verhindern. Außerdem erhöht diese Übertragungssystem auch die Übertragungsgeschwindigkeit, indem der Abstand zwischen den Elektroden ^8.

Obwohl Chemilumineszenz ist die häufigste und traditionelle Technik zur Detektion von Protein-Western-Blot-Analysen, zwei-Farben-Infrarot-Fluoreszenzdetektion stark die Empfindlichkeit, Qualität und Genauigkeit der Western-Blot-Daten verbessert. Dieses Nachweisverfahren nutzt Infrarot-Laser-Anregung in zwei optimalen Wellenlängen 700 nmund 800 nm, um ein klares Bild Daten mit dem größten Signal-zu-Rausch-Verhältnis und höchste Sensitivität ⁹ generieren. Somit können zwei Zielproteine ​​gleichzeitig auf derselben Membran unter Verwendung der 700 nm und 800 nm Fluoreszenzdetektionskanäle visualisiert werden. Noch wichtiger ist, ermöglicht eine genaue quantitative Analyse von starken und schwachen Proteinbanden ⁹ die Linearität und den dynamischen Bereich der Infrarot-Fluoreszenz. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll enorme Vorteile und Verbesserungen gegenüber dem klassischen Western-Blot-Technik durch Verringern der Elektrophorese und Übertragungszeiten dieses Experiments ohne die Wirksamkeit dieser Verfahren und Verwendung Infrarot-Fluoreszenzproteindetektion größere qualitative und quantitative Western-Blot-Daten zu erzeugen.

Protokoll

1. Zubereitung ganzer Zellysate aus Zellkultur

1. Zeigen Zellkulturschalen auf Eis und kaltes PBS mit 5 mM EDTA (z. B. 5 ml PBS mit 5 mM EDTA/10 cm ² Schild). Entfernen anhaftender Zellen von der Schale mit einem Zellschaber und übertragen die Zellsuspension in einem kalten 15 ml konischen Röhrchen dann.
2. Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit bei 1000 Upm (230 × g) für 5 min bei 4 ° C. Zeigen konische Röhrchen auf Eis und den Überstand vorsichtig absaugen, ohne dass der Pellets.
3. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml PBS mit 5 mM EDTA und übertragen Zellsuspension zu einer kalten 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Schnell Spin Suspension bei 13.000 rpm (13.226 xg) für 10 sec Zellen zu pelletieren. Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet und Ort Röhrchen auf Eis zu stören.
4. Das Pellet in 25-200 &mgr; l (je nach Granulatgröße, dh 3 × 10 ⁶ Zellen hinzuzufügen ~ 150 &mgr; l RIPA-Puffer) inRIPA-Puffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdesoxycholat, 1% NP-40) mit frisch zugesetzten Protease-und Phosphatase-Inhibitoren bei einer Endkonzentration 2x. Kurz vortexen jedes Rohr Suspension und Inkubation für 20-30 min auf Eis. Hinweis: Es gibt mehrere Lyse-Puffer, die verwendet werden können, um Proteine ​​zu extrahieren, die in ihrer Fähigkeit, Proteine ​​und Stärke ihrer denaturierenden Detergens (z. B. SDS, Triton X-100 oder NP-40) zu solubilisieren abweichen. RIPA-Puffer ist zur Herstellung von ganzen Zelllysaten und stören Protein-Protein-Wechselwirkungen.
5. Um eine post-Kernfraktion, Zentrifuge Lysate bei 14.000 rpm (15.339 xg) für 5 min bei 4 ° C zu erstellen Den Überstand in ein neues Röhrchen, ohne die Kern angereicherten Pellets und Ort Röhrchen auf Eis zu stören. Hinweis: Die Kern angereicherte Pellet kann auch aus dem Rohr zu lösen, während das Extrahieren des Überstandes. Um das Sammeln der Kern angereicherten Pellets zu vermeiden, legen Sie die Pipettenspitze direkt into viskosen Kern angereicherten Pellets und ziehen Sie es mit der Pipette, um ihn zu entsorgen.
6. Bestimmen der Proteinkonzentration jeder Probe nach den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung solcher Proteinquantifizierungsassays als BCA-oder Bradford.

2. Probenvorbereitung und Elektrophorese

1. Vorbereitung jeder Probe entsprechend der folgenden Übersicht zusammengestellt. Als Alternative können auch β-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 2,5% verwendet werden. Jedoch sollte das Reduktionsmittel zu jeder Probe bis zu einer Stunde vor dem Laden des Gels zugesetzt werden. Das Gesamtvolumen Konten zum Pipettieren Varianten mit nur 20 ul jeder hergestellten Probe pro belastet auch.

   REAGENS	Reduzierten Probe
   Proteinprobe	X ul
   4x LDS Sample Buffer	6 ul
   500 nM DTT Reducing-Agent	2,4 ul
   VE-Wasser	Bis zu 15,6 ul
   Gesamtvolumen	24 ul

2. Wärme Proben bei 70 ° C für 10 min. Während die Proben erhitzt, bereiten 1.000 ml 1x MES-oder MOPS-Laufpuffer (50 ml 20x MES-oder MOPS Laufpuffer und 950 ml VE-Wasser). MOPS-Laufpuffer löst mittelgroße Proteine ​​zwischen 14-200 kDa, während MES Laufpuffer löst geringeren Molekulargewicht zwischen Proteinen 2-200 kDa mit einem niedrigeren pKa, die die MES-Laufpuffer, um schneller als die MOPS ⁴ laufen zu lassen. Somit sind diese beiden Pufferspeicher haben gegenläufigen Effekten auf die Wanderung der Ionen im Sammelgel, die Unterschiede in der Trennung der Proteinbanden ⁴ führt. Beiseite stellen und kombinieren 200 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer mit 500 ul Antioxidationsmittel, die verwendet werden, um die obere Pufferkammer der Min füllen werdeni-Cell Elektrophorese-Einheit.
3. Sobald die Proben, bevor Sie sie auf Eis fertig Heizung, schnelle Runde Proben.
4. Für die Montage der Fertig Bis-Tris Gele in den Mini-Cell-Einheit für die Elektrophorese folgen den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass jedes Gel wird in der Weise orientiert, dass die kürzeren (kleineren) Kassette jedes Gels Gesichter nach innen auf die Buffer-Core und die Gele sind eben und fest gegen den Buffer-Core gedrückt, um das Auslaufen aus dem oberen Pufferkammer zu vermeiden.
5. Füllen Sie den oberen Pufferkammer mit den 200 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer, der die Antioxidationsmittel und der unteren Pufferkammer der Mini-Cell-Einheit mit ca. 600 ml 1x MES-oder MOPS Laufpuffer. Die zusätzlichen 200 bis 300 ml Laufpuffer kann zur späteren Verwendung gespeichert werden. Es wird jedoch nicht empfohlen, den Puffer während der Elektrophorese Lauf verwendet, wie der pH-Wert und die Qualität des Puffers können geändert werden, zu recyceln.
6. Legen Sie 20 ul jedes Protein sample in jede Vertiefung. Wenn Schnitt die Membran in verschiedenen Streifen, um für mehrere Antikörper (dh mehr als 2) zu untersuchen, ist es dringend empfohlen, 2-5 ul der vorgefärbten Proteinstandard in der ersten und letzten Wells jeder Gel laden, da dies als zu dienen Schneidführungen für die Trennung der verschiedenen Abschnitte der Membran, ohne die Abbildungs ​​der Proteinbanden.
7. Gele laufen bei 200 V konstant 35 min mit einem erwarteten Strom von 110-125 mA / Gel zu Beginn und 70-80 mA pro Gel am Ende. Elektrophorese ist beendet, wenn die Tracking-Farbstoff wandert zu der Platindraht entlang der Buffer-Core.

3. Protein-Transfer mit den iBlot Dry Blotting-System

1. Völlig trennen die Mini-Gele, die durch das Brechen der gebundenen Seiten der Kassette (das kann eine knisterndes Geräusch zu erzeugen). Entsorgen Sie den kürzeren (kleineren) Platte und das Gel sorgfältig übertragen von der längeren (Schlitz)-Platte in einen Behälter mit VE-Wasser undentfernen Sie die dicke tritt Teil des Gels auf der Unterseite. Hinweis: In seltenen Fällen kann das Gel auf die kürzere Platte statt der mehr zu befestigen, geschlitzte Platte. In diesem Fall verwerfen die längere, Schlitzplatte und die dicke tritt Teil des Gels an der Unterseite des Geräts entfernen. Anschließend vorsichtig mit dem Gel übertragen von der kürzeren Platte VE-Wasser.
2. Montieren die Anoden-und Kathodenübertragungsstapel nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: sowohl Nitrocellulose oder PVDF-Membranen bieten qualitativ hochwertige und effiziente Übertragung der Proteine ​​und sind mit Fluoreszenzdetektion ⁸ kompatibel. Jedoch PVDF-Membran hat eine höhere Bindungskapazität (240 &mgr; g / cm ³⁾ als Nitrocellulose ⁸ (200 &mgr; g / cm ^3).
3. Entfernen Sie vorsichtig jegliche Blasen oder Luft zwischen dem Gel und Membran, wie diese gefangen wird jede Verzerrung der Proteinbanden während der Übertragung zu verhindern. Hinweis: nicht die Membran oder die transf trimmener stapeln, um Ihre Gel-Größe passen, da dies direkten Kontakt zwischen Anoden-und Kathoden Stacks führen.
4. Nach der korrekten Montage der Transfer-Stacks auf der Dry-Blotting-Gerät, wählen Sie die entsprechende Spannungsprogramms (dh Programm 3: 20 V für 7 min) und beginnen Sie die Übertragung. Hinweis: Proteine ​​größer als 150 kDa neigen wandern langsamer und kann eine längere Übertragungszeit von 8-10 min erfordern. Darüber hinaus wird vor der Inkubation des Gels in 20% igem Ethanol für 5-10 min auch helfen, die Übertragungseffizienz dieser große Proteine ​​zu verbessern. Sobald das Transferprogramm abgeschlossen ist, wird das Gerät automatisch die aktuelle geschlossen. Es ist am besten, sofort den Membran und gehen Sie mit der Sperrverfahren, um eine bessere Proteindetektion zu gewährleisten und zu verhindern Austrocknen der Membran.

4. Infrarot-Fluorescent Protein-Erkennung

1. Block-Membran (en) in einem Minimum von 0,8 ml / cm ² Odyssey Blocking Buffer (Nicht hinzufügen Tween-20) für 1 h oderüber Nacht bei 4 ° C. Membran (en) kann auch mit fettfreier Trockenmilch blockiert werden, aber dies kann höher Hintergrund verursachen und Proteinnachweis.
2. Inkubieren Membran (en) in primären Antikörper in der gewünschten Konzentration in Odyssey Blockierungspuffer mit 0,1% Tween-20 über Nacht bei 4 ° C. Für Zweifarberkennung, in dem zwei verschiedene Antigene auf der gleichen Blot sichtbar gemacht, müssen die beiden primären Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies abgeleitet und simultan auf die Membran (en) zugegeben werden. Hinweis: Vor der Inkubation der Membran (en) in primäre Antikörper kann die Membran (en) in verschiedenen Stücke geschnitten, um für mehrere Antikörper (mehr als 2) auf der gleichen Membran sondieren.
3. Für 10 min in TBS plus 0,1% Tween-20 unter leichtem Schütteln waschen Membran (en) 3x.
4. Inkubieren Membran (en) mit den fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:20.000 für die 700 nm-Kanal und 1:6,000-1:10,000 für die 800 nm-Kanal in Odyssey Blockierungspuffer mit 0,1% Tween-20 für 30 bis 60 min (Inkubation Membran (e) für mehr als 1 Stunde kann Hintergrund erhöhen). Schützen Membran (en) aus Licht. Anmerkung: Die sekundären Antikörper müssen von der gleichen Wirtsspezies wie jede der primären Antikörpern abgeleitet und mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert werden.
5. Für 10 min in TBS plus 0,1% Tween-20 unter leichtem Schütteln waschen Membran (en) 3x. Schützen Membran (en) aus Licht.
6. Membran (en) kann entweder getrocknet oder in TBS oder PBS gelagert werden, ohne Tween-20 bei 4 ° C bis gescannt und mit einem Infrarot-Abbildungssystem abgebildet wird. Fluoreszenzsignal wird für mehrere Monate stabil bleiben, wenn sie richtig vor Licht geschützt.

Ergebnisse

Zwei-Farben-Infrarot-Fluoreszenz detektiert sowohl starke als auch schwache Banden auf der gleichen Membran mit erhöhter Empfindlichkeit und dem höchsten Signal-zu-Rausch-Verhältnis, klare Western-Blot-Bilder zu erzeugen. Typische Ergebnisse nach zweifarbige Western-Blot Nachweis sowohl im 700 nm und 800 nm Fluoreszenzkanälen sichtbar gemacht wird, wird in Fig. 1 und 2 veranschaulicht. Die oberste Western-Blot in Fig. 1 zeigt die gleichzeitige (Overlay) Nachweis von...

Diskussion

Die kritischen Schritte bei der Erzeugung von qualitativ hochwertigen, quantitative Western-Blots gemäß diesem Protokoll sind folgende: 1) Messung der Proteinkonzentration, 2) Probenvorbereitung, 3) Blockierung der Membran und, 4) Qualität und Kaliber des primären Antikörpers.

Die Genauigkeit der Messung der Gesamtproteinkonzentrationen können einen großen Einfluss auf die Quantifizierung von Proteinbanden, da die außergewöhnliche Empfindlichkeit des Infrarot-Fluoreszenzdetektion wi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A