El más rápido de Occidente en la ciudad: un toque contemporáneo en el análisis clásico de Western Blot

Resumen

Este protocolo explora los últimos avances en la realización de análisis de Western blot. Estas nuevas modificaciones emplean un sistema de gel Bis-Tris con una electroforesis en tiempo de ejecución 35 min, un sistema de transferencia Blot seco 7 min, y detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo y formación de imágenes que genera una resolución más alta, la calidad, la sensibilidad, y la mejora de la precisión de los datos occidentales.

Resumen

Las técnicas de transferencia Western que se establecieron originalmente en la década de 1970 todavía se utilizan activamente en la actualidad. Sin embargo, este método tradicional de la transferencia Western tiene varios inconvenientes que incluyen la resolución de baja calidad, bandas espurias, disminución de la sensibilidad, y la pobre integridad de la proteína. Los avances recientes han mejorado drásticamente numerosos aspectos del protocolo de transferencia Western estándar para obtener datos cualitativos y cuantitativos más elevados. El sistema de gel Bis-Tris, una alternativa al sistema de Laemmli convencional, genera una mejor separación y la resolución de la proteína, mantiene la integridad de la proteína, y reduce la electroforesis a un tiempo de 35 min de ejecución. Por otra parte, el sistema de transferencia seco iBlot, mejora drásticamente la eficacia y la velocidad de la transferencia de la proteína a la membrana en 7 min, lo que es en contraste con los métodos de transferencia de proteínas tradicionales que son a menudo más ineficiente con largos tiempos de transferencia. En combinación con estas modificaciones altamente innovadoras, proteína Detection usando infrarrojos resultados de imagen fluorescente de mayor calidad, más precisa y de datos en comparación con la técnica de Western Blot estándar de quimioluminiscencia. Esta tecnología puede detectar simultáneamente dos antígenos diferentes en la misma membrana mediante la utilización de dos colores tintes de infrarrojo cercano que se visualizan en diferentes canales fluorescentes. Además, la linealidad y rango dinámico amplio de imagen fluorescente permite la cuantificación precisa de las bandas de proteínas tanto fuertes y débiles. Por lo tanto, este protocolo se describen las mejoras clave para el método de transferencia Western clásico, en el que estos avances aumentan significativamente la calidad de los datos al tiempo que reduce enormemente el tiempo el rendimiento de este experimento.

Introducción

La técnica de Western Blot se desarrolló por primera vez entre 1977 y 1979 con el fin de crear un mejor método para la detección de proteínas utilizando anticuerpos ^1-3. Este procedimiento utiliza la transferencia electroforética de las proteínas a las membranas de los geles de SDS-PAGE con proteínas diana visualizados utilizando anticuerpos secundarios y detectadas por autorradiografía, la luz ultravioleta, o un producto de reacción de la peroxidasa ^3. Por lo tanto, estos mismos principios básicos siguen siendo ampliamente utilizados en los protocolos de transferencia de Western de hoy. Sin embargo, esta clásica técnica de Western Blot sí presenta muchos inconvenientes, como los tiempos de ejecución lentos electroforesis, baja resolución y bandas de proteínas artificiales, la susceptibilidad a la degradación de las proteínas, y una sensibilidad limitada, así como la mala calidad de los datos ^4. Por lo tanto, este protocolo se describen los avances y mejoras significativas para el procedimiento de transferencia Western estándar que genera los datos cualitativos y cuantitativos más precisos.

"> El sistema de Laemmli para la separación de una amplia gama de proteínas utilizando SDS-PAGE es el sistema de gel más utilizado para el Western Blot ^5. A pesar de la popularidad de este sistema de Western Blot, este método puede dar lugar a una distorsión de la banda, la pérdida de resolución, y bandas espurias ^4. Esto puede ser una consecuencia de la desaminación y de alquilación de las proteínas debido a la alto pH (9,5) de la separación de gel, la reoxidación de la reducción de enlaces disulfuro debido a la variación de estado redox del gel, y la escisión de aspartil-prolil bonos debido al calentamiento de la proteína en tampón de Laemmli (pH 5,2) ^4,6 peptídicos. El sistema de gel Bis-Tris, que opera a un pH neutro (7.0), proporciona beneficios significativos sobre el sistema Lamemmli. Este sistema mejora la estabilidad de la proteína, minimiza modificaciones de la proteína, mantiene las proteínas en sus estados reducidos, impide la división aspartil-prolil durante la electroforesis, y lo más importante, el tiempo de electroforesis ejecutar es 35 min ^4,6,7. Además, Tsistema de gel Bis-Tris él también produce bandas más nítidas, mayor resolución y separación, y aumento de la sensibilidad que resulta en datos más fiables ^4.

En conjunto con el sistema de gel Bis-Tris, el sistema de transferencia seco iBlot utiliza alta intensidad de campo y corrientes para reducir significativamente el tiempo de transferencia de las proteínas a partir de geles a membranas dentro de 7 min ^8. Este sistema de transferencia se basa en el método de transferencia en seco que genera una transferencia más eficiente y fiable de las proteínas de ^8. Para una comparación detallada de la eficacia del sistema de transferencia iBlot a los sistemas convencionales de transferencia, consulte la siguiente página web: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Se utiliza una pila ánodo y el cátodo, que se compone de una matriz de gel que contiene los tampones de transferencia adecuados, que actúan como reservorios de iones ^8. Durante la transferencia, la electrólisis del agua ayuda a prevenir la generación de oxígeno del ánodo de cobre que resulta en una transferencia de proteínas más consistente sin causar la distorsión de la banda ^8. Por otra parte, este sistema de transferencia también aumenta la velocidad de transferencia reduciendo la distancia entre los electrodos ^8.

Aunque quimioluminiscencia es la técnica más común y tradicional para la detección de proteínas de análisis de Western blot, la detección fluorescente en el infrarrojo de dos colores mejora en gran medida la sensibilidad, la calidad y precisión de los datos de transferencia de Western. Este método de detección utiliza excitación de láser infrarrojo en dos longitudes de onda óptimas, 700 nmy 800 nm, para generar una imagen clara de datos con la mayor relación señal-ruido y alta sensibilidad ^9. Por lo tanto, dos proteínas diana pueden ser visualizados simultáneamente en la misma membrana utilizando el 700 nm y 800 canales de detección fluorescentes nm. Más importante aún, la linealidad y rango dinámico de fluorescencia infrarroja permite el análisis cuantitativo preciso de bandas tanto fuertes y débiles de proteínas ^9. Además, este protocolo ofrece enormes ventajas y mejoras sobre la clásica técnica de Western Blot por la disminución de la electroforesis y los tiempos de transferencia de este experimento sin comprometer la eficacia de estos procesos y la utilización de detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo para producir mayores Western blot datos cualitativos y cuantitativos.

Protocolo

1. Preparación de lisados ​​de células enteras de cultivo celular

1. Coloque placas de cultivo de células en hielo y añadir PBS frío con EDTA 5 mM (por ejemplo, 5 ml de PBS con 5 mM EDTA/10 cm ² placas). Retire las células adherentes de la placa utilizando un raspador de células y luego transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml de frío.
2. Sedimenten las suspensiones de células por centrifugación a baja velocidad a 1.000 rpm (230 xg) durante 5 min a 4 ° C. Colocar tubos cónicos en hielo y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
3. Lavar el pellet con 1 ml de PBS con EDTA 5 mM y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 1,5 ml en frío. Suspensión de giro rápido a 13.000 rpm (13.226 xg) durante 10 segundos para sedimentar las células. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar los tubos de pellets y colocar en hielo.
4. Resuspender el precipitado en 25-200 l (dependiendo del tamaño de los gránulos, es decir, para 3 x 10 ⁶ células ~ añadir 150 l de tampón RIPA) enTampón RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 10 mM NaF, 0,1% de SDS, desoxicolato de sodio 0,5%, 1% de NP-40) que contiene la proteasa recién añadido y inhibidores de la fosfatasa a una concentración final de 2x. En resumen vórtice cada tubo y se incuba la suspensión durante 20-30 min en hielo. Nota: hay varios tampones de lisis que se pueden usar para extraer las proteínas, que difieren en su capacidad para solubilizar proteínas y fuerza de su detergente de desnaturalización (es decir, SDS, Triton X-100, o NP-40). Tampón RIPA es útil para la preparación de lisados ​​de células enteras y perturbar las interacciones proteína-proteína.
5. Para crear una fracción post-nuclear, lisados ​​de centrifugación a 14.000 rpm (15.339 xg) durante 5 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo sin interrumpir los tubos de pellets y lugar nucleares enriquecido en hielo. Nota: el pellet nuclear enriquecido también puede desprenderse del tubo mientras se extrae el sobrenadante. Para evitar recoger el sedimento nuclear enriquecido, coloque la punta de la pipeta directamente into el sedimento nuclear enriquecido viscosa y dibujarlo con la pipeta con el fin de disponer de él.
6. Determinar las concentraciones de proteína de cada muestra de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando tales ensayos de cuantificación de proteína como de BCA o de Bradford.

2. Preparación de la muestra y electroforesis

1. Prepare cada muestra de acuerdo con el siguiente cuadro se detalla a continuación. Como alternativa, β-mercaptoetanol también se puede utilizar a una concentración final de 2,5%. Sin embargo, el agente reductor debe añadirse a cada muestra hasta una hora antes de cargar el gel. Las cuentas de volumen total de las variaciones de pipeteo con sólo 20 l de cada muestra preparada cargados por pocillo.

   REACTIVO	MUESTRA REDUCIDA
   Proteína de la muestra	X l
   Sample Buffer 4x LDS	6 l
   500 nM de DTT RojoAgente ucing	2.4 l
   Agua desionizada	Hasta 15,6 l
   Volumen Total	24 l

2. Muestras de calor a 70 ° C durante 10 min. Mientras que las muestras se están calentando, prepare 1000 ml de MES 1x o MOPS funcionamiento de amortiguación (50 ml 20x MES o MOPS funcionamiento de amortiguación, más 950 ml de agua desionizada). MOPS funcionamiento de amortiguación resuelve proteínas de tamaño entre 14-200 kDa, mientras MES Running Buffer resuelve las proteínas de peso molecular más pequeños entre 2-200 kDa con un pKa menor, lo que permite a los MES Running Buffer para correr más rápido que los MOPS ^4. Por lo tanto, estas dos memorias intermedias han de contraste efectos sobre la migración de iones dentro del gel de apilamiento que conduce a diferencias en la separación de las bandas de proteínas ^4. Ponga a un lado y se combinan 200 ml de MES 1x o MOPS funcionamiento de amortiguación con 500 l de antioxidantes, los cuales serán utilizados para llenar la Sala Constitucional del Alto Min Bufferunidad de electroforesis i-Cell.
3. Una vez que las muestras se acaban de calefacción, muestras vuelta rápida antes de colocarlos en hielo.
4. Para el montaje de los prefabricados de hormigón Bis-Tris geles en la unidad Mini-Cell para electroforesis siga las instrucciones del fabricante. Nota: asegúrese de que cada gel está orientado de tal manera que el casete más corto (más pequeño) de cada gel se enfrenta hacia el interior del Buffer Core y los geles son de nivel y firmemente presionado contra el Buffer Core para evitar fugas de la Cámara de búfer superior.
5. Llene la cámara de amortiguación superior con los 200 ml de MES o MOPS Running Buffer que contiene el antioxidante y la Cámara de búfer inferior de la unidad Mini-Cell con unos 600 ml de MES o MOPS Running Buffer 1x 1x. El extra de 200 a 300 ml de tampón se pueden guardar para su uso posterior. Sin embargo, no se recomienda para reciclar el tampón utilizado durante la ejecución de la electroforesis como el pH y la calidad de la memoria intermedia pueden ser alterados.
6. Cargue 20 l de cada samp proteínaLe en cada pocillo. Si el corte de la membrana en varias tiras con el fin de sondear para múltiples anticuerpos (es decir, más de 2), es muy recomendable para cargar 2-5 l de la proteína estándar prestained en los primeros y últimos pocillos de cada gel ya que esto servirá como guías de corte para la separación de las diferentes secciones de la membrana sin afectar a la formación de imágenes de las bandas de proteínas.
7. Geles de funcionar a 200 V constante durante 35 minutos con una corriente esperado de 110-125 mA / gel en la salida y 70-80 mA por gel al final. La electroforesis es completa cuando el colorante migra hacia el seguimiento de alambre de platino a lo largo del tampón Core.

3. Transfer Protein Usando el Sistema Blotting iBlot seco

1. Completamente separar los mini-geles rompiendo las partes unidas de la casete (esto puede producir un ruido crepitante). Deseche la placa más corta (más pequeño) y transfiera con cuidado el gel de la (ranurado) ya la placa en un recipiente con agua desionizada yeliminar la porción de espesor de pierna del gel situado en la parte inferior. Nota: en casos poco frecuentes, el gel puede conectar a la placa más corta en lugar de la más larga, la placa ranurada. En este caso, desechar la, placa ya ranurada y quitar la parte gruesa pierna del gel localizado en la parte inferior. Entonces, transferir cuidadosamente el gel de la placa más corta a agua desionizada.
2. Montar las pilas de transferencia de ánodo y cátodo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: las membranas tanto de nitrocelulosa o PVDF proporcionan alta calidad y eficiente transferencia de las proteínas y son compatibles con la detección fluorescente ^8. Sin embargo, la membrana de PVDF tiene una capacidad de unión más alta (240 g / cm ³⁾ de nitrocelulosa (200 g / cm ^{3) 8.}
3. Quite cuidadosamente cualquier burbuja o el aire atrapado entre el gel y la membrana, ya que esto evitará que cualquier distorsión de las bandas de proteínas durante la transferencia. Nota: no se recorte la membrana o la transfer apilar para adaptarse a su tamaño de gel, ya que esto hará que el contacto directo entre las pilas de ánodo y cátodo.
4. Después de ensamblar correctamente las pilas de transferencia en el dispositivo secante seco, seleccione el programa voltaje apropiado (es decir, el Programa 3: 20 V durante 7 min) y comenzar la transferencia. Nota: Las proteínas de más de 150 kDa suelen migrar más lentamente y pueden requerir un tiempo de transferencia más larga de 8-10 min. Además, la incubación previa del gel en etanol al 20% durante 5-10 min también ayudará a mejorar la eficiencia de la transferencia de estas grandes proteínas. Una vez que el programa de transferencia se haya completado, el dispositivo se apagará automáticamente la corriente. Lo mejor es retirar inmediatamente la membrana y continuar con el procedimiento de bloqueo para asegurar una mejor detección de la proteína y evitar la desecación de la membrana.

4. Detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo

1. Bloquear la membrana (s) en un mínimo de 0,8 ml / cm ² de Odyssey tampón de bloqueo (no añadir Tween-20) durante 1 hora ola noche a 4 ° C. Membrana (s) también puede ser bloqueada con leche en polvo sin grasa, sin embargo esto puede causar mayor fondo e interferir con la detección de la proteína.
2. Incubar la membrana (s) en el anticuerpo primario a la concentración deseada en la Odisea tampón de bloqueo con 0,1% de Tween-20 durante la noche a 4 ° C. Para la detección de dos colores, en el que dos antígenos diferentes se visualizan en la misma transferencia, los dos anticuerpos primarios deben ser derivados de diferentes especies huésped y se añaden simultáneamente a la membrana (s). Nota: antes de la incubación de la membrana (s) en el anticuerpo primario, la membrana (s) puede ser seccionado en varias piezas con el fin de sondear para múltiples anticuerpos (es decir, más de 2) en la misma membrana.
3. Lavar la membrana (s) de 3x durante 10 min en TBS más 0,1% de Tween-20 con agitación suave.
4. Incubar la membrana (s) con los anticuerpos secundarios fluorescentemente marcado a una dilución de 1:20.000 para el canal de 700 nm y 1:6,000-1:10,000 para el canal de 800 nm en Odyssey tampón de bloqueo con 0,1% de Tween-20 durante 30-60 minutos (incubando la membrana (s) durante más de 1 hora puede aumentar el fondo). Protege la membrana (s) de la luz. Nota: los anticuerpos secundarios necesitan ser derivado de la misma especie hospedadora como cada uno de los anticuerpos primarios y etiquetados con diferentes fluoróforos.
5. Lavar la membrana (s) de 3x durante 10 min en TBS más 0,1% de Tween-20 con agitación suave. Protege la membrana (s) de la luz.
6. Membrana (s) puede secarse o almacenarse en cualquiera de TBS o PBS sin Tween-20 a 4 º C hasta su escaneado y la imagen con un sistema de imagen de infrarrojos. Señal de fluorescencia se mantendrá estable durante varios meses si se protege adecuadamente de la luz.

Resultados

Dos colores de fluorescencia infrarroja detecta bandas tanto fuertes y débiles en la misma membrana con aumento de la sensibilidad y la relación más alta de señal a ruido para producir imágenes de Western blot claras. Los resultados típicos generados por dos colores de detección de transferencia de Western visualizado tanto en el 700 nm y 800 nm canales fluorescentes se ejemplifican en las Figuras 1 y 2. El Western blot más superior en la Figura 1 muestra el con...

Discusión

Los pasos críticos en la generación de alta calidad, transferencias de Western cuantitativos en función de este protocolo son las siguientes: 1) la medición de las concentraciones de proteínas, 2) la preparación de la muestra, y 3) el bloqueo de la membrana y, 4) la calidad y el calibre de la primaria de anticuerpos.

La precisión de la medición de las concentraciones de proteína total puede tener un impacto importante en la cuantificación de las bandas de proteínas ya que la excep...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A