O mais rápido na Cidade Ocidental: um toque contemporâneo na Análise clássico Western Blot

Resumo

Este protocolo explora os mais recentes avanços na realização de análises de Western blot. Estas novas modificações empregar um sistema de gel de Bis-Tris com uma electroforese em tempo de execução de 35 minutos, uma seco do sistema de transferência de mancha de 7 min, e a detecção da proteína fluorescente no infravermelho e de imagem que gera uma maior resolução, qualidade, sensibilidade, e precisão melhorada de dados ocidentais.

Resumo

As técnicas de Western blot que foram originalmente estabelecidas no final de 1970 ainda estão ativamente utilizado hoje. No entanto, este método tradicional de transferência Western tem vários inconvenientes que incluem a resolução de baixa qualidade, bandas espúrias, diminuição da sensibilidade, e a integridade da proteína pobre. Os avanços recentes têm melhorado drasticamente inúmeros aspectos do protocolo padrão de Western blot para a produção de dados qualitativos e quantitativos mais elevados. O sistema de gel de Bis-Tris, uma alternativa ao sistema convencional de Laemmli, gera uma melhor separação e resolução de proteínas, mantém a integridade da proteína, e diminui a electroforese para um tempo de corrida de 35 min. Além disso, o sistema de mancha seca iBlot, melhora drasticamente a eficácia e velocidade de transferência da proteína para a membrana em 7 min, o que está em contraste com os métodos de transferência de proteína tradicionais que são muitas vezes mais ineficaz com tempos de transferência longas. Em combinação com estas modificações altamente inovadores, proteínas detection usando resultados de imagem fluorescente infravermelhos em maior qualidade, mais precisos e dados consistentes em comparação com a técnica de Western blot padrão de quimiluminescência. Esta tecnologia pode detectar simultaneamente dois antigénios diferentes sobre a mesma membrana, pela utilização de duas cores de corantes de infravermelho próximo, que são visualizadas em diferentes canais fluorescentes. Além disso, a linearidade e ampla gama dinâmica de imagiologia fluorescente permite a quantificação precisa de bandas de proteínas, tanto fortes e fracos. Assim, este protocolo descreve as principais melhorias para o método de Western blot clássico, em que esses avanços aumentar significativamente a qualidade dos dados, reduzindo consideravelmente o tempo do experimento de desempenho.

Introdução

A técnica de Western blot foi desenvolvido pela primeira vez entre 1977 e 1979, a fim de criar um método melhorado para a detecção de proteínas utilizando anticorpos ^1-3. Este procedimento utilizado transferência electroforética de proteínas para membranas de géis de SDS-PAGE com proteínas alvo visualizadas utilizando anticorpos secundários e detectados por auto-radiografia, a luz UV, ou um produto de reacção de peroxidase ^3. Assim, estes mesmos princípios básicos são ainda largamente utilizados em protocolos actuais de Western blot. No entanto, essa técnica clássica de Western Blot não apresenta muitas desvantagens, tais como tempos lentos eletroforese funcionamento, baixa resolução e bandas de proteínas artificiais, suscetibilidade à degradação de proteínas e sensibilidade limitada, bem como má qualidade dos dados ^4. Portanto, este protocolo descreve avanços significativos e melhorias para o procedimento de Western blot padrão que gera dados qualitativos e quantitativos mais precisos.

"> O sistema de Laemmli para separar uma grande variedade de proteínas, utilizando SDS-PAGE, é o sistema de gel mais amplamente utilizado para a transferência de Western ^5. Apesar da popularidade do presente sistema de transferência de Western, este método pode resultar na distorção da banda, a perda de resolução, e bandas espúrias ^4. Isto pode ser uma consequência de a desaminação e a alquilação das proteínas, devido ao elevado pH (9,5) do gel de separação, a reoxidação de redução de ligações dissulfureto, devido à variação do estado redox do gel, e a clivagem de aspartil-prolil ligações peptídicas, devido ao aquecimento da proteína em tampão Laemmli (pH 5,2) ^4,6. O sistema de gel de Bis-Tris, que opera a um pH neutro (7,0), proporciona benefícios significativos sobre o sistema Lamemmli. Este sistema melhora a estabilidade da proteína, minimiza modificações de proteínas, proteínas mantém no seu estado reduzido, impede aspartil-prolil clivagem durante a electroforese, e mais importante, o tempo de electroforese é executado 35 min ^4,6,7. Além disso, tsistema de gel ele Bis-Tris também produz bandas nítidas e de alta resolução e separação, e aumento da sensibilidade, resultando em dados mais confiáveis ^​​4.

Em conjunção com o sistema de gel de Bis-Tris, o sistema de mancha seca iBlot usa força de alto campo e correntes para reduzir significativamente o tempo de transferência de proteínas dos geles para membranas de dentro ⁸ 7 min. Este sistema de transferência é baseado no método de mancha seco que gera uma transferência mais eficiente e fiável de proteínas ^8. Para uma comparação detalhada da eficácia do sistema de transferência de iBlot aos sistemas convencionais de transferência, consulte o seguinte site: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Ele utiliza uma pilha ânodo e cátodo, que são compostas de uma matriz de gel que contém os buffers de transferência adequados, que funcionam como reservatórios de iões ^8. Durante a transferência, a eletrólise da água ajuda a evitar a geração de oxigênio a partir do ânodo de cobre, resultando em uma transferência de proteína mais consistente, sem causar distorção banda ^8. Além disso, este sistema de transferência também aumenta a velocidade de transferência através da redução da distância entre os eléctrodos ^8.

Apesar de quimiluminescência é a técnica mais comum e tradicional para a detecção de proteínas de análises de Western blot, duas cores detecção fluorescente no infravermelho melhora a sensibilidade, qualidade e precisão dos dados de Western blot. Este método de detecção utiliza excitação laser infravermelho em dois comprimentos de onda ideal, 700 nme 800 nm, para gerar uma imagem clara de dados com a maior relação sinal-para-ruído mais elevada sensibilidade e ^9. Assim, duas das proteínas alvo podem ser visualizadas simultaneamente na mesma membrana utilizando a 700 nm e 800 nm canais de detecção de fluorescência. Mais importante ainda, a linearidade e gama dinâmica de fluorescência no infravermelho permite a análise quantitativa precisa de bandas de proteínas, tanto fortes e fracos ^9. Além disso, este protocolo proporciona enormes vantagens e melhorias sobre a técnica de Western blot clássico, diminuindo a eletroforese e tempos de transferência desta experiência, sem comprometer a eficácia desses processos e utilizando a detecção da proteína fluorescente no infravermelho para produzir maiores dados Western blot qualitativos e quantitativos.

Protocolo

1. Preparação de lisados ​​de células inteiras a partir de Cultura de Células

1. Colocar placas de cultura de células em gelo e adiciona-PBS frio, com 5 mM de EDTA (por exemplo, 5 ml de PBS com 5 EDTA/10 mM cm ² placas). Remover células aderentes do prato usando um raspador de células e, em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml frio.
2. Agregar as suspensões de células por centrifugação a baixa velocidade a 1000 rpm (230 xg) durante 5 min a 4 ° C. Colocar os tubos cónicos em gelo e o sobrenadante cuidadosamente aspirado sem perturbar o sedimento.
3. Lava-se a pelete com 1 ml de PBS com EDTA 5 mM e transferir a suspensão de células a uma solução fria de 1,5 ml tubo de centrifugação. Suspensão rotação rápida a 13.000 rpm (13.226 xg) por 10 segundos para sedimentar as células. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento e colocar os tubos no gelo.
4. Ressuspender o sedimento em 25-200 ul (dependendo do tamanho da pastilha, ou seja, para 3 x 10 ~ ⁶ células adicionar 150 ul de tampão de RIPA) nasTampão RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, NaF 10 mM, SDS a 0,1%, desoxicolato de sódio a 0,5%, 1% de NP-40) contendo a protease adicionada de fresco e inibidores da fosfatase a uma concentração final 2x. Resumidamente vortex cada tubo e incubar a suspensão durante 20-30 minutos em gelo. Nota: existem vários tampões de lise que podem ser utilizados para extrair proteínas, que diferem na sua capacidade para solubilizar as proteínas e força do seu detergente desnaturante (SDS ou seja, Triton X-100, ou NP-40). Tampão RIPA é útil para a preparação de lisados ​​de células inteiras e perturbar interacções proteína-proteína.
5. Para criar uma fracção pós-nuclear, lisados ​​de centrífuga a 14.000 rpm (15.339 xg) por 5 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, sem perturbar o sedimento e colocar tubos enriquecido-nucleares em gelo. Nota: o pellet nuclear enriquecido também pode separar o tubo ao extrair o sobrenadante. Para evitar a cobrança do pellet-enriquecido nuclear, coloque a ponta da pipeta directamente into a pelota enriquecido nuclear viscoso e desenhar-se com a pipeta, a fim de eliminá-lo.
6. Determinar as concentrações de proteína de cada amostra de acordo com as instruções do fabricante, utilizando tais ensaios de quantificação de proteína de BCA ou Bradford.

2. Preparação de amostras e Eletroforese

1. Prepare cada amostra de acordo com o gráfico a seguir descritos abaixo. Como uma alternativa, β-mercaptoetanol também pode ser utilizado a uma concentração final de 2,5%. No entanto, o agente redutor deve ser adicionado a cada amostra até uma hora antes de carregar no gel. O total de contas de volume para variações de pipetagem com apenas 20 mL de cada amostra preparada carregado por poço.

   REAGENTES	Amostra reduzida
   Amostra Proteína	X mL
   4x LDS Sample Buffer	6 mL
   500 nM TDT Reducing Agent	2,4 mL
   Água Desionizada	Até 15,6 mL
   Volume Total	24 mL

2. Amostras de calor a 70 ° C durante 10 min. Enquanto as amostras são o aquecimento, preparar 1.000 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida (50 ml 20x MES ou MOPS tampão de corrida, mais 950 ml de água deionizada). MOPS tampão de corrida resolve proteínas de médio porte entre 14-200 kDa, enquanto MES tampão de corrida resolve proteínas de peso molecular menores entre 2-200 kDa com um pKa inferior, que permite que os MES tampão de corrida para correr mais rápido do que os MOPS ^4. Assim, estes dois buffers tenham efeitos contrastantes na migração de iões no interior do gel de empilhamento, que dá origem a diferenças na separação das bandas de proteína ^{de 4.} Ponha de lado e combinar 200 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida com 500 mL de antioxidante, que serão utilizados para preencher o buffer Câmara do Min Superiorunidade de eletroforese i-Cell.
3. Uma vez que as amostras são terminou de aquecimento, as amostras rápidas de rotação antes de colocá-los em gelo.
4. Para a montagem dos pré-moldados géis Bis-Tris para a unidade Mini-Cell para eletroforese de seguir as instruções do fabricante. Nota: certifique-se cada gel é orientado de tal forma que a cassete mais curto (menor) de cada gel é voltado para dentro em direção ao buffer Core e os géis são de nível e firmemente pressionado contra o buffer do núcleo para evitar vazamento do buffer Câmara Alta.
5. Preencher o buffer Câmara Alta com os 200 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida contendo o antioxidante eo buffer Câmara da unidade Mini-Cell, com cerca de 600 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida mais baixo. Os extras 200-300 ml de tampão de corrida pode ser guardado para uso posterior. No entanto, não é recomendado para reciclar o tampão utilizado durante a electroforese de execução como o pH e a qualidade do tampão pode ser alterada.
6. Carregar 20 ul de cada proteína SAMPle em cada poço. Se a secção da membrana em várias tiras, a fim de investigar a vários anticorpos (isto é, mais do que 2), é altamente recomendável para carregar 2-5 ul do padrão de proteínas pré-corados nos primeiros e últimos poços de cada gel como este servirá guias de corte para separar os diferentes setores da membrana, sem afetar a imagem das bandas de proteínas.
7. Géis executado em 200 V constante por 35 min com uma corrente esperada de 110-125 mA / gel no início e 70-80 mA por gel no final. A electroforese é completa quando o corante de rastreio migra para o fio de platina ao longo do tampão de núcleo.

3. Transferência de proteína Usando o Sistema Blotting iBlot seco

1. Completamente separar os mini-géis por quebrar as laterais colados da cassete (pode produzir um ruído de crepitação). Descartar o prato mais curto (menor) e transferir cuidadosamente o gel a partir do (encaixados) placa mais dentro de um recipiente com água desionizada eremover a porção de espessura de pés do gel localizado na parte inferior. Nota: em casos raros, o gel pode juntar ao prato mais curto em vez do mais, encaixados prato. Neste caso, o descarte, a placa com ranhuras mais e remover a porção de espessura de pés do gel localizado na parte inferior. Em seguida, transferir cuidadosamente o gel a partir da placa mais curta à água desionizada.
2. Montar as pilhas de transferência do ânodo e do cátodo de acordo com as instruções do fabricante. Nota: as membranas de nitrocelulose ou PVDF, tanto fornecer alta qualidade e eficiência de transferência das proteínas e são compatíveis com a detecção fluorescente ^8. No entanto, a membrana de PVDF tem uma capacidade de ligação mais elevada (240 mg / cm ³⁾ de nitrocelulose (200 ug / cm ^{3) 8.}
3. Cuidadosamente remover quaisquer bolhas ou ar preso entre o gel ea membrana, pois isso vai evitar qualquer distorção das bandas de proteínas durante a transferência. Nota: não cortar a membrana ou a transfer empilhar para ajustar seu tamanho gel, pois isso fará com que o contato direto entre o anodo eo catodo stacks.
4. Depois de montar corretamente as pilhas de transferência do dispositivo mancha seca, selecione o programa de tensão adequada (ou seja, Programa 3: 20 V para 7 min) e iniciar a transferência. Nota: proteínas maiores que 150 kDa tendem migrar mais lentamente e pode exigir um tempo de transferência de mais de 8-10 min. Além disso, a incubação prévia do gel em 20% de etanol, durante 5-10 min, também vai ajudar a melhorar a eficiência da transferência destas proteínas grandes. Uma vez que o programa de transferência for concluída, o dispositivo desliga-se automaticamente a corrente. É melhor remover imediatamente a membrana e prosseguir com o procedimento de bloqueio para garantir uma melhor detecção de proteínas e evitar ressecamento da membrana.

4. Infravermelho Detecção de Proteína Fluorescente

1. Bloco de membrana (s) num mínimo de 0,8 ml / cm ² de Odyssey tampão de bloqueio (não adicionar Tween-20) durante 1 hora oudurante a noite a 4 ° C. Membrana (s) podem também ser bloqueados com leite em pó desnatado, no entanto, isto pode provocar maior fundo e interferir com a detecção da proteína.
2. Incubar membrana (s) no anticorpo primário para a concentração desejada em tampão de bloqueio Odyssey com 0,1% de Tween-20 durante a noite a 4 ° C. Para a detecção de duas cores, em que dois antigénios diferentes são visualizadas na mesma mancha, os dois anticorpos primários deve ser derivado de diferentes espécies hospedeiras e adicionou-se simultaneamente para a membrana (s). Nota: antes de incubação da membrana (s) de anticorpo primário, a membrana (s) pode ser seccionado em vários pedaços, de modo a sondar para vários anticorpos (isto é, mais do que 2) na mesma membrana.
3. Lavar membrana (s) 3x durante 10 minutos em TBS com 0,1% de Tween-20 com agitação suave.
4. Incubar membrana (s) com os anticorpos secundários marcados com fluorescência, a uma diluição de 1:20000 para o canal de 700 nm e 1:6,000-1:10,000 para o canal de 800 nm, em Odyssey tampão de bloqueio com 0,1% de Tween-20 durante 30-60 minutos (a incubação da membrana (s) por mais do que 1 hora pode aumentar fundo). Proteger membrana (s) de luz. Nota: os anticorpos secundários devem ser derivada da mesma espécie do hospedeiro uma vez que cada um dos anticorpos primários e marcados com diferentes fluoróforos.
5. Lavar membrana (s) 3x durante 10 minutos em TBS com 0,1% de Tween-20 com agitação suave. Proteger membrana (s) de luz.
6. Membrana (s) pode ser seco ou armazenado em TBS ou PBS sem Tween-20 a 4 ° C até ser digitalizado e fotografada com um sistema de imagem de infravermelhos. Sinal fluorescente permanecerá estável por vários meses se devidamente protegido contra a luz.

Resultados

Duas cores de fluorescência no infravermelho detecta bandas tanto fortes e fracos sobre a mesma membrana, com o aumento da sensibilidade e a maior relação sinal-para-ruído para produzir imagens nítidas de Western blot. Os resultados típicos gerados por duas cores detecção de Western blot visualizado em ambos os 700 nm e 800 nm canais fluorescentes são exemplificados nas Figuras 1 e 2. O Western blot superior na Figura 1 mostra o concomitante (overlay) detecçã...

Discussão

Os passos críticos na geração de alta qualidade, transferências de Western quantitativas de acordo com este protocolo, são os seguintes: 1) a medição das concentrações de proteína e 2) a preparação da amostra, 3) o bloqueio da membrana e 4) qualidade e calibre do anticorpo primário.

A precisão da medição das concentrações de proteína total podem ter um impacto importante na quantificação bandas de proteínas uma vez que a sensibilidade excepcional de detecção fluoresce...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A