最快在西镇：对经典蛋白质印迹分析现代风味

摘要

该协议探索的最新进展进行免疫印迹分析。这些新颖的改进采用的Bis-Tris凝胶系统用35分钟电泳运行时，一个7分钟的干印迹转移系统和红外荧光蛋白的检测和成像，其产生更高的分辨率，质量，灵敏度和西数据的改进的准确度。

摘要

还在积极利用当今最初成立于20世纪70年代末，西方印迹技术。然而，这种传统的Western印迹的方法有几个缺点，其中包括低质量的分辨率，杂散乐队，敏感性下降，而可怜的蛋白质的完整性。最新进展已经大大提高了标准的Western blot检测协议的许多方面产生较高的定性和定量数据。本的Bis-Tris凝胶系统，可以替代传统的Laemmli系统，产生更好的蛋白质分离和分辨率，保持蛋白完整性，并降低电泳至35分钟的运行时间。此外，IBLOT干印迹系统，极大地提高了蛋白质转移到在7分钟，这是在对比的是，往往更低效的冗长的传输时间传统的蛋白转移方法在膜的功效和速度。在这些高度创新的修改，蛋白d组合etection使用红外荧光成像效果更高质量，更准确，相比化学发光标准Western印迹法一致的数据。这种技术可以同时检测在相同的膜上两种不同的抗原通过利用被可视化在不同的荧光通道双色近红外染料。此外，荧光成像的线性度和宽动态范围允许为强，弱蛋白条带的精确定量。因此，该协议描述了重要的改进，以经典的Western印迹方法，其中这些改进显著提高数据的质量，同时大大降低了该实验中的性能时间。

引言

为了使用抗体检测^1-3蛋白质创造一个更好的方法，1977年和1979年间首次开发蛋白质印迹分析技术。此程序利用蛋白质与用第二抗体可视化，并通过放射自显影，UV光或过氧化物酶反应产物³检测目标蛋白电泳转移到膜上从SDS-PAGE凝胶。因此，这些相同的基本原则仍然被广泛使用在今天的Western blot检测协议。然而，这种经典的免疫印迹技术确实存在许多缺点，如缓慢电泳运行时间，低分辨率和人工蛋白条带，易患蛋白质降解，和有限的灵敏度，以及糟糕的数据质量^4。因此，该协议描述了标准的Western blot检测程序，会产生更准确的定性和定量数据显著的进步和改善。

“>本的Laemmli系统，用于分离各种使用SDS-PAGE的蛋白质是蛋白质印迹⁵最广泛使用的凝胶体系。尽管如此Western印迹系统的普及，这种方法可能会导致带内失真，分辨率的损失，并杂散带^4，这可能是由于在分离胶，减少二硫键由于凝胶的不同的氧化还原状态，并且天冬氨酰-脯氨酰裂解再氧化的高pH（9.5）的蛋白质的脱氨基和烷基化反应的结果肽键是由于加热该蛋白质在Laemmli缓冲液（pH为^5.2）4,6的的Bis-Tris凝胶系统，该系统工作在中性pH值（7.0），在Lamemmli系统提供了显著益处，该系统提高了蛋白质的稳定性，最小化蛋白质修饰，蛋白质保持其减少的状态，可以防止在电泳过程天冬氨酰-脯氨酰裂解，并且更重要的是，电泳运行时间是35分钟^，4,6,7，另外，吨他的Bis-Tris凝胶体系也产生更清晰的条带，更高的分辨率和分离，提高了灵敏度产生更可靠的数据^4。

同的Bis-Tris凝胶体系相结合，IBLOT干印迹系统采用高场强和电流从凝胶显著降低蛋白质的传输时间内到7分钟⁸膜。这个传输系统是基于其生成更有效和可靠的蛋白⁸的转印干印迹法。对于IBLOT传输系统的功效，以传统的传输系统的详细比较请参考以下网站： http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html .它利用阳极和阴极的堆叠，这是由一个包含适当的传输缓冲器，即作为离子储层⁸的凝胶基质。在转移过程中，电解水有助于防止氧的产生从铜阳极产生，而不会导致带内失真⁸更一致的蛋白转移。此外，该传输系统还通过减少电极⁸之间的距离增加了传输速度。

虽然化学发光是最常见，最传统的方法进行蛋白质检测印迹分析，双色红外荧光检测大大提高了灵敏度，质量和Western blot检测数据的准确性。这种检测方法有两种最佳波长，700 nm处采用红外激光激发和800纳米，以生成具有最大信号-噪声比和灵敏度最高⁹清晰的图像数据。因此，两个靶蛋白可以同时使用700 nm和800 nm的荧光检测信道的相同的膜显影。更重要的是，红外荧光的线性度和动态范围允许为强，弱蛋白条带⁹的精确定量分析。此外，该协议提供了巨大的优点和改进对经典的Western印迹技术通过降低该实验的电泳和转移时间而不影响这些过程的有效性和使用红外荧光蛋白的检测，以产生更大的定性和定量蛋白质印迹数据。

研究方案

1。从细胞培养全细胞裂解液的制备

1. 将细胞培养皿置于冰上，加入冷PBS与5毫米EDTA（ 如 PBS 5毫升5毫米EDTA/10厘米²板）。从使用细胞刮烹调除去粘附的细胞，然后将细胞悬浮液转移到冷的15毫升锥形管中。
2. 在4℃下沉淀的细胞悬浮液通过低速离心以1000rpm（230×g离心）5分钟放置锥形管在冰上，小心地吸出上清液，而不破坏颗粒。
3. 用1毫升的PBS中含有5mM EDTA洗涤沉淀和细胞悬浮液转移到一个冷1.5毫升离心管中。在13,000 rpm（13,226×g离心）快速自旋悬浮液，持续10秒，以沉淀细胞。小心取出上清液，而不破坏冰的颗粒和地方管。
4. 重悬在25-200微升的粒料（根据颗粒大小， 即对于3×10 ⁶个细胞加〜150微升的RIPA缓冲液）中RIPA缓冲液（50mM的Tris，150mM的氯化钠，0.5mM的EDTA，10mM的氟化钠，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠，1％NP-40），其中包含新加入的蛋白酶和磷酸酶抑制剂在2倍终浓度。短暂涡旋振荡每个试管中孵育悬挂在冰上20-30分钟。注意：有几种裂解缓冲液，可用于提取的蛋白，其以溶解的蛋白质和它们的变性剂（ 如 SDS，曲拉通X-100，或NP-40）的强度的能力上不同。 RIPA缓冲液是用于制备全细胞裂解液和破坏蛋白质 - 蛋白质相互作用是有用的。
5. 要在14,000 rpm（15,339 XG）5分钟，在4°C。创建一个岗位核分数，离心裂解液将上清转移到一个新的管而不破坏冰核富集的颗粒和地方管。注：核富集的颗粒也可能从管分离而提取的上清液。为了避免收集核富集的颗粒，直接将枪头我NTO粘性核富集的颗粒，并绘制了吸管，以便处置。
6. 根据使用这样的蛋白质定量测定作为BCA或布拉德福德制造商的说明确定各样品的蛋白质浓度。

2。样品制备和电泳

1. 按照以下所列出的图表制备每​​个样品。作为替代方案，β-巯基乙醇，也可用于以2.5％的终浓度。然而，还原剂应该被加载在凝胶之前加入到每个样品一小时。总量占移液变化，只有20微升每个制备的样品，每装好。

   试剂	减少的样本
   蛋白质样本	X微升
   4×LDS样品缓冲液	6微升
   500纳米红色的DTTucing代理	2.4微升
   去离子水	高达15.6微升
   总成交量	24微升

2. 热样品，在70℃10分钟。当样品加热，准备千毫升1X MES或MOPS电泳缓冲液（50毫升20倍的MES或MOPS电泳缓冲液加950毫升去离子水）。 MOPS运行缓冲可解决中型蛋白14-200 kDa的之间，而MES电泳缓冲液可解决2-200 kDa的之间的较小分子量的蛋白质具有较低的pKa值，其允许在MES电泳缓冲液至运行速度比MOPS ⁴更快。因此，这两个缓冲区都对比上，导致在蛋白质条带⁴的分离差异浓缩胶中离子的迁移作用。预留并结合200毫升1X的MES或MOPS用500μl抗氧化的电泳缓冲液，将用于填补上缓冲液槽中最小的I-细胞电泳装置。
3. 一旦样品被加热完毕，快速旋转的样本置于冰上将之前。
4. 对于预制Bis-Tris凝胶放入微型电池单元，用于电泳的装配遵循制造商的说明进行操作。注意：确保每个凝胶被以这样的方式取向，每个凝胶的短（小）盒向内朝向缓冲区核心和凝胶是水平和对缓冲区核心紧紧地压，以避免从上缓冲液槽泄漏。
5. 补上缓冲液槽与200毫升的1X的MES或MOPS电泳缓冲液含有抗氧化剂和下缓冲液槽与大约600毫升的1X的MES或MOPS电泳缓冲液的微型电池单元组成。额外的200-300毫升运行缓冲液可以保存供以后使用。然而，这是不推荐来回收电泳运行过程中用作缓冲液的pH和质量可以被改变的缓冲区。
6. 加载20微升每种蛋白质的SAMP勒到每个孔中。如果切片膜成各种条状，以探测多种抗体（ 即超过2），强烈建议加载2-5μl，以每个凝胶的第一个和最后一个孔的预染蛋白质标准，因为这将作为切割导板，用于分离的膜的不同部分，而不会影响该蛋白质条带的成像。
7. 运行凝胶在200V恒定35分钟以110-125毫安/凝胶在开始和每个凝胶70-80毫安在年底预期的电流。电泳完成时，跟踪染料迁移到铂丝沿缓冲区核心。

3。蛋白质转移使用IBLOT干印迹系统

1. 通过破坏盒的侧粘接完全分离的微型凝胶（这可能产生一个噼啪噪声）。弃短（小）板，小心地从较长（开槽）盘转移到凝胶用去离子水容器中，除去位于底部凝胶的厚足部分。注意：在极少数情况下，凝胶可以连接到短板，而不是时间越长，开槽板。在这种情况下，丢弃该时间越长，开槽板和除去位于底部凝胶的厚右脚部。然后，小心地从短板转移凝胶去离子水。
2. 根据制造商的说明装配在阳极和阴极传输栈。注意：这两种硝化纤维素或PVDF膜上的蛋白质提供高质量和高效率的传输，并与荧光检测⁸兼容。然而，聚偏氟乙烯膜确实具有较高的结合容量（240微克/厘米^3）除硝化纤维^8（200微克/厘米^3）。
3. 小心地取出任何气泡或空气凝胶和膜，因为这之间的残留将防止在传输过程中的蛋白条带任何失真。注意：不要修剪膜或被传呃栈以满足您的凝胶大小，因为这将导致阳极和阴极栈之间的直接接触。
4. 在正确组装印迹干燥设备上的传输协议栈，选择适当的电压计划（ 即方案三：20 V为7分钟），并开始传输。注：蛋白质大于150 kDa的趋向迁移速度比较慢，可能需要8-10分钟更长的传输时间。另外，在20％乙醇中5-10分钟的凝胶温育之前也将有助于提高这些大蛋白的转印效率。一旦传输程序完成后，设备会自动切断电流。最好是立即取出膜并继续阻止程序，以确保更好的蛋白质检测，避免晒出膜。

4。红外荧光蛋白检测

1. 块膜中最小的Odyssey封闭缓冲液（不加吐温20），1小时0.8毫升/厘米^2（S）过夜，在4°C。膜（次），也可阻止与脱脂奶粉，然而，这可能会导致较高的背景和干扰蛋白质的检测。
2. 在漫游所需的浓度阻断缓冲液含0.1％Tween-20中过夜，在4℃下在初级抗体孵育膜（次）对于双色检测，其中两个不同的抗原上可视化的相同印迹，两个初级抗体必须来自不同宿主物种和同时加入到所述膜（次）。注意：孵育所述膜（次）初级抗体之前，将膜（s）可以被划分成不同部分，以探测多种抗体（ 即大于2）在相同的膜。
3. 对于在TBS 10分钟加0.1％Tween-20中轻轻摇动洗膜（次）3倍。
4. 孵育膜（次）与荧光标记的二抗的稀释度1:20,000用于在Odysse的800纳米通道中的700nm的信道和1:6,000-1:10,000Ý阻断缓冲液含0.1％Tween-20的30〜60分钟（时间超过1小时温育膜（次）可能会增加背景）。从光保护膜（S）。注意：二次抗体需要从同一宿主物种衍生的，因为每个初级抗体和标记有不同的荧光团。
5. 对于在TBS 10分钟加0.1％Tween-20中轻轻摇动洗膜（次）3倍。从光保护膜（S）。
6. 膜（次）可被干燥或存储在任何TBS或PBS无Tween-20中，在4℃，直至扫描和成像用红外成像系统。荧光信号将保持稳定数月，如果适当的保护从光。

结果

双色红外荧光在相同的膜具有增强的灵敏度和最高的信号噪声比，以产生清晰的印迹图像检测强和弱带。通过双色Western印迹检测显现在两个700 nm和800 nm的荧光通道产生的典型的结果列举在图1和图2。在图1中最上面的Western印迹显示了并行（覆盖）检测总的ERK1 / 2在800纳米通道中的裂解物中的来自人2倍连续稀释的700纳米通道（红色）（绿色）和β-肌动蛋白的衍?...

讨论

在根据本协议产生高质量，定量Western印迹的关键步骤如下：1）测定蛋白质浓度，2）样品的制备; 3）阻挡膜和4）的初级抗体的质量和口径。

测定总蛋白浓度的精度可对定量蛋白质条带，因为红外荧光检测的灵敏度呈将扩增的样品的蛋白浓度发现任何轻微的差异产生了重大影响。为了避免在确定蛋白质浓度，生成的标准曲线与线性回归线或R平方值越接近1越好（R ^2≥0.99

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A