המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

Summary

פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג'ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק ', וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יותר, איכות, רגישות ודיוק משופר של נתונים מערביים.

Abstract

טכניקות הכתם המערביות שהוקמו במקור בסוף 1970s עדיין מנוצלים באופן פעיל היום. עם זאת, יש שיטה מסורתית זו מערבית סופג כמה חסרונות הכוללים ברזולוציה נמוכה איכות, להקות מזויפות, ירידה ברגישות, וביושר חלבון עני. ההתקדמות שחלה באחרונה השתפרה באופן דרסטי היבטים רבים של פרוטוקול הכתם המערבי הסטנדרטי כדי לייצר מידע איכותי וכמות גבוהה יותר. מערכת ג'ל Bis-טריס, אלטרנטיבה למערכת Laemmli הקונבנציונלית, יוצרת הפרדת חלבון טובה יותר ורזולוציה, שומרת על שלמות חלבון, ומפחיתה אלקטרופורזה לזמן ריצת 35 דקות. יתר על כן, המערכת הסופג היבשה iBlot, משפרת באופן דרמטי את היעילות ומהירות של העברת חלבון על הקרום ב -7 דקות, שזה בניגוד לשיטות העברת חלבון המסורתיות, כי הם לעתים קרובות יעילים יותר עם זמני העברה ארוכים. בשילוב עם שינויים מאוד חדשניים אלה, ד החלבוןetection באמצעות תוצאות הדמיה ניאון אינפרא אדום באיכות גבוהה יותר, מדויקים יותר ונתונים עקביים בהשוואה לטכניקה המערבית סופג סטנדרטית של chemiluminescence. טכנולוגיה זו יכולה בו זמנית לזהות שני אנטיגנים שונים על אותו הקרום על ידי ניצול צבעים קרוב אינפרא אדום בשני צבעים שהם דמיינו בערוצי ניאון שונים. יתר על כן, את הליניאריות והטווח דינמי רחב של דימות פלואורסצנטי מאפשר לכימות המדויק של להקות חלבון גם חזקות וגם חלשות. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את שיפורי מפתח לשיטה הקלאסית המערבית סופג, שבו הפיתוחים האלה להגדיל באופן משמעותי את איכות הנתונים, תוך צמצום זמן ביצוע ניסוי זה באופן משמעותי.

Introduction

הטכניקה של מערבי סופג פותחה לראשונה בין 1977 ו -1979 כדי ליצור שיטה טובה יותר לאיתור חלבונים באמצעות נוגדני ^1-3. הליך זה מנוצל העברת electrophoretic של חלבונים לממברנות מג'לי-SDS עם חלבוני היעד דמיינו באמצעות נוגדנים משני וזוהו על ידי autoradiography, אור UV, או מוצר תגובת peroxidase ^3. לכן, אותם עקרונות בסיסיים אלה עדיין בשימוש נרחב בפרוטוקולי הכתם המערביים של היום. עם זאת, הטכניקה המערבית סופג הקלאסית הזה עושה חסרונות רבים בהווה, כגון פעמים איטיות ריצת אלקטרופורזה, ברזולוציה נמוכה ולהקות חלבון מלאכותיות, את רגישות לפירוק חלבונים, ורגישות מוגבלת, כמו גם איכות נתונים ירודה ^4. לכן, פרוטוקול זה מתאר התקדמות ושיפורים משמעותיות להליך הכתם המערבי הסטנדרטי שמייצר נתונים איכותיים וכמותיים מדויקים יותר.

"> מערכת Laemmli להפרדת מגוון רחב של חלבונים באמצעות SDS-PAGE היא מערכת ג'ל הנפוצה ביותר למערבי סופג ^5. למרות הפופולריות של מערכת מערבית סופג את זה, שיטה זו יכולה לגרום לעיוות להקה, אובדן של רזולוציה, ו להקות מזויפות ^4. זה עשויה להיות תוצאה של deamination ואלקילציה של חלבונים בשל pH הגבוה (9.5) של ג'ל המפריד, reoxidation של אגרות חוב מופחתים דיסולפיד בשל מצב חיזור השונים של ג'ל, ומחשוף של aspartyl-prolyl איגרות חוב בשל חימום החלבון במאגר Laemmli (pH 5.2) ^4,6 פפטיד. מערכת ג'ל Bis-טריס, הפועלת ב-pH ניטראלי (7.0), מספקת יתרונות משמעותיים על פני מערכת Lamemmli. מערכת זו משפרת את יציבות חלבון, ממזערת שינויי חלבון, שומר על חלבונים במדינות מופחתות שלהם, מונעים מחשוף aspartyl-prolyl במהלך אלקטרופורזה, ויותר חשוב מכך, בפעם אלקטרופורזה להפעיל היא 35 ^4,6,7 דקות. בנוסף, לאמערכת ג'ל הוא Bis-טריס גם מייצרת להקות חדות יותר, רזולוציה והפרדה גבוהות יותר, ורגישות מוגברת וכתוצאה מכך הנתונים אמינים יותר ^4.

בשיתוף עם מערכת הג'ל Bis-טריס, המערכת הסופג היבשה iBlot משתמשת בעוצמת שדה גבוהה וזרמים כדי להפחית באופן משמעותי את זמן ההעברה של חלבונים מן ג'לים על גבי קרומים תוך 7 דקות ^8. מערכת העברה זו מבוססת על השיטה הסופג היבשה שיוצרת העברה יותר יעילה ואמינה של חלבונים ^8. להשוואה מפורטת של היעילות של מערכת העברת iBlot למערכות העברה הקונבנציונלית עיינו באתר האינטרנט הבא: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . הוא מנצל ערימת האנודה וקתודה, אשר מורכבות ממטריצת ג'ל המכילה מאגרי ההעברה המתאימים, המשמשים כמאגרי יון ^8. במהלך ההעברה, אלקטרוליזה של מים מסייעת במניעת הדור של חמצן מן האנודה הנחושת וכתוצאה מכך העברת חלבון עקבית יותר מבלי לגרום לעיוות להקת ^8. יתר על כן, מערכת העברה זו גם מגדילה את מהירות העברה על ידי צמצום המרחק בין האלקטרודות ^8.

למרות chemiluminescence היא הטכניקה הנפוצה והמסורתית ביותר לגילוי חלבון של כתם המערבי מנתח, גילוי ניאון אינפרא אדום בשני צבעים משפר באופן משמעותי את הרגישות, איכות ודיוק נתוני כתם המערביים. שיטת זיהוי זה משתמשת בעירור לייזר אינפרא אדום בשני אורכי גל אופטימליים, 700 ננומטרו800 ננומטר, כדי ליצור תמונת נתונים ברורה עם היחס הגדול ביותר אות לרעש והרגישות הגבוהה ביותר ^9. לפיכך, ניתן דמיינו שני חלבוני היעד בו זמנית על אותו הקרום באמצעות ננומטר 700 ו800 ערוצי גילוי ניאון ננומטר. וחשוב יותר, את הליניאריות והטווח דינמי של הקרינה אינפרא אדום מאפשר ניתוח כמות מדויק של להקות חלבון גם חזקות וגם חלשות ^9. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק יתרונות ושיפורים עצומים על פני הטכניקה מערבית סופג הקלאסית על ידי הפחתת אלקטרופורזה וזמני העברה של ניסוי זה מבלי להתפשר על היעילות של תהליכים אלה וניצול זיהוי חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום כדי לייצר נתונים כתם גדולים יותר איכותיים וכמותית מערביים.

Protocol

1. הכנת lysates תא השלם מתרבית תאים

1. מניחים מנות תרבית תאים על קרח ולהוסיף PBS הקר עם 5 מ"מ EDTA (לדוגמא 5 מיליליטר של PBS עם 5 מ"מ צלחת EDTA/10 ² סנטימטר). הסרת תאים חסיד מהצלחת באמצעות מגרד תא ולאחר מכן להעביר את ההשעיה תא צינור חרוטי 15 מיליליטר קר.
2. גלולה השעיות התא על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה על 1,000 סל"ד (230 XG) במשך 5 דקות ב 4 ° C. הנח צינורות חרוטי על קרח ולשאוב supernatant בזהירות מבלי להפריע לגלולה.
3. שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של PBS עם 5 מ"מ EDTA ולהעביר את השעיה תא צינור צנטריפוגות קר 1.5 מיליליטר. השעיה מהירה ספין על 13,000 סל"ד (13,226 XG) במשך 10 שניות עד גלולה תאים. מוציא בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה צינורות ומניחים על קרח.
4. Resuspend את הכדור ב25-200 μl (תלוי בגודל גלולה, כלומר עבור 3 x 10 ⁶ תאים להוסיף ~ 150 μl של חיץ ריפה) בחיץ ריפה (50 מ"מ טריס, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 מ"מ NAF, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate נתרן, 1% NP-40) המכיל פרוטאז הוסיף טרי ומעכבי phosphatase בריכוז סופי 2x. בקצרה מערבולת צינור כל דגירה השעיה של 20-30 דקות על קרח. הערה: יש כמה מאגרי תמוגה שיכול לשמש כדי לחלץ חלבונים, אשר נבדלים ביכולתם solubilize חלבונים וחוזק של חומר ניקוי denaturing (כלומר, SDS, טריטון X-100, או NP-40). חיץ ריפה הוא שימושי להכנת lysates תא כולו ושיבוש אינטראקציות בין חלבונים.
5. כדי ליצור שבריר פוסט גרעיני, lysates צנטריפוגות ב 14,000 סל"ד (15,339 XG) במשך 5 דקות ב 4 ° C. מעביר את supernatant לצינור חדש מבלי לשבש את צינורות גלולה ומקום מועשרים הגרעיניות על קרח. הערה: גלולה מועשרת הגרעינית יכולה גם להתנתק מהצינור בזמן חילוץ supernatant. כדי להימנע מאיסוף גלולה מועשר הגרעינית, הנח את קצה פיפטה ישירות in כדי גלולה מועשרת הגרעינית צמיגה ולצייר אותו עם פיפטה כדי להיפטר ממנו.
6. לקבוע את ריכוז החלבון של כל דגימה על פי הוראות היצרן באמצעות מבחני כימות חלבון כגון BCA או ברדפורד.

2. לדוגמא הכנה ואלקטרופורזה

1. הכן את כל דגימה על פי הטבלה הבאה המפורטת להלן. כחלופה, β-mercaptoethanol יכול לשמש גם בריכוז סופי של .2.5%. עם זאת, סוכן צמצום יש להוסיף לכל דגימה של עד שעה לפני טעינת ג'ל. חשבונות הנפח הכולל עבור וריאציות pipetting עם רק 20 μl של כל דגימה שהוכנה עמוסים בכל טוב.

   מגיב	מדגם מופחת
   לדוגמא חלבון	X μl
   חיץ מדגם 4x LDS	6 μl
   500 ננומטר DTT אדוםucing סוכן	2.4 μl
   מים Deionized	עד 15.6 μl
   נפח כולל	24 μl

2. דגימות מחמם על C ° 70 10 דקות. בעוד דגימות חימום, להכין 1,000 מיליליטר של MES או מגבים 1x חיץ ריצה (50 MES מיליליטר 20x או מגבים הפעלת מאגר בתוספת 950 מיליליטר מים deionized). מגבים ריצת חיץ פותר חלבונים בגודל בינוני בין 14-200 kDa, ואילו MES הפעלת מאגר פותר חלבוני משקל מולקולריים קטנים יותר בין 2-200 kDa עם pKa נמוך יותר, המאפשר MES הפעלת מאגר לרוץ מהר יותר מהמגבים ^4. לפיכך, שני מאגרים אלה מנוגדים השפעות על ההגירה של יונים בתוך הג'ל לערום שמוביל להבדלים בהפרדה של להקות חלבון ^4. מניח בצד ולשלב 200 מיליליטר של MES 1x או מגבים הפעלת מאגר עם 500 μl של נוגדי חמצון, אשר ישמש למילוי העליון הצפת לשכת המינימליתיחידת אלקטרופורזה i-Cell.
3. לאחר הדגימות סיימו חימום, דגימות סיבוב מהירות לפני ששם אותם על קרח.
4. להרכבה של ג'לי Bis-טריס טרומי ליחידת המיני הנייד אלקטרופורזה לעקוב אחר ההוראות של היצרן. הערה: ודא שכל ג'ל מכוון בצורה כזאת שהקלטת קצרה יותר (קטנה יותר) של כל ג'ל פונה פנימה לכיוון ליבת הצפת וג'לים הם ברמה ולחץ בחוזקה נגד Core המאגר כדי למנוע דליפה מהמאגר העליונה הקאמרי.
5. מלא עליון הצפת קאמרית עם 200 מיליליטר של MES או מגבים הפעלת מאגר המכיל נוגדי חמצון והתחתון הצפת לשכת יחידת המיני הנייד עם כ 600 מיליליטר של MES או מגבים הפעלת מאגר 1x 1x. 200-300 מיליליטר הנוסף של הפעלת מאגר ניתן לשמור לשימוש מאוחר יותר. עם זאת, היא אינה מומלצת למחזר החיץ בשימוש בזמן ריצת אלקטרופורזה כpH והאיכות של המאגר עלול להיות שונה.
6. טען 20 μl של כל SAMP חלבוןle לכל אחד. אם חתך את הקרום לרצועות שונות על מנת לחקור לנוגדנים מרובים (כלומר יותר מ -2), מומלץ מאוד לטעון 2-5 μl של תקן חלבון prestained בבארות הראשונות והאחרונה של כל ג'ל שזה ישמש חיתוך מדריכים להפרדת החלקים השונים של הקרום מבלי להשפיע על ההדמיה של להקות החלבון.
7. ג'לים לרוץ ב200 V קבוע לדקות 35 עם נוכחית צפוי של 110-125 mA / ג'ל בתחילת ו70-80 mA לג'ל בסוף. אלקטרופורזה תושלם כאשר צבע המעקב נודד לחוט הפלטינה לאורך Core הצפת.

3. העברת חלבונים באמצעות מערכת סופג iBlot יבש

1. נפרד לחלוטין מיני ג'לים על ידי שבירת הצדדים ערובה של הקלטת (עשוי לייצר רעש פצפוצים). מחק את הצלחת קצרה יותר (קטנה יותר) ולהעביר בזהירות את הג'ל מהצלחת ארוכה יותר (מחוררת) לתוך מיכל עם מים deionized ולהסיר את החלק עבה רגל של הג'ל הממוקם בתחתית. הערה: במקרים נדירים, ג'ל עשוי לצרף לצלחת קצרה יותר במקום זמן רב יותר, מחוררת צלחת. במקרה זה, לבטל את הצלחת ארוכה יותר, מחוררת ולהסיר את החלק עבה רגל של הג'ל הממוקם בתחתית. ואז, בזהירות להעביר את הג'ל מהצלחת הקצרה למים deionized.
2. להרכיב את ערימות העברת האנודה וקתודה בהתאם להוראות היצרן. הערה: קרומי שני ניטרוצלולוזה או PVDF לספק העברה באיכות גבוהה ויעילה של חלבונים והם תואמים עם זיהוי ניאון ^8. עם זאת, קרום PVDF אכן יש קיבולת גבוהה יותר מחייבת (240 מיקרוגרם / ³ סנטימטר) מאשר ניטרוצלולוזה (200 מיקרוגרם / סנטימטר ^{3) 8.}
3. מוציא בזהירות את כל בועות אוויר שנלכד בין או ג'ל והקרום זה ימנעו כל עיוות של להקות החלבון במהלך ההעברה. שים לב: לא לקצץ את הקרום או transfאה מחסנית כדי שיתאים לגודל ג'ל שלך כמו זה יגרום למגע ישיר בין ערימות האנודה וקתודה.
4. לאחר הרכבת כראוי ערימות ההעברה במכשיר הסופג היבש, בחר את התכנית המתאימה מתח (כלומר תכנית 3: 20 V עבור 7 דקות) ותתחיל את ההעברה. הערה: חלבונים גדולים מ 150 kDa נוטים להגר יותר לאט ועשויים לדרוש זמן העברה ארוך יותר של 8-10 דקות. בנוסף, דגירה מוקדמת של ג'ל באתנול 20% עבור 5-10 דק גם תעזור לשפר את יעילות ההעברה של חלבונים הגדולים אלה. לאחר תכנית ההעברה הושלמה, המכשיר יכבה באופן אוטומטי הנוכחי. עדיף להסיר באופן מיידי את הקרום ולהמשיך בהליך החסימה כדי להבטיח זיהוי חלבון טוב יותר ולהימנע מהתייבשות הקרום.

4. איתור חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום

1. קרום בלוק (ים) במינימום של 0.8 מיליליטר / ² סנטימטר של אודיסיאה חיץ חסימה (אלתוסיף 20-Tween) במשך שעה או 1הלילה בשעה 4 ° C. קרום (ים) גם יכול להיחסם עם חלב יבש ללא שומן, אולם זה עלול לגרום רקע גבוה יותר ולהפריע לגילוי חלבון.
2. דגירה קרום (ים) בנוגדן ראשוני בריכוז הרצוי באודיסיאה חסימת הצפת עם Tween-20 0.1% הלילה בשעה 4 ° C. לזיהוי בשני צבעים, שבו שני אנטיגנים שונים הם דמיינו באותו הכתם, שני הנוגדנים עיקריים חייבים להיות נגזרים ממינים מארח שונים והוסיפו בו זמנית על הקרום (ים). הערה: לפני דוגרים הקרום (ים) בנוגדן ראשוני, הקרום (ים) יכול להיות מחולק לחתיכות שונות על מנת לחקור לנוגדנים מרובים (כלומר יותר מ -2) על אותו הקרום.
3. לשטוף 3x קרום (ים) עבור 10 דקות בכפות תוספת Tween-20 0.1% עם רעד עדין.
4. דגירה קרום (ים) עם הנוגדנים משני שכותרתו fluorescently בדילול של 1:20,000 עבור הערוץ 700 ננומטר ו1:6,000-1:10,000 לערוץ 800 ננומטר בOdyssey חסימת הצפת עם Tween-20 0.1% עבור 30-60 דקות (דוגרים קרום (ים) במשך שעה ארוכה יותר מ1 עשוי להגדיל ברקע). הגן על קרום (ים) מהאור. הערה: הנוגדנים משני צריכים להיות נגזרים מאותו המין המארח כמו כל אחד מהנוגדנים הראשוניים ומסומן עם fluorophores שונה.
5. לשטוף 3x קרום (ים) עבור 10 דקות בכפות תוספת Tween-20 0.1% עם רעד עדין. הגן על קרום (ים) מהאור.
6. קרום (ים) עשוי להיות מיובש או מאוחסן בשתי כפות או PBS ללא Tween-20 על 4 מעלות צלזיוס עד סרקו וצלם עם מערכת הדמיה אינפרא אדום. אות ניאון תישאר יציבה במשך כמה חודשים אם מוגנת כראוי מפני האור.

תוצאות

הקרינה אינפרא אדום בשני צבעים מזהה להקות גם חזקות וגם חלשות באותו קרום עם רגישות משופרת ויחס אות לרעש הגבוה ביותר כדי להפיק תמונות כתם מערביות ברורות. תוצאות אופייניות שנוצרו על ידי זיהוי כתם המערבי שני צבעים דמיינו בשני ננומטר 700 ו800 ערוצי ניאון ננומטר מודגמות ב...

Discussion

השלבים הקריטיים ביצירה באיכות גבוהה, כתמים מערביים כמותיים על פי פרוטוקול זה את הדברים הבאים: 1) מדידת ריכוזי חלבון, 2) הכנת מדגם; 3) חוסמים את הקרום ו; 4) איכות ורמה של הנוגדן הראשוני.

הדיוק של מדידה הכולל ריכוזי חלבון יכול להיות השפע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A