町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

要約

このプロトコルは、ウエスタンブロット分析を行う上での最新の進歩を探る。これらの新規な修飾は、35分間の電気泳動の実行時間を7分乾燥ブロッティング転送システムのBis-Trisゲルシステムを採用して、高解像度、品質、感度、およびウエスタンのデータの精度向上を発生する赤外蛍光タンパク質検出およびイメージング。

要約

もともと1970年代後半に設立されたウエスタンブロット法はまだ積極的に、今日利用されている。しかし、ウエスタンブロッティングのこの伝統的な方法は、低品質の解像度、スプリアスバンド、感度が低下し、貧困層のタンパク質の完全性を含むいくつかの欠点がある。最近の進歩は、劇的に高い定性的および定量的データを生成するために標準的なウェスタンブロットプロトコルの多くの側面を改善している。ビス - トリスゲルシステム、従来のLaemmliシステムに代わるものは、良好なタンパク質の分離及び解像度を生成し、タンパク質の完全性を維持し、35分の実行時間電気泳動を低減する。また、iBlotドライブロッティングシステムは、飛躍的に多くの場合、長い転送時間でより多くの非効率的であり、従来のタンパク質導入の方法とは対照的である7分、内膜へのタンパク質導入の有効性と速度を向上させます。これらの非常に革新的な改良、タンパク質Dと組み合わせて、化学発光の標準的なウェスタンブロッティング技術と比較して、より高品質、より正確で一貫性のあるデータにおける赤外蛍光イメージング結果を用いてetection。この技術は、同時に異なる蛍光チャネルで可視化された二色近赤外色素を利用して同じ膜上の2つの異なる抗原を検出することができる。さらに、蛍光イメージングの直線性と広いダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンドの正確な定量が可能になります。したがって、このプロトコルは、大きく、この実験の実行時間を低減しつつ、これらの進歩は著しく、データの質を向上する古典的なウェスタンブロッティング法、カギ改良を記載している。

概要

ウエスタンブロッティングの技術は最初の抗体^1-3を使用してタンパク質を検出するためのより良い方法を作成するために、1977年と1979年の間に開発されました。この手順では、二次抗体を用いて可視化し、オートラジオグラフィー、UV光、又はペルオキシダーゼ反応生成物³により検出された標的タンパク質とSDS-PAGEゲルからメンブレンへのタンパク質の電気泳動転写を利用した。したがって、これらの同じ基本原理が依然として広く、今日のウエスタンブロットプロトコルで使用される。しかし、この古典的なウェスタンブロッティング技術は、低速の電気泳動の実行時 ​​間、低い解像度と人工タンパク質バンド、タンパク質分解に対する感受性、および限定された感度だけでなく、データ品質⁴として存在する多くの欠点を行います。したがって、このプロトコルは、より正確な定性および定量的データを生成し、標準的なウェスタンブロット手順に大きな進歩と改善について説明します。

"> SDS-PAGEを用いてタンパク質の広い範囲を分離するためのLaemmliシステムがこのウェスタンブロッティングシステムの人気にもかかわらず。ウェスタンブロッティング⁵に最も広く使用されているゲルシステムであり、この方法は、バンド歪み、解像度の損失、およびもたらし得るこれは、分離ゲルの高pH（9.5）に起因するタンパク質の脱アミノ化およびアルキル化の結果、ゲルの様々な酸化還元状態による減少ジスルフィド結合の再酸化、およびアスパ-プロリルの切断であるスプリアスバンド^4。 Laemmli緩衝液（pH ^5.2）、4,6タンパク質を加熱することによるペプチド結合、中性pH（7.0）で動作Lamemmliシステムよりも有意な利点を提供するのBis-Trisゲルシステム、このシステムは、タンパク質安定性、最小限を改善するタンパク質修飾は、その縮小状態でタンパク質を維持する電気泳動中アスパルチル-プロリル切断を防止し、より重要なことに、電気泳動実行時 ​​間tは、さらに35分間^4,6,7ある彼のBis-Trisゲルシステムはまた、シャープなバンドは、高解像度化、分離、およびより信頼性の高いデータが得られる増大した感度を生成する^4。

ビス-Trisゲルシステムと共に、iBlotドライブロッティングシステムは、著しく7分^以内膜上にゲルからのタンパク質の転送時間を減らすために高い電界強度および電流を使用する。この搬送システムは、タンパク質⁸のより効率的で信頼性の高い転写を生成するドライブロッティング法に基づいている。従来の転写システムにiBlot転送システムの有効性の詳細な比較については、次のWebサイトを参照してください。 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html .これは、イオンリザーバ⁸として作用する適切な転写緩衝液を含有するゲルマトリックスから構成され、アノードとカソードのスタックを利用する。転送中に、水の電気分解は、バンド⁸歪み^を引き起こすことなく、より一貫性のタンパク質転写を生じる銅アノードからの酸素の発生を防止するのに役立つ。また、この転写システムはまた、電極⁸間の距離を減少させることによって転送速度を増加させる。

化学発光ウェスタンブロットのタンパク質検出のための最も一般的かつ伝統的な技法であるが解析し、二色赤外蛍光検出感度が大きく、品質、およびウェスタンブロットデータの精度を向上させることができる。この検出方法は、2つの最適な波長700nmの赤外線レーザー励起を使用しておよび800 nmの最大の信号対雑音比及び最高感度⁹鮮明な画像データを生成する。従って、2つの標的タンパク質は700 nmおよび800 nmの蛍光検出チャネルを使用して、同じ膜上で同時に可視化することができる。より重要なことには、赤外蛍光の線形性およびダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンド⁹の正確な定量分析を可能にする。さらに、このプロトコルは、これらのプロセスの有効性を損なう、より大きな定性的および定量的ウェスタンブロットデータを生成するために赤外蛍光タンパク質検出を利用せずにこの実験の電気泳動および転写回数を減少させることによって、古典的なウェスタンブロッティング技術を超える多大な利点および改善を提供する。

プロトコル

1。細胞培養からの全細胞溶解物の調製

1. 氷上で細胞培養皿を置き、5mMのEDTA（5 mMのEDTA/10 CM ²プレートとのPBS 例えば 5ml）で冷PBSを追加します。セルスクレーパーを用いて皿から接着細胞を除去した後、冷たい15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。
2. 4℃で5分間1,000 rpmで（230×g）で低速遠心分離により細胞懸濁液をペレット氷の上に円錐形のチューブをセットし、慎重にペレットを中断することなく、上清を吸引除去する。
3. 5mMのEDTAを含むPBS 1mlでペレットを洗浄し、冷たい1.5ミリリットル遠心チューブに細胞懸濁液を移す。細胞をペレットに10秒間、13,000 rpmで（13226×g）でクイックスピンサスペンション。慎重に氷上でペレットと場所のチューブを中断せずに上清を除去します。
4. で、（ つまり、3×10 ^6個の細胞のためのRIPA緩衝液の〜150μLを加えペレットサイズに応じて）25〜200μL中でペレットを再懸濁RIPA緩衝液（50mMトリス、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA、10mMのNaFを、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1％NP-40）2×最終濃度で新たに追加されたプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む。簡単に言えば、各チューブをボルテックスし、氷上で20〜30分のために停止をインキュベートする。注：タンパク質およびそれらの変性界面活性剤（ すなわち、SDS、トリトンX-100、またはNP-40）の強度を可溶化する能力が異なるタンパク質を抽出するために使用できるいくつかの溶解緩衝液が存在する。 RIPA緩衝液は、全細胞溶解物を調製し、タンパク質 - タンパク質相互作用を破壊するために有用である。
5. 4℃で5分間14,000 rpmで（15339×g）で、ポスト核分画、遠心溶解物を作成するには氷の上で核濃縮ペレットと場所のチューブを中断することなく、新しいチューブに上清を移します。注：上清を抽出しながら、核濃縮ペレットを、チューブから切り離すことがあります。核に富んだペレットを集めないようにするには、私が直接ピペットチップを配置粘性の核に富んだペレットNTO、それを処分するために、ピペットでそれを描画します。
6. BCA又はブラッドフォードなどのタンパク質定量アッセイを使用して製造業者の指示に従って、各サンプルのタンパク質濃度を決定する。

2。サンプルの調製および電気泳動

1. 以下に概略次の表に従って各サンプルを準備します。代替として、β-メルカプトエタノールはまた、2.5％の最終濃度で使用することができる。しかし、還元剤は、ゲルをロードする前に、各サンプル時間までに添加されるべきである。ウェルあたりロードされた各調製した試料のわずか20μlのピペット操作のバリエーションの合計容量を占めています。

   試薬	減少したサンプル
   タンパク質試料	XμL
   4X LDSサンプルバッファー	6μL
   500 nMのDTTレッドucingエージェント	2.4μL
   脱イオン水	最大15.6μL
   全容積	24μL

2. 10分間、70°Cでの加熱試料。サンプルが加熱している間、（50ミリリットルの20倍のMESまたはMOPSランニングバッファーを加えた950ミリリットルの脱イオン水）をランニングバッファー1X MESまたはMOPSの千ミリリットルを用意。 MESがバッファを実行すると、ランニングバッファーMESが速くMOPS ⁴よりも実行することができます低いpKaを持つ2〜200 kDaの間のより小さな分子量のタンパク質を解決するのに対し、MOPSランニングバッファーは、14から200 kDaの間の中間サイズのタンパク質を解決します。従って、これら2つのバッファがタンパク質バンド⁴の分離の違いにつながるスタッキングゲル内のイオンの移動に影響を対比している。取っておくと酸化防止剤の500μlのランニングバッファー1X MESまたはMOPSの200ミリリットルを組み合わせ、最小の上部バッファー商工を埋めるために使用されるI細胞電気泳動装置。
3. サンプルは、氷の上にそれらを配置する前に加熱、クイックスピンサンプルを完了したら。
4. 電気泳動用ミニ電池ユニットへのプレキャストBis-Trisゲルの組み立てについては、製造元の指示に従ってください。注：各ゲルは各ゲルの短い（小さい）カセットをバッファコアに向かって内側に面しており、ゲルはレベルであり、しっかりと上部バッファーチャンバーからの漏れを回避するためのバッファコアに押し付けるようなやり方で配向されていることを確認してください。
5. 1X MESや抗酸化剤および1X MESまたはMOPSランニングバッファーを約600ミリリットルとミニセルユニットの下部バッファ商工を含むMOPSランニングバッファー200mlで上部バッファーチャンバーを埋める。ランニング緩衝液の余分200〜300ミリリットル、後で使用するために保存することができる。しかし、緩衝液のpHと品質が変更することができるように、電気泳動の実行中に使用されるバッファを再利用することは推奨されません。
6. ロード各タンパク質SAMP20μlのルの各ウェルに。複数の抗体（ すなわち 2つ以上）を探るために、種々のストリップに膜を区画した場合、それは非常にこれはとなるように各ゲルの最初と最後のウェル中予備染色タンパク質標準の2-5μLをロードすることをお勧めしますタンパク質バンドの画像化に影響を与えることなく、膜の異なる部分を分離するための切断ガイド。
7. 最後にスタートし、ゲルあたり70〜80ミリアンペアで110〜125ミリアンペア/ゲルの期待される電流で35分間200 V一定にゲルを実行します。追跡用色素がバッファコアに沿って白金線に移行するときに電気泳動が完了します。

3。 iBlotドライブロッティングシステムを用いたタンパク質導入

1. 完全に（これはパチパチノイズが発生する場合があります）、カセットの結合した側面を破ってミニゲルを分離する。短い（小さい）プレートを捨て、慎重に脱イオン水で容器に長い（マイナス）プレートからゲルを転送し、底部にあるゲルの厚い足の部分を削除します。注：まれに、ゲルは長い短いプレートの代わりに取り付けることができる、プレートスロット付き。この場合は、より長い、溝付きプレートを破棄し、一番下にあり、ゲルの厚い足の部分を削除します。その後、慎重に脱イオン水に短いプレートからゲルを移す。
2. 製造業者の指示に従って、アノードとカソード転写スタックを組み立てる。注：両方のニトロセルロースまたはPVDF膜は、タンパク質の高品質かつ効率的な転送を提供し、蛍光検出⁸と互換性があります。しかし、PVDF膜は、ニトロセルロースよりも高い結合容量（240μgの/ cm ^3）と （200μgの個/ cm ^3）8を持っています。
3. 慎重にこれを転送中にタンパク質バンドの歪みを防ぐことができますようにゲルと膜の間に閉じ込められた気泡や空気を除去。注：膜または変圧トリムしない小胞体これは、アノードとカソードのスタックとの間の直接的な接触を引き起こすとしてゲルサイズに合わせてスタック。
4. 正しく転送を組み立てた後、ドライブロッティング装置上にスタック、適切な電圧プログラムを選択します（ つまり、プログラム3：7分20 V）を、転送を開始します。注意：150 kDaのより大きいタンパク質は、よりゆっくりと移動する傾向があり、8月10日分の長い転送時間が必要な場合があります。また、5〜10分間、20％エタノール中のゲルのインキュベーション前は、これらの大きなタンパク質の転写効率を向上させることができます。転送プログラムが完了すると、デバイスは自動的に電流を遮断します。それはすぐに膜を除去し、より良いタンパク質の検出を確実にし、膜を乾燥を避けるためにブロック化手順を続行することをお勧めします。

4。赤外蛍光タンパク質検出

1. 1時間ブロッキングバッファーオデッセイ（トゥイーン20を追加しないでください）の0.8ミリリットル/ cm ²の最小のブロック膜（S）または4℃で一晩膜（単数または複数）はまた、しかし、これはより高いバックグラウンドを生じ、タンパク質の検出を妨害し得る、無脂肪乾燥ミルクでブロックすることができる。
2. 4℃で一晩、0.1％Tween-20をOdysseyブロッキング緩衝液中の所望の濃度で一次抗体にメンブレン（複数可）をインキュベート二つの異なる抗原が同じブロット上で可視化した二色検出のための二次抗体は、異なる宿主種に由来しなければならず、膜（単数または複数）に同時に添加した。注：前の一次抗体で膜（複数可）をインキュベートし、膜（s）は同じ膜上に複数の抗体（ すなわち 2つ以上）のためにプローブするために、種々の小片に区分され得る。
3. 穏やかに振盪しながら、TBS中で10分間メンブレン（S）3X +0.1％のTween-20を洗ってください。
4. Odysse 800 nmのチャネルのために700 nmのチャネルのために1:20,000の希釈で蛍光標識した二次抗体を用いた膜（複数可）をインキュベートし、1:6,000-1:10,000yが（より長い1時間膜（複数可）をインキュベートすると、バックグラウンドを増加させることができる）、30〜60分間、0.1％Tween-20でブロッキングバッファー。光から膜（複数可）を保護します。注：二次抗体が一次抗体のそれぞれと同じ宿主種に由来し、異なる蛍光体で標識される必要がある。
5. 穏やかに振盪しながら、TBS中で10分間メンブレン（S）3X +0.1％のTween-20を洗ってください。光から膜（複数可）を保護します。
6. スキャンされ、赤外線イメージングシステムで画像化されるまで、膜（単数または複数）Tween-20で4℃にてずに乾燥又はTBSまたはPBSのいずれかに格納されてもよい。適切に遮光している場合、蛍光シグナルは、数ヶ月間安定したままになります。

結果

二色赤外蛍光感度が向上し、鮮明ウェスタンブロット画像を生成するために最高の信号対雑音比と同じ膜上に強弱両方のバンドを検出する。 700 nmおよび800 nmの蛍光チャンネルの両方において可視化二色ウェスタンブロット検出によって生成された典型的な結果を図1および図2に例示されている。 図1の最上段のウェスタンブロットは、ヒト由来の溶解物?...

ディスカッション

このプロトコルによれば、高品質の定量的なウエスタンブロットを生成する際の重要なステップは以下の通りである：1）タンパク質濃度を測定するステップと、2）試料調製、3）膜をブロッキングし、4）一次抗体の品質および口径。

総タンパク質濃度の測定精度は、赤外蛍光検出の感度は例外的なサンプルのタンパク質濃度で検出されたわずかな違いを増幅するので、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A