Town Batı Hızlı: Klasik Western Blot Analizi Üzerine Bir Çağdaş Büküm

Özet

Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır.

Özet

Aslında 1970'lerin sonlarında kurulan Western Blot teknikleri hala aktif olarak bugün kullanılmaktadır. Ancak, Batılı beneklenmesinin bu geleneksel yöntem, düşük kaliteli çözünürlük, sahte bantları, duyarlılık azalması ve zayıf protein bütünlüğü dahil birçok sakıncaları vardır. Yeni gelişmeler büyük ölçüde yüksek nitel ve nicel veri üretmek için standart Batı benek protokolü birçok yönlerini düzeldi. Bis-Tris jel sistemi, geleneksel Laemli sistemine alternatif, daha iyi protein ayırma ve çözünürlük üretir protein bütünlüğünü korur ve bir 35 dk çalışma süresi elektroforezini azaltır. Ayrıca, iBlot kuru blot sistemi, büyük ölçüde sık sık uzun transfer süreleri daha verimsiz olan geleneksel protein transfer yöntemleri aksine, 7 dakika içinde zara transfer protein etkinliğini ve hızını artırır. Bu çok yenilikçi değişiklikler, protein D ile birlikteetection, yüksek kalitede kızıl ötesi floresan görüntüleme sonuçları kullanılarak daha hassas ve kemiluminesans standart Western blot tekniği ile karşılaştırıldığında veriler tutarlı. Bu teknoloji, aynı anda farklı flüoresan kanallar olarak görüntülenen iki renkli yakın kızıl ötesi boyalar kullanarak, aynı zar üzerinde iki farklı antijenlerini tespit edebilir. Ayrıca, flüoresan görüntüleme doğrusallık ve geniş dinamik aralık güçlü ve zayıf hem de protein bantlarının hassas ölçümü sağlar. Böylece, bu protokol, büyük ölçüde bu denemenin performans zaman azaltırken, bu gelişmelerin önemli verilerin kalitesini arttıran klasik Western lekeleme yöntemi için anahtar geliştirmeleri açıklar.

Giriş

Western blot tekniği kullanılarak ilk antikorlar ^1-3 proteinlerinin bulgulanması için daha iyi bir yöntem yaratmak için 1977 ve 1979 yılları arasında geliştirilmiştir. Bu prosedür, ikincil antikorlar kullanılarak görselleştirildi ve otoradyografi, UV ışığı veya bir peroksidaz reaksiyon ürünü ³ tarafından tespit hedef proteinler SDS-PAGE jelleri zarlara proteinlerinin elektroforetik transferi kullanılmıştır. Bu nedenle, bu aynı temel prensipler hala yaygın olarak bugünün Batı benek protokolleri kullanılır. Ancak, bu klasik Western lekeleme tekniği böyle yavaş elektroforez çalışma süreleri, düşük çözünürlükte ve yapay protein bantları, protein yıkımı yatkınlık, ve sınırlı duyarlılık yanı sıra zayıf veri kalitesi ⁴ olarak mevcut birçok dezavantajları yapar. Bu nedenle bu protokol daha doğru nitel ve nicel veriler üretir standart Batı benek prosedüre önemli ilerlemeler ve geliştirmeleri açıklar.

"> SDS-PAGE kullanılarak proteinlerin geniş bir ayrılması için Laemmli sistemi bu Western blotting sistemin popülerlik rağmen. Western blot ⁵ için en çok kullanılan jel sistemi olup, bu yöntem, bant bozulma, çözünürlük kaybı ve neden olabilir sahte bantları ^4. bu ayırma jel, indirgenmiş disülfid jelin farklı redoks durumuna bağlı bağlar, ve aspartil-prolil bölgesinin parçalanmasının reoksidasyon yüksek pH (9.5) nedeniyle proteinlerin deaminasyon ve alkilasyon bir sonucu olabilir, Laemmli tampon maddesi (pH 5.2) ^4,6 proteini ısıtılması nedeniyle peptid bağlar., nötr pH değerinde (7.0) ile çalışır Lamemmli sistemi üzerinde önemli avantajlar sağlar Bis-Tris jel sistemi. Bu sistem, protein stabilitesi, en aza artırır protein modifikasyonları, bunların düşük eyalette proteinleri muhafaza elektroforez sırasında aspartil-prolil bölünmesini önler ve daha da önemlisi, elektroforez çalışma süresi t, ek olarak. 35 dk ^4,6,7 olduğuO Bis-Tris jel sistemi de daha güvenilir veri ⁴ sonuçlanan keskin bantlar, yüksek çözünürlük ve ayırma, ve artan duyarlılığı üretir.

Bis-Tris jel sistemi ile bağlantılı olarak, iBlot kuru blot sistemi önemli ölçüde, 7 dakika içinde ⁸ zarının üzerine jellerinden proteinlerin devir süresini azaltmak için yüksek bir alan kuvveti ve akımlarını kullanır. Bu transfer sistemi ^{proteinleri, 8,} daha verimli ve güvenilir transferi oluşturur kuru lekeleme yöntem dayanmaktadır. : Konvansiyonel aktarım sistemlerine iBlot transfer sisteminin etkinliği ayrıntılı bir karşılaştırma için aşağıdaki web sitesine bakın http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Bu iyon rezervuar ⁸ olarak hareket uygun aktarma tamponlar içeren bir jel matrisinin oluşmaktadır bir anot ve katot yığını kullanmaktadır. Transferi sırasında, su elektroliz bant bozulma ⁸ neden olmadan daha tutarlı bir protein transferi ile sonuçlanan bakır anot oksijen üretilmesini engellemeye yardımcı olur. Ayrıca, bu transfer sistemi, aynı zamanda, elektrotlar ⁸ arasındaki mesafeyi azaltarak aktarım hızını artırır.

Kemiluminesan Western Blot protein tespiti analizleri için en yaygın ve geleneksel bir teknik olmasına rağmen, iki renkli kızılötesi floresan tespiti büyük ölçüde Western Blot veri duyarlılık, kalite, ve doğruluğunu artırır. Bu saptama metodu, iki uygun dalga boyunda, 700 nm olarak kızıl ötesi lazer kullanır uyarmave 800 nm, büyük sinyal-gürültü oranı ve yüksek duyarlılık ⁹ ile net bir veri görüntü oluşturmak için. Bu nedenle, iki hedef proteinler, 700 nm ve 800 nm floresan saptama kanalları kullanılarak, aynı zar üzerinde eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Daha da önemlisi, kızıl ötesi floresan doğrusallık ve dinamik aralık güçlü ve zayıf hem de protein bantları ⁹ hassas kantitatif analiz için izin verir. Ayrıca, bu protokol bu işlemlerin etkinliğini tehlikeye ve daha nitel ve nicel Western blot verileri üretilmesi için, kızılötesi floresan protein algılama kullanmadan bu denemenin elektroforez ve transfer kez azaltarak klasik, Western lekeleme tekniği üzerinde büyük bir avantaj ve geliştirmeleri sağlar.

Protokol

1.. Hücre Kültürü alınan bütün hücre lizatları hazırlanması

1. Buz üzerinde hücre kültür kaplarına koyun ve 5 mM EDTA (PBS örneğin 5 ml 5 mM EDTA/10 cm ² tabanı ile), soğuk PBS ilave edin. Bir hücre kazıyıcı kullanılarak tabaktan yapışmayan hücreler giderilmiş ve sonra soğuk bir 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın.
2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 rpm'de (230 x g) düşük hızlı santrifüjleme ile hücre süspansiyonları Pelet Buz üzerinde konik tüpler yerleştirin ve dikkatli pelet bozmadan süpernatant aspire.
3. 5 mM EDTA içeren PBS içinde 1 ml pelet yıkayın ve soğuk 1.5 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. Hücreler pelet 10 saniye boyunca 13,000 rpm (13,226 xg) Quick Spin süspansiyonu. Dikkatle buz üzerinde pelet ve yer tüpleri aksatmadan süpernatant kaldırmak.
4. In, (örneğin 3 x 10 ⁶ hücre için RIPA tampon ~ 150 ul ekle topak boyutuna bağlı olarak) 25-200 ul pelletiniRIPA tamponu (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 mM NaF,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1 NP-40), 2x nihai konsantrasyonda taze ilave proteaz ve fosfataz inhibitörleri ihtiva etmektedir. Kısaca her tüp vorteks ve buz üzerinde 20-30 dakika süreyle askıya inkübe. Not: proteinleri ve denatüre edici deterjan (örneğin SDS, Triton X-100 ya da NP-40) gücünü çözündürülmesi için kabiliyetleri farklı proteinleri çıkarmak için kullanılabilecek çeşitli liziz tampon vardır. RIPA tamponu bütün hücre lizatları hazırlanması ve protein-protein etkileşimlerini bozan için yararlıdır.
5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 14,000 rpm (15,339 xg), bir post-nükleer fraksiyonu santrifüj lizatları oluşturmak için Buz üzerinde nükleer zenginleştirilmiş pelet ve yer tüpleri bozmadan yeni bir tüp süpernatant aktarın. Not: süpernatantı genişletilirken nükleer pelet bakımından zenginleştirilmiş, aynı zamanda, borunun ayırmak olabilir. Nükleer zenginleştirilmiş pelet toplama önlemek için, ben doğrudan pipet yerleştirmekviskoz nükleer zenginleştirilmiş pelet nto ve onu imha etmek için pipet ile o kadar çizin.
6. BCA ya da Bradford gibi protein miktar tahliller kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak, her numunenin protein konsantrasyonunu belirleyin.

2. Numune Hazırlama ve Elektroforez

1. Aşağıda özetlenen aşağıdaki tabloya göre her bir örnek hazırlayın. Bir alternatif olarak, β-mersaptoetanol da% 2.5 'lik bir son konsantrasyonda kullanılabilir. Bununla birlikte, söz konusu indirgeme ajanı, jel yüklemeden önce bir saat için, her numune kadar eklenmelidir. Hazırlanan her numunenin sadece 20 ul pipet varyasyonlar için toplam hacim hesaplar iyi başına yüklendi.

   REAKTİF	DÜŞÜK NUMUNE
   Protein Numune	X ul
   4x LDS Sample Buffer	6 ul
   500 nM DTT Reducing Ajan	2.4 ul
   Deiyonize Su	Kadar 15.6 ul
   Toplam Hacim	24 ul

2. 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısı örnekleri. Örnekler ısıtma olsa da, (50 mi 20x veya MES çalışma buffer MOPS artı 950 ml deiyonize edilmiş su) akan tampon 1x MES veya MOPS 1000 ml hazırlar. Tampon Koşu MES MES hızlı MOPS ⁴ daha çalıştırmak için Buffer Koşu sağlayan bir düşük pKa ile 2-200 kDa arasında daha küçük molekül ağırlıklı proteinler giderir ise tampon Koşu MOPS, 14-200 kDa arasında orta boy proteinleri giderir. Bu nedenle, bu iki tampon protein bantlarının ^4'ün ayrılmasından farklılıklara neden olan istifleme jel içinde iyonlarının göçü üzerindeki etkileri zıt var. Kenara ve Min Üst Tampon Odası'nı doldurmak için kullanılacak 200 1x MES ml veya Antioksidan 500 ul ile Buffer Koşu MOPS, birleştirmeki-Cell elektroforez birimi.
3. Numuneler buz üzerinde yerleştirmeden önce ısıtma, hızlı sıkma örnekleri bitirdikten sonra.
4. Elektroforez için Mini-Cell ünitesine prekast Bis-Tris jellerin montajı için üreticinin yönergelerini izleyin. Not: Her bir jel, her jel kısa (küçük) kaset Tampon Çekirdek içeriye doğru dönük ve jeller düzey ve sıkı Üst Tampon Odası sızmasını önlemek için tampon Çekirdek bastırılan böyle bir moda odaklı olduğundan emin olun.
5. 1x MES veya Antioksidan ve 1x MES veya Buffer Koşu MOPS yaklaşık 600 ml Mini-Hücre biriminin Alt Tampon Odası'nı içeren Buffer Koşu MOPS 200 ml Üst Tampon Odası'nı doldurun. Tampon çalışan ekstra 200-300 ml daha sonra kullanmak üzere kaydedilebilir. Bununla birlikte, tamponun pH değeri ve kalite değiştirilmiş edilebilir elektroforez çalışması sırasında kullanılan tampon geri dönüşüm için tavsiye edilmez.
6. Her bir protein samp 20 ul yükle her bir kuyunun içine. Birden antikorlar (yani en fazla 2) problanması için çeşitli şeritler halinde membran kesit halinde, oldukça bu olarak görev yapacak her jel ilk ve son kuyularda Önceden Boyanmış protein standart 2-5 ul yük önerilir protein bantlarının görüntüleme etkilemeden, zarın farklı bölümleri ayırmak için, kesme alanlar.
7. Sonunda başlangıç ​​ve jel başına 70-80 mA'da 110-125 mA / jel beklenen bir akımı ile 35 dakika boyunca 200 V sabit çalıştır jeller. Izleme boya Buffer Çekirdek boyunca platin tel göç Elektroforez tamamlanır.

3. IBlot Kuru Blot Sisteminin Kullanılması Protein Transferi

1. Tamamen (bu çatırdatacak üretebilir) kasetin bağlanmış tarafı kırarak Mini-jeller ayırın. Daha kısa (küçük) plaka atın ve dikkatli bir şekilde deiyonize su ile bir kabın içine daha fazla (yarıklı) plakadan jel aktarmakalt kısmında yer alan, jel kalın ayaklı kısmını çıkarmak. Not: Nadir durumlarda üzerine, jel uzun kısa plaka yerine eklemek olabilir, plaka yaptı. Bu durumda, daha uzun, oluklu levha atmak ve alt kısmında yer alan, jel kalın ayaklı kısmını çıkarmak. Daha sonra, dikkatli bir şekilde iyondan arındırılmış su ile kısa plakadan jel aktarın.
2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak anot ve katot aktarma yığınları birleştirin. Not: nitroselüloz veya PVDF membranları iki protein arasında yüksek kaliteli ve verimli transferi sağlar ve floresan algılaması ⁸ ile uyumludur. Bununla birlikte, PVDF membran nitroselüloz daha yüksek bir bağlama kapasitesine (240 ug / cm ³⁾ (200 ug / cm ^{3) 8} var.
3. Dikkatlice kabarcıklar veya bu gibi jel ve membran arasına sıkışmış hava transferi sırasında protein bantlarının herhangi bozulmasını engeller çıkarın. Not: membran veya transf Döşeme yoker bu anot ve katot yığınlar arasında doğrudan temasın neden olacak gibi jel boyutuna sığacak şekilde yığını.
4. Sonra düzgün kuru emme cihazda aktarma yığınları montaj, uygun voltaj programı (yani Program 3: 7 dakika 20 V) seçin ve transferi başlar. Not: 150 kDa'dan büyük bir proteinler daha yavaş göç eğilimi ve 8-10 dakika daha uzun bir aktarım zaman gerektirebilir. Buna ek olarak, 5-10 dakika boyunca% 20 etanol içinde jelin önceden kuluçka da bu büyük proteinlerin aktarım etkinliğini artırmak için yardımcı olacaktır. Transfer programı tamamlandığında, cihaz otomatik olarak akımı kapanacaktır. Hemen membran kaldırmak ve daha iyi protein algılama sağlamak ve membran kurumasını önlemek için engelleme prosedürü ile devam etmek en iyisidir.

4. Kızılötesi Floresan Protein Algılama

1. Odyssey 1 saat ya da için Buffer (Tween-20 ekleyin Etmeyin) Engelleme 0.8 ml / cm ² minimum blok membran (ler)gece boyunca at 4 ° C. Membran (ler), aynı zamanda, ancak bu daha yüksek bir arka plan neden olabilir ve protein algılama engelleyebilir, yağsız kuru süt ile bloke edilebilir.
2. 4 ° C de bir gece boyunca,% 0.1 Tween-20 ile Bloklama Tamponu Odyssey'de istenen konsantrasyonda primer antikor olarak membran (lar) inkübe Iki farklı antijenler, aynı blot üzerinde görselleştirildiği edildiği iki renkli algılama için, iki primer antikorlar, farklı ev sahibi türünden türemiş olması ve membran (lar) aynı anda ilave edildi. Not: önce, birincil antikor olarak membran (lar) kuluçka için, zar (lar), aynı zar üzerinde birden fazla antikor (yani en fazla 2) için araştırmak amacıyla çeşitli parçalar halinde bölümlere edilebilir.
3. TBS içinde 10 dakika artı% 0.1 Tween-20 hafifçe çalkalanarak için membran (lar) 3 kez yıkayın.
4. Odysse olarak 800 nm kanal için 700 nm kanal ve 1:6,000-1:10,000 için bir 1:20,000 seyreltide floresan etiketli sekonder antikor ile membran (lar) inkübey (daha uzun süre, 1 saat boyunca membran (lar) enkübe arka arttırabilir), 30-60 dakika boyunca,% 0.1 Tween-20 ile Bloklama Tamponu. Işıktan membran (ler) koruyun. Not: ikincil antikorlar birincil antikor her biri aynı ev sahibi türünden türemiş farklı fluorophores işaretlenmelidir gerekmektedir.
5. TBS içinde 10 dakika artı% 0.1 Tween-20 hafifçe çalkalanarak için membran (lar) 3 kez yıkayın. Işıktan membran (ler) koruyun.
6. Taranır ve Kızılötesi Görüntüleme Sistemi ile görüntülenmiş kadar membran (lar) Tween-20, 4 ° C 'de kurutulur ve TBS veya PBS ile ya da depolanabilir. Düzgün ışıktan koruyarak floresan sinyal birkaç ay boyunca stabil olacaktır.

Sonuçlar

İki renkli kızılötesi floresan gelişmiş hassasiyet ve net Western Blot görüntüler üretmek için en yüksek sinyal-gürültü oranı ile aynı zar üzerindeki güçlü ve zayıf hem bantları algılar. 700 nm ve 800 nm flüoresan kanallar hem de görsel iki renkli Western blot algılama tarafından oluşturulan tipik sonuçlar, Şekil 1 ve 2'de örneklenmiştir. Şekil 1 'de üst Western blot insandan lizatlarının, iki kat seri dilüsyonları 700 nm k...

Tartışmalar

Bu protokole uygun olarak yüksek kaliteli, niceliksel Western blotları elde edilmesinde kritik adımlar aşağıdaki gibidir: 1) protein konsantrasyonlarının ölçülmesi, 2) örnek hazırlama, 3) bloke edilmesi ve, 4), birincil antikor kalite ve kalibre.

Toplam protein konsantrasyonları ölçüm doğruluğu kızılötesi floresan tespit olağanüstü duyarlılık örneklerin protein konsantrasyonu bulunan herhangi bir hafif farklılıkları büyütmektedir çünkü protein bantları mi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A