Самый быстрый Западная в городе: современный поворот на анализ Классический вестерн-блоттинга

Резюме

Этот протокол исследует новейшие достижения в выполнении Вестерн-блот анализа. Эти новые модификации используют систему гель Bis-Tris с 35 мин электрофореза время выполнения 7 мин системы передачи сухой блоттинг и инфракрасного обнаружения флуоресцентного белка и обработки изображений, который создает высокое разрешение, качество, чувствительность и повышенную точность западных данных.

Аннотация

Западные методы блот, которые изначально были созданы в конце 1970-х по-прежнему активно используются сегодня. Впрочем, это традиционный метод вестерн-блоттинга имеет несколько недостатков, которые включают низкое разрешение качества, паразитные полосы, снижение чувствительности, а также плохую целостность белка. Последние достижения резко улучшилось многочисленные аспекты стандартной западной протокола блот производить более качественные и количественные данные. Система гель Bis-Tris, альтернативой традиционной системе Лэммли, генерирует лучшее разделение и разрешение белка, поддерживает целостность белка, а также снижает электрофореза в то время, 35 мин выполнения. Кроме того, iBlot сухой блоттинг система, значительно повышает эффективность и скорость передачи белка на мембрану в 7 мин, что в отличие от традиционных методов переноса белка, которые часто более неэффективными с длительному времени передачи. В сочетании с этими инновационных модификаций, белка Detection помощью инфракрасных результаты визуализации люминесцентных высшего качества, более точным и согласованные данные по сравнению с стандартной западной промокательной техники хемилюминесценции. Эта технология может одновременно обнаруживать двух различных антигенов на той же мембране с использованием двухцветной ближней инфракрасной красители, которые визуализируются в различных флуоресцентных каналов. Кроме того, линейность и широкий динамический диапазон флуоресцентных изображений позволяет точно количественной оценки как сильных и слабых белковых полос. Таким образом, этот протокол описывает ключевые усовершенствования в классической западной блоттинга, в которых эти достижения значительно повысить качество данных в то время как значительно снижает сроки выполнения этого эксперимента.

Введение

Методика вестерн-блоттинга была впервые разработана между 1977 и 1979, чтобы создать лучший метод для обнаружения белков с использованием антител ^1-3. Эта процедура используется электрофоретического переноса белков с мембранами ПААГ с ДСН с белков-мишеней визуализированных с помощью вторичных антител и обнаруженных с помощью авторадиографии, УФ-света, или пероксидазной реакции продукта ^3. Таким образом, эти же самые основные принципы все еще широко используются в современных западных протоколов клякс. Тем не менее, это классический вестерн-блоттинга техника действительно представляет много недостатков, таких как медленной электрофорез временем работы, с низким разрешением и искусственных белковых полос, восприимчивости к деградации белков и ограниченной чувствительности, а также низкое качество данных ^4. Таким образом, этот протокол описывает значительные успехи и улучшения в стандартной западной процедуры пятно, которое генерирует более точные количественные и качественные данные.

"> Система Laemmli для разделения широкий спектр белков с использованием SDS-PAGE является наиболее широко используемой системой гель для вестерн-блоттинга ^5. Несмотря на популярность этого вестерн-блоттинга системы, этот метод может привести к искажению группы, потери разрешения, и паразитные полосы ^4. Это может быть следствием дезаминирования и алкилирования белков в связи с высоким рН (9,5) разделительного геля, повторного окисления восстановленных дисульфидных связей из-за различной редокс-состояния геля и расщепления аспартил-пролил пептидные связи при нагревании белка в Laemmli буфера (рН 5,2) ^4,6. Система гель Bis-Tris, который работает при нейтральном рН (7,0), обеспечивает значительные преимущества над системой Lamemmli. Эта система улучшает стабильность протеина минимизирует модификации белка, поддерживает белки в их уменьшенными государств, предотвращает аспартил-пролил-расщепление во время электрофореза, и что более важно, электрофорез запустить время 35 мин ^4,6,7. Кроме того, тСистема гель он Бис-Трис также производит более четкие полосы, более высокое разрешение и разделение, и повышенную чувствительность в результате чего более надежных данных ^4.

В сочетании с системой гель Bis-Tris, iBlot сухая система блоттинга использует высокую напряженность поля и токи значительно сократить время передачи белков из гелей на мембранах в течение 7 мин ^8. Эта система передачи основан на сухой метод блоттинга, который генерирует более эффективную и надежную передачу белков ^8. Для детального сравнения эффективности системы передачи iBlot к обычным систем передачи пожалуйста, обратитесь к веб-сайте: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Он использует стек анод и катод, которые состоят из гелевой матрице, содержащей соответствующие буферы передачи, которые действуют как резервуары ионных ^8. Во время передачи, электролиз воды помогает предотвратить образование кислорода из медного анода, что приводит к более последовательного переноса белков без ущерба полосы ^8. Кроме того, эта система передачи также увеличивает скорость передачи за счет уменьшения расстояния между электродами ^8.

Хотя ХЛ является наиболее распространенным и традиционным методом для обнаружения белка Западной блоттинга, двухцветный обнаружения инфракрасного флуоресцентного значительно улучшает чувствительность, качество и точность западным данным блот. Этот метод обнаружения использует возбуждение инфракрасного лазерного в двух оптимальных длин волн, 700 нми 800 нм, для создания четкого изображения данных с наибольшей отношения сигнал-шум и высокой чувствительностью ^9. Таким образом, две целевые белки могут быть визуализированы одновременно на той же мембране с использованием 700 нм и 800 нм флуоресцентных каналов обнаружения. Что еще более важно, линейность и динамический диапазон инфракрасного флуоресценции позволяет точно количественного анализа и сильных и слабых белковых полос ^9. Кроме того, этот протокол предоставляет огромные преимущества и улучшений по сравнению с классической западной промокательной техники путем уменьшения электрофорез и время передачи этого эксперимента не ставя под угрозу эффективность этих процессов и использования обнаружения инфракрасного флуоресцентный белок для производства более качественных и количественных данных вестерн-блот.

протокол

1. Подготовка Клеточные лизаты из клеточной культуры

1. Поместите посуду культуре клеток на льду и добавить холодную PBS с 5 мМ ЭДТА (например 5 мл PBS с 5 мМ EDTA/10 см ² пластины). Удалить прилипшие клетки из чашки с использованием клеточного скребка, а затем передать клеточной суспензии в холодный 15 мл коническую пробирку.
2. Гранул клеточные суспензии от низкоскоростного центрифугирования при 1000 оборотов в минуту (230 мкг) в течение 5 мин при 4 ° С. Наведите конические пробирки на лед и тщательно аспирата супернатант, не нарушая гранул.
3. Промыть гранулу с 1 мл PBS с 5 мМ ЭДТА и передачи клеточной суспензии к холодному 1,5 мл центрифужную пробирку. Быстрый спин подвеска при 13000 оборотов в минуту (13 226 мкг) в течение 10 сек для осаждения клеток. Осторожно снимите супернатант, не нарушая гранул и место трубки на льду.
4. Ресуспендируют гранул в 25-200 мкл (в зависимости от размера гранул, т.е. в течение 3 х 10 ⁶ клеток добавить ~ 150 мкл RIPA буфера) вRIPA буфере (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaF, 0,1% SDS, 0,5% дезоксихолат натрия, 1% NP-40), содержащий недавно добавленный протеазы и ингибиторы фосфатазы в 2 раза до конечной концентрации. Кратко вихрь каждую пробирку и инкубировать подвески в течение 20-30 мин на льду. Примечание: Есть несколько буферов лизиса которые могут быть использованы для извлечения белков, которые отличаются по их способности к солюбилизации белков и силу их денатурации моющего средства (например, SDS, Triton X-100, или NP-40). RIPA буфер пригодны для получения Клеточные лизаты и разрушая белок-белковых взаимодействий.
5. Для создания пост-ядерной фракции, центрифуг лизатов при 14000 оборотов в минуту (15 339 мкг) в течение 5 мин при 4 ° С. Передача супернатант в новую пробирку, не нарушая осадок и место трубки ядерного обогащенный на льду. Примечание: ядерная обогащенный осадок может также отсоединить от трубы при извлечении супернатант. Чтобы избежать сбора осадка ядерной обогащенный, разместить пипетки непосредственно яНТО вязкой ядерной обогащенный гранул и рисовать его с пипетки, чтобы избавиться от него.
6. Определение концентрации протеина каждого образца в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием таких белков количественного анализа как BCA или Брэдфорда.

2. Подготовка проб и электрофорез

1. Подготовка каждого образца в соответствии со следующей таблицей, описанной ниже. В качестве альтернативы, β-меркаптоэтанол также может быть использован в конечной концентрации 2,5%. Тем не менее, восстановитель должен быть добавлен к каждому образцу до одного часа перед загрузкой в ​​гель. Общая сумма счетов громкости для вариаций пипеток только с 20 мкл каждого подготовленного образца загружалась на лунку.

   РЕАГЕНТОВ	Повышена ОБРАЗЕЦ
   Белок Образец	X мкл
   4x LDS Образец Буфер	6 мкл
   500 нМ DTT Красныйucing Агент	2.4 мкл
   Деионизированная вода	До 15,6 мкл
   Общий объем	24 мкл

2. Образцы Тепловые при 70 ° С в течение 10 мин. В то время как образцы нагрева, подготовить 1000 мл 1x МЧС или MOPS рабочем буфере (50 мл 20x МЧС или МОПС Running Buffer плюс 950 мл деионизированной воды). MOPS Running буфер решает среднего размера белки между 14-200 кДа, в то время как МЧС Running Buffer решает мелкие белки молекулярной массой от 2-200 кДа с более низким рКа, что позволяет МЧС Запуск буфер работать быстрее, чем MOPS ^4. Таким образом, эти два буфера имеют контрастные эффекты на миграции ионов внутри концентрирующий гель, что приводит к различиям в разделении белковых полос ^4. Отложите и объединить 200 мл 1x МЧС или MOPS Бег буфера с 500 мкл антиоксидант, которые будут использоваться для заполнения буферной камеры верхний из Миня-Cell электрофорез блок.
3. Как только образцы закончены отопления, быстрые образцы спин до размещения их на льду.
4. Для сборки сборных бис-трис гелей в блок Мини-Cell для электрофореза следовать инструкциям производителя. Примечание: убедитесь, что каждый гель ориентированы таким образом, что чем короче (меньше) кассета каждого геля сталкивается внутрь к буфера ядра и гели уровень и плотно прижимают к буфера Ядра, чтобы избежать утечки из буферной камеры Верхний.
5. Заполните буферной камеры Верхний с 200 мл 1x МЧС или MOPS Запуск буфер, содержащий антиоксидант и буферной камеры Нижняя блока Мини-Cell с примерно 600 мл 1x МЧС или MOPS рабочем буфере. Лишние 200-300 мл рабочего буфера могут быть сохранены для последующего использования. Тем не менее, это не рекомендуется, чтобы переработать буфера, используемого в процессе электрофореза перспективе как рН и качество буфера могут быть изменены.
6. Загрузите 20 мкл каждого белка SAMPле в каждую лунку. Если секционирования мембрану в различных полос для того, чтобы исследовать для нескольких антител (т.е. более чем в 2), то настоятельно рекомендуется загрузить 2-5 мкл в предварительно окрашенный стандарт белка в первой и последней лунки каждого геля, поскольку это будет служить резки направляющие для разделения различных секций мембраны, не влияя на съемку белковых полос.
7. Запуск гели при 200 V постоянной в течение 35 мин с ожидаемым током 110-125 мА / гель в начале и 70-80 мА на гель в конце. Электрофорез завершается, когда отслеживания краситель мигрирует к платиновой проволоки вдоль буфера Core.

3. Белок перевод по системе iBlot Dry блоттинга

1. Полностью отделить мини-гели, ломая облигационных стороны кассеты (это может привести к треск). Откажитесь от более короткий (меньше) тарелку и аккуратно поместите гель от длительного (щелевой) пластины в контейнер с деионизированной водой иудалить толстую ногой часть геля, расположенной в нижней части. Примечание: в редких случаях, гель может приложить к короткой пластины вместо более длинного, щелевые плиты. В этом случае отбросить дольше, щелевой пластины и удалить толстую ногой часть геля, расположенной в нижней части. Затем осторожно переносить гель с более короткой пластины в деионизированной воде.
2. Соберите анода и катода стеки передачи в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: как нитроцеллюлозные или PVDF мембраны обеспечивают высокое качество и эффективную передачу белков и совместимы с флуоресцентной детекции ^8. Тем не менее, PVDF мембраны имеет более высокую связывающую способность (240 мкг / см ^3), чем нитроцеллюлозы ⁸ (200 мкг / см ^3).
3. Осторожно удалите пузырьки или воздух, находящийся между гелем и мембраны, так как это предотвратит искажение белковых полос во время передачи. Примечание: не обрезать мембрану или Transfэ стек для приспособления вашего размера гель так как это вызовет прямой контакт между анодной и катодной стеков.
4. После правильного сборки передачи стеки на сухом промокательной устройства, выберите соответствующую программу напряжения (т.е. Программа 3: 20 В течение 7 минут) и начать передачу. Примечание: белки больше, чем 150 кДа, как правило, мигрируют медленнее, и может потребоваться более длительное время передачи данных 8-10 мин. Кроме того, до инкубации гель в 20% этаноле в течение 5-10 мин будет также способствовать повышению эффективности передачи этих крупных белков. После того как программа передача завершена, устройство автоматически выключается ток. Лучше всего сразу же удалить мембрану и продолжить процедуру блокировки для обеспечения лучшей обнаружение белка и избежать высыхания мембраны.

4. Инфракрасный Обнаружение флуоресцентный белок

1. Блок мембраны (ы) в минимальном количестве 0,8 мл / см ² Одиссея блокирующего буфера (не добавляйте Твин-20) в течение 1 часа илив течение ночи при 4 ° C. Мембрана (ы) также может быть заблокирован с обезжиренного сухого молока, однако это может привести к более высокий фон и мешают обнаружению белка.
2. Инкубируйте мембраны (ы) в первичных антител в желаемой концентрации в блокирующем буфере Одиссее с 0,1% Твин-20 в течение ночи при 4 ° С. Для обнаружения двухцветной, в которой два различных антигенов отображаются на тот же блот, две первичные антитела должны быть получены из различных видов хозяев и добавлены одновременно к мембране (ов). Примечание: перед инкубацией мембраны (ы) в первичных антител, мембрана (ы) можно разделить на различные части, чтобы зонд для множественных антител (т.е. более чем 2) на той же самой мембраны.
3. Промыть мембрана (ы) 3 раза в течение 10 мин в TBS плюс 0,1% Tween-20 при осторожном встряхивании.
4. Инкубируйте мембраны (ы) с флуоресцентно-меченого вторичного антитела при разведении 1:20000 для канала 700 нм и 1:6,000-1:10,000 для канала 800 нм в Odysséу блокирующего буфера с 0,1% Твин-20 в течение 30-60 мин (инкубации мембрану (ы) в течение более 1 часа может увеличить фона). Защитите мембрану (ы) от света. Примечание: вторичные антитела должны быть получены из одних и тех же видов хозяев как каждый из первичных антител и помечены с различными флуорофоров.
5. Промыть мембрана (ы) 3 раза в течение 10 мин в TBS плюс 0,1% Tween-20 при осторожном встряхивании. Защитите мембрану (ы) от света.
6. Мембрана (ы) может быть высушен или храниться в любом TBS или PBS без Tween-20 при 4 ° С, пока не отсканированы и отображаемого с Imaging System Инфракрасный. Флуоресцентного сигнала будет оставаться стабильной в течение нескольких месяцев, если надлежащим образом защищены от света.

Результаты

Двухцветный инфракрасный флуоресцентный обнаруживает как сильные и слабые полосы на той же мембране с повышенной чувствительностью и высоким отношением сигнал-шум для получения четких вестерн-блот изображения. Типичные результаты, полученные с помощью двухцветного обнаружения вес?...

Обсуждение

Критические шаги в создании высокого качества, количественные вестерн-блот в соответствии с этим протоколом, являются следующие: 1) измерение концентрации белка; 2) подготовка образца; 3) блокирующий мембрану и, 4) качество и калибр первичного антитела.

Точность измерения ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A