Le plus rapide de l'Ouest dans la ville: une touche contemporaine sur l'analyse classique western blot

Résumé

Ce protocole explore les dernières avancées dans l'exécution des analyses Western blot. Ces nouvelles modifications utilisent un système de gel Bis-Tris avec une électrophorèse temps de fonctionnement de 35 min, un système de transfert de buvard sec 7 min, et la détection de la protéine fluorescente infrarouge et l'imagerie qui génère de plus haute résolution, la qualité, la sensibilité et l'amélioration de la précision des données occidentaux.

Résumé

Les techniques de Western blot qui ont été initialement établis dans les années 1970 sont encore utilisés activement aujourd'hui. Cependant, ce procédé traditionnel de transfert de Western présente plusieurs inconvénients qui comprennent une faible résolution de la qualité, les bandes parasites, diminution de la sensibilité, et l'intégrité de la protéine pauvre. Des progrès récents ont considérablement amélioré de nombreux aspects du protocole de Western blot standard pour produire des données qualitatives et quantitatives plus élevés. Le système de gel Bis-Tris, une alternative au système classique de Laemmli, génère une meilleure séparation et résolution de protéines, maintient l'intégrité de la protéine, et permet de réduire l'électrophorèse à un moment de l'exécution de 35 min. En outre, le système de blotting sec iBlot, améliore considérablement l'efficacité et la vitesse de transfert de la protéine à la membrane en 7 min, ce qui est en contraste avec les méthodes de transfert de protéines traditionnelles qui sont souvent moins efficace avec de longs temps de transfert. En combinaison avec ces modifications très innovants, des protéines détection en utilisant les résultats d'imagerie de fluorescence infrarouge dans de meilleure qualité, plus précis et des données cohérentes par rapport à la technique de Western blot niveau de chimioluminescence. Cette technologie permet de détecter simultanément deux antigènes différents sur la même membrane en utilisant deux couleurs des colorants proches de l'infrarouge qui sont visualisées dans les différents canaux fluorescents. En outre, la linéarité et la gamme dynamique de l'imagerie de fluorescence permet la quantification précise des bandes de protéines à la fois forts et faibles. Ainsi, ce protocole décrit les améliorations importantes de la méthode Western Blot classique, dans lequel ces avancées augmentent de manière significative la qualité des données, tout en réduisant considérablement le temps d'exécution de cette expérience.

Introduction

La technique de Western blot a été développé entre 1977 et 1979 afin de créer une meilleure méthode pour détecter des protéines en utilisant des anticorps ^1-3. Cette procédure utilise un transfert électrophorétique des protéines de membranes à partir de gels SDS-PAGE avec des protéines cibles visualisés en utilisant des anticorps secondaires et détectés par autoradiographie, la lumière UV, ou un produit de réaction de la peroxydase ^3. Ainsi, ces mêmes principes de base sont encore largement utilisés dans les protocoles de transfert de Western d'aujourd'hui. Cependant, cette technique de Western blot classique ne présentent de nombreux inconvénients, tels que la lenteur électrophorèse en exclusivité basse résolution et des bandes de protéines artificielles, sensibilité à la dégradation des protéines, et sensibilité limitée ainsi que la mauvaise qualité des données ^4. Par conséquent, ce protocole décrit les avancées et des améliorations significatives à la procédure de transfert de Western norme qui génère des données quantitatives et qualitatives plus précises.

"> Le système de Laemmli pour séparer une large gamme de protéines en utilisant SDS-PAGE est le système de gel le plus largement utilisé pour Western blot ^5. Malgré la popularité de ce système Western blot, cette méthode peut entraîner une distorsion de la bande, la perte de la résolution, et bandes parasites ^4. Ceci peut être une conséquence de la désamination et l'alkylation des protéines en raison du pH élevé (9,5) du gel de séparation, la réoxydation des liaisons disulfure réduites en raison de l'état d'oxydo-réduction variable du gel, et le clivage de l'aspartyl-prolyl des liaisons produites par le chauffage de la protéine dans du tampon de Laemmli (pH 5,2) ^4,6 peptidiques. Le système de gel Bis-Tris, qui fonctionne à un pH neutre (7,0), fournit des avantages significatifs par rapport au système Lamemmli. Ce système améliore la stabilité de la protéine, minimise modifications des protéines, maintient les protéines dans leur état ​​réduit, empêche aspartyl-prolyl clivage pendant l'électrophorèse, et plus important encore, le temps d'électrophorèse de fonctionner est de 35 min ^4,6,7. De plus, tsystème de gel es Bis-Tris produit également plus nettes bandes, une résolution plus élevée et la séparation, et une sensibilité accrue résultant des données plus fiables ^4.

En conjonction avec le système de gel Bis-Tris, le système buvard sec iBlot utilise la force de champ élevée et courants de réduire considérablement le temps de transfert des protéines à partir de gels sur des membranes dans 7 min ^8. Ce système de transfert est basée sur la méthode de buvardage à sec qui génère un transfert plus efficace et plus fiable des protéines ^8. Pour une comparaison détaillée de l'efficacité du système de transfert iBlot aux systèmes de transfert classiques s'il vous plaît consulter le site Web suivant: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Il utilise une anode et cathode pile, qui sont constituées d'une matrice de gel qui contient les tampons de transfert appropriées, qui agissent en tant que réservoirs d'ions ^8. Pendant le transfert, l'électrolyse de l'eau permet d'éviter la production d'oxygène à partir de l'anode en cuivre résultant en un transfert plus uniforme de la protéine sans provoquer de distorsion de la bande ^8. De plus, ce système de transfert augmente également la vitesse de transfert en réduisant la distance entre les électrodes ^8.

Bien chimiluminescence est la technique la plus commune et traditionnelle pour la détection de la protéine de transfert de Western analyses, deux couleurs infrarouge de détection fluorescente améliore considérablement la sensibilité, la qualité et l'exactitude des données de Western blot. Cette méthode de détection infrarouge utilise une excitation laser à deux longueurs d'onde optimales, 700 nmet 800 nm, pour générer une image claire de données avec le plus grand rapport signal sur bruit le plus élevé et la sensibilité ^9. Ainsi, les deux protéines cibles peuvent être visualisées simultanément sur la même membrane à l'aide de 700 nm et 800 nm fluorescentes canaux de détection. Plus important encore, la linéarité et la gamme dynamique de la fluorescence infrarouge permet une analyse quantitative précise de bandes de protéines à la fois forts et faibles ^9. En outre, ce protocole offre des avantages énormes et des améliorations sur la technique du Western blot classique en diminuant la électrophorèse et les temps de transfert de cette expérience sans compromettre l'efficacité de ces processus et en utilisant la détection infrarouge de la protéine fluorescente à produire plus de données de Western blot qualitatives et quantitatives.

Protocole

Une. Préparation des lysats cellulaires de culture cellulaire

1. Placez des boîtes de culture de cellules sur la glace et ajouter du PBS froid avec 5 mM d'EDTA (de par exemple 5 ml de PBS avec 5 mM EDTA/10 cm ² plaque). Éliminer les cellules adhérentes de la boîte à l'aide d'un grattoir à cellules et ensuite transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml conique froid.
2. Pellet les suspensions cellulaires par centrifugation à basse vitesse à 1000 rpm (230 x g) pendant 5 min à 4 ° C. Placez tubes coniques sur la glace et aspirer délicatement le surnageant sans perturber le culot.
3. Laver le culot avec 1 ml de PBS avec de l'EDTA 5 mM et transférer la suspension de cellules à 1,5 ml d'un tube de centrifugation à froid. Suspension de spin rapide à 13000 rpm (13 226 xg) pendant 10 secondes pour sédimenter les cellules. Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot et place des tubes sur la glace.
4. Reprendre le culot dans 25 à 200 ul (en fonction de la taille de la pastille, c'est-à 3 x 10 ⁶ cellules ~ ajouter 150 ul de tampon RIPA) enUn tampon RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, NaF 10 mM, SDS à 0,1%, désoxycholate de sodium à 0,5%, 1% de NP-40) contenant la protéase fraîchement ajoutée et les inhibiteurs de la phosphatase à une concentration finale 2x. En bref vortex chaque tube et incuber la suspension pendant 20-30 min sur la glace. Remarque: il existe plusieurs tampons de lyse qui peuvent être utilisés pour extraire les protéines, qui diffèrent dans leur capacité à solubiliser les protéines et leur force de détergent dénaturant (SDS-dire, le Triton X-100, ou de NP-40). Tampon RIPA est utile pour préparer des lysats de cellules entières et de perturber les interactions protéine-protéine.
5. Pour créer une fraction post-nucléaire, lysats de centrifugation à 14000 rpm (15 339 xg) pendant 5 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube sans perturber le culot et place des tubes nucléaires enrichi sur la glace. Remarque: le culot nucléaire enrichi peut également détacher du tube lors de l'extraction du surnageant. Pour éviter de recueillir le culot nucléaire enrichi, placez le bout de la pipette directement into le culot nucléaire enrichi visqueux et dessiner avec la pipette afin d'en disposer.
6. Déterminer les concentrations en protéine de chaque échantillon, conformément aux instructions du fabricant en utilisant de tels essais de quantification en tant que protéine BCA ou Bradford.

2. Préparation des échantillons et électrophorèse

1. Préparer chaque échantillon selon le tableau suivant décrit ci-dessous. Comme une alternative, β-mercaptoéthanol peut également être utilisé à une concentration finale de 2,5%. Cependant, l'agent réducteur doit être ajouté à chaque échantillon jusqu'à une heure avant le chargement du gel. Les comptes de volume total des variations de pipetage avec seulement 20 ul de chaque échantillon préparé chargés par puits.

   REACTIF	Échantillon réduit
   Protéine échantillon	X ul
   4x LDS tampon d'échantillon	6 pi
   500 nM TNT RougeAgent ucing	2,4 pl
   Eau désionisée	Jusqu'à 15,6 pi
   Volume total	24 pi

2. Des échantillons de la chaleur à 70 ° C pendant 10 min. Bien que les échantillons sont le chauffage, préparer 1000 ml de MES ou MOPS 1x tampon de course (50 ml 20x MES ou MOPS cours tampon plus de 950 ml d'eau déminéralisée). Tampon MOPS course décide protéines de taille moyenne entre 14-200 kDa, alors que MES cours Tampon décide protéines de petit poids moléculaire entre 2-200 kDa avec un pKa inférieur, ce qui permet aux MES Courir tampon de courir plus vite que les MOPS ^4. Ainsi, ces deux mémoires tampon sont contrastés effets sur la migration des ions à l'intérieur du gel d'empilement qui conduit à des différences dans la séparation des bandes de protéines ^4. Mettez de côté et de combiner 200 ml de MES 1x ou MOPS cours tampon avec 500 pi de Antioxydant, qui seront utilisés pour remplir la Chambre haute du mini tamponunité d'électrophorèse i-Cell.
3. Une fois les échantillons chauffage, des échantillons de spin rapides finis avant de les placer sur la glace.
4. Pour le montage des gels Bis-Tris préfabriqués dans l'unité Mini-Cell pour l'électrophorèse de suivre les instructions du fabricant. Remarque: assurez-vous que chaque gel est orienté de telle façon que le plus court (plus petit) Cassette de chaque gel tournée vers l'intérieur vers le tampon de base et les gels sont de niveau et bien appuyé contre le tampon de base pour éviter les fuites de la Chambre haute du tampon.
5. Remplissez la Haute Chambre tampon avec les 200 ml de MES ou MOPS cours Buffer contenant l'antioxydant et la Chambre Basse tampon de l'unité Mini-portable avec environ 600 ml de MES ou MOPS cours tampon 1x 1x. Les supplémentaires 200-300 ml de tampon de migration peuvent être sauvegardés pour une utilisation ultérieure. Cependant, il n'est pas recommandé de recycler le tampon utilisé au cours de l'exécution de l'électrophorèse selon le pH et la qualité de la mémoire tampon peuvent être modifiés.
6. Charger 20 pi de chaque samp des protéinesle dans chaque puits. Si la coupe de la membrane dans différentes bandes afin de sonder pour plusieurs anticorps (soit plus de 2), il est fortement recommandé de charger 2-5 pi de la protéine de référence Prestained dans les premier et dernier puits de chaque gel comme cela servira des guides de coupe pour séparer les différentes sections de la membrane sans affecter la formation d'image des bandes de protéines.
7. Gels fonctionner à 200 V constante pendant 35 min avec un courant attendu de 110 à 125 mA / gel au début et 70 à 80 mA par gel à la fin. L'électrophorèse est terminée lorsque le colorant de suivi migre vers le fil de platine le long de la tranche de base.

3. Protéine de transfert Utilisation du système Blot iBlot sec

1. Séparer complètement les mini-gels en brisant les côtés collés de la cassette (cela peut produire un bruit de crépitement). Jeter la (petite) plaque courte et transférer soigneusement le gel de la plus longue (fendue) plaque dans un récipient avec de l'eau déminéralisée etenlever la partie épaisse pieds du gel situé au fond. Remarque: sur de rares cas, le gel peut fixer à la plaque inférieure, au lieu de la plus fendue plaque. Dans ce cas, jetez le, plaque fendue plus et retirer la partie épaisse pieds du gel situé au fond. Ensuite, transférer soigneusement le gel de la plaque inférieure à l'eau déminéralisée.
2. Assembler les anodes et de cathodes de piles de transfert selon les instructions du fabricant. Remarque: les deux nitrocellulose ou PVDF membranes assurent un transfert de haute qualité et efficace de protéines et sont compatibles avec la détection par fluorescence ^8. Cependant, la membrane de PVDF a une capacité de liaison plus élevée (240 ug / cm ³⁾ de la nitrocellulose (200 ug / cm ^{3) 8.}
3. Retirer délicatement les bulles ou l'air emprisonné entre le gel et la membrane comme cela va éviter toute distorsion des bandes de protéines pendant le transfert. Remarque: ne pas couper la membrane ou le transfer empiler pour s'adapter à la taille de votre gel au risque de provoquer un contact direct entre les anodes et de cathodes des piles.
4. Après bien assembler les piles de transfert sur ​​le dispositif de buvard sec, sélectionnez le programme de tension appropriée (c.-à-programme 3: 20 V pour 7 min) et commencer le transfert. Remarque: les protéines de plus de 150 kDa ont tendance migrer plus lentement et peuvent nécessiter un temps de transfert plus long de 8 à 10 min. En outre, l'incubation préalable du gel dans de l'éthanol 20% pendant 5-10 min contribuera également à améliorer l'efficacité du transfert de ces grandes protéines. Une fois le programme de transfert est terminé, l'appareil s'éteint automatiquement le courant. Il est préférable de retirer immédiatement la membrane et de procéder à la procédure de blocage pour assurer une meilleure détection de protéines et éviter le dessèchement de la membrane.

4. Infrarouge de détection de la protéine fluorescente

1. membrane (s) de bloc en un minimum de 0,8 ml / cm ² de tampon de blocage Odyssey (Ne pas ajouter de Tween-20) pendant 1 heure oupendant une nuit à 4 ° C. Membrane (s) peut également être bloquée avec du lait écrémé en poudre, mais cela peut provoquer fond supérieur et interférer avec la détection de la protéine.
2. Incuber la membrane (s) dans l'anticorps primaire à la concentration désirée en tampon de blocage Odyssey avec 0,1% de Tween-20 pendant une nuit à 4 ° C. Pour la détection de deux couleurs, dans lequel deux antigènes différents sont visualisés sur le même blot, les deux anticorps primaires doivent être dérivées de différentes espèces hôtes et ajoutés simultanément à la membrane (s). Remarque: avant l'incubation de la membrane (s) dans l'anticorps primaire, la membrane (s) peut être sectionné en plusieurs morceaux afin de sonder pour plusieurs anticorps (soit plus de 2) sur la même membrane.
3. Laver les membrane (s) 3x pendant 10 min dans du TBS plus 0,1% de Tween-20 avec agitation douce.
4. Incuber la membrane (s) avec les anticorps secondaires marqués par fluorescence à une dilution de 1:20.000 pour le canal 700 nm et 1:6,000-1:10,000 pour le canal 800 nm dans Odyssey tampon de blocage avec 0,1% de Tween-20 pendant 30 à 60 min (en incubant la membrane (s) pendant plus d'une heure peut augmenter arrière-plan). Protéger la membrane (s) de la lumière. Remarque: les anticorps secondaires doivent être dérivée de la même espèce hôte que chacun des anticorps primaire et marqué avec des fluorophores différents.
5. Laver les membrane (s) 3x pendant 10 min dans du TBS plus 0,1% de Tween-20 avec agitation douce. Protéger la membrane (s) de la lumière.
6. Membrane (s) peut être séché ou conservé dans du PBS soit TBS ou sans Tween-20 à 4 ° C jusqu'à ce que numérisée et imagé avec un système d'imagerie infrarouge. Signal fluorescent reste stable pendant plusieurs mois si elle est bien protégée de la lumière.

Résultats

Deux couleurs de fluorescence infrarouge détecte les bandes à la fois forts et faibles sur la même membrane avec une sensibilité accrue et le meilleur rapport signal-sur-bruit pour produire des images claires Western blot. Des résultats typiques générés par la détection de transfert de Western de deux couleurs visualisées à la fois dans les 700 nm et 800 nm canaux fluorescents sont illustrés sur les figures 1 et 2. Le Western blot supérieure de la figure 1 ...

Discussion

Les étapes essentielles de la génération de haute qualité, des taches quantitatives occidentaux selon ce protocole sont les suivants: 1) la mesure des concentrations de protéines, 2) la préparation des échantillons, 3) le blocage de la membrane et 4) la qualité et le calibre de l'anticorps primaire.

La précision de la mesure des concentrations de protéines totales peut avoir un impact majeur sur la quantification des bandes de protéines car la sensibilité exceptionnelle de d?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A