JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا العمل طريقة جديدة لاستهداف انتقائي العضيات التحت خلوية في النباتات، ويعاير باستخدام BIORAD جين غون.

Abstract

من أجل استهداف بروتين واحد لالعضيات التحت خلوية متعددة، النباتات عادة تكرار الجينات ذات الصلة، والتعبير عن كل جينة على حدة باستخدام استراتيجيات التنظيمية المعقدة بما في ذلك الفرق المروجين و / أو متواليات إشارة. وتواجه المهندسين وعلماء الأحياء الاصطناعية الأيض المهتمين في استهداف الإنزيمات إلى عضية خاص مع التحدي: للحصول على البروتين الذي هو أن تكون مترجمة إلى عضية أكثر من واحد، ويجب على مهندس استنساخ نفس الجين عدة مرات. ويعرض هذا العمل حل لهذه الاستراتيجية: تسخير الربط البديلة للمرنا. هذه التكنولوجيا يستفيد من اليخضور وأنشأت بيروكسية استهداف تسلسل ويجمع بينهما في مرنا واحد هو أن تقسم بدلا من ذلك. يتم إرسال بعض المتغيرات لصق إلى بلاستيدات الخضراء، وبعض إلى بيروكسية، وبعض إلى العصارة الخلوية. هنا تم تصميم هذا النظام لاستهداف متعدد عضية مع الربط البديلة. في هذا العمل، وكان من المتوقع أن تكون EXPR GFPessed في بلاستيدات الخضراء، العصارة الخلوية، وبيروكسية من خلال سلسلة من تصميم بعقلانية 5 'مرنا به. هذه العلامات لديها القدرة على تقليل كمية الاستنساخ المطلوبة عند تحتاج إلى أن تتجلى في العضيات التحت خلوية متعددة الجينات مغاير. تم تصميم البناءات في العمل السابق 11، وكانت المستنسخة باستخدام جيبسون التجمع، وربط الأسلوب مستقلة الاستنساخ التي لا تتطلب الإنزيمات قيود. أدخلت البلازميدات الناتجة في نيكوتيانا benthamiana خلايا البشرة ورقة مع بروتوكول تعديل الجينات بندقية. أخيرا، لوحظت الأوراق تتحول مع المجهري متحد البؤر.

Introduction

هذا العمل هو مشروع الهندسة / البيولوجيا التركيبية التمثيل الغذائي حيث صممت الخلايا النباتية للتعبير عن البروتين مراسل في العضيات متعددة ولكن فقط مع بناء الحمض النووي واحد.

نهج واحد لاستهداف البروتينات لأكثر من موقع واحد ينطوي على استنساخ نسخ جينية متعددة، كل منها يحتوي على الببتيد توطين مختلفة. يجب إدخال كل نسخة قبل إعادة تحويل المتعاقبة، أو بدلا من ذلك، من خلال backcrossing التحويلات واحدة 1. وهذا ينطوي على الاستنساخ إضافية، ويقتصر تلو الآخر علامة التعريب في محطة.

طريقة أخرى لتوطين البروتين إلى مواقع متعددة من خلال الربط البديلة 2-5. وكتب الحمض النووي الريبي من جين واحد، ولكن يتم معالجتها نسخ مختلفة من النص بشكل مختلف، وغالبا في أكثر من طريقة واحدة لكل خلية. هذا يمكن أن يؤدي في أكثر من الحمض النووي الريبي رسول في الخلية نسخها من جين واحد. هذه MESSENGE مختلفةيمكن الرنا ص ترميز لالإسوية مختلفة من نفس البروتين، أو في حالة وجود انزياح الإطار، وهو بروتين مختلفة تماما. على الرغم من أن وصفت الربط البديلة في الأدب لسنوات عديدة، وفقط يتم توضيح آليات العمل والجهات المانحة الحفظ ولصق مواقع مستقبلات مؤخرا 6. كما ويجري وصف هذه المواقع على نحو أفضل، فإنها تفتح فرصا للهندسة.

وتواجه المهندسين الأيض النباتية مع التحدي عند التعبير عن بروتين في العضيات متعددة. لبروتين الذي هو أن تكون مترجمة إلى عضية أكثر من واحد، ويجب على مهندس استنساخ نفس الجين عدة مرات، مع كل تسلسل إشارة منفصلة توجيهها إلى عضية من الفائدة. لجين واحد في ثلاثة العضيات، وهذا هو ببساطة ثلاثة جينات. ولكن لالأيضية مسار ستة الجينات، وهذا يوسع إلى 18 الجينات، وهو جهد كبير الاستنساخ. الجمع بين متواليات توطين متعددة في، علامة جين واحد تقسم بدلا من ذلك،ificantly يقلل من هذا الجهد. على سبيل المثال، إعادة هندسة التنفس الضوئي والتوليف isoprenoid 7،8 9،10 تشمل كلا من البلاستيدات الخضراء وperoxisomes. في حالتنا نحن استغل مواقع لصق كما لوحظ في نظام thaliana نبات الأرابيدوبسيس الطبيعية الموصوفة سابقا 6. نحن أعيد تصميمه بعقلانية تسلسل مرنا مغادرة مواقع لصق الطبيعية وحدها، ولكن وضعت تسلسل التي من شأنها أن ترميز-بلاستيدات الخضراء أو العلامات التي تستهدف بيروكسية ضمن الإنترونات تقسم بدلا من ذلك (الشكل 1). البروتين المعبر عنه قد أو قد لا يكون علامة، اعتمادا على ما إذا كان رفعه ما قبل مرنا أن المشفرة على أنها إنترون (أرقام 1G و1H). لمزيد من المعلومات حول تصميم بنيات قدمت في هذا العمل، الرجاء مراجعة المقالة رفيق 11.

لأن هذا لا يزال هناك جهد كبير الاستنساخ، جيبسون التجمع، طريقة جديدة لاستنساخ بنيات الحمض النووي، هو شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في البناء. طريقة جيبسون يمكن استخدامها لأي تسلسل، بغض النظر عن المواقع تقييد (الشكل 2) 12-14. مزيج محددة من الانزيمات يسمح لخطوة واحدة، والتجمع متساوي الحرارة. في هذه الطريقة، فقد تم تصميم عدة أجزاء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل خطي بحيث يكون تسلسل تداخل ~ 50 نقطة. جيبسون التجمع مزيج إنزيم يساعد على هضم جزئيا أجزاء الحمض النووي الخطية، وفضح خيوط واحدة من متواليات مثلي. وهذه التسلسلات واحد الذين تقطعت بهم السبل جزئية إعادة صلب في خليط التفاعل، مما أدى إلى، خطوة واحدة، تسلسل مستقلة، خالية من ربط رد فعل subcloning السريع.

يصف هذا العمل 1) تصميم عقلاني يبني تقسم بدلا من ذلك للتعبير في البلاستيدات الخضراء النباتية، peroxisomes، وcytosols، 2) الاستنساخ باستخدام طريقة خالية من ربط جديدة من جيبسون التجمع، 3) إيصالها إلى خلايا نبات التبغ مع جين غون، و 4) النتائج التي تظهر استهداف عضية، كما لوحظ مع GFPومتحد البؤر المجهري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تصميم متواليات تقسم بدلا من ذلك لاستهداف متعددة العضيم

  1. تحديد المواقع للتعبير البروتين النهائي. لهذا العمل، وتكون الفائدة في استهداف بلاستيدات الخضراء، بيروكسية، والعصارة الخلوية.
  2. استخدام الأدب لتحديد البروتين والحمض النووي المعروف تسلسل لاستهداف البروتينات لعضيات من الفائدة. في هذه الحالة تستهدف بلاستيدات الخضراء تسلسل من نبات الأرابيدوبسيس thaliana-L isoaspartate ناقلة الميثيل 6،15، وكانوا مصممين على بيروكسية استهداف تسلسل من نبات الأرابيدوبسيس thaliana مثل transthyretin S-آلانتوين سينسيز 16،17.
  3. تحديد نظام الربط البديلة، التي ينبغي أن تستهدف البروتينات التي تهم العضيات الصحيح. لهذا العمل، لصق المواقع كما لوحظ في نظام نبات الأرابيدوبسيس الطبيعية 6. وأعيد تصميم تسلسل مرنا مغادرة مواقع لصق الطبيعية، ولكن وضعت متواليات ترميز بلاستيدات الخضراء أو peroxisبه ضمن الإنترونات تقسم بدلا من ذلك (الشكل 1) لى بعد استهداف.

2. الجمعية جيبسون من أجزاء الحمض النووي

انظر أيضا الشكل 2.

يعتمد أسلوب التجميع جيبسون على عمل العديد من الأنزيمات في مزيج مسبقة الصنع ل1) هضم جزئيا نهايات مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي لجعل خيوط واحد و 2) يصلب أزواج قاعدة مجانية من أجزاء الحمض النووي المجاورة. وهذا يسمح لاستنساخ شظايا الحمض النووي من دون قيود من المواقع قيود.

  1. اختيار أمر لعناصر في بناء الحمض النووي البلازميد. كمثال TriTag-1 لديه عناصر: أ) ناقل البلازميد (المسام، وتحتوي على بناء GFP معروفة للعمل في المصانع، علامة المقاومة الكانامايسين، وأصول النسخ المتماثل لكولاي والأجرعية المورمة المضيفين)، ب) تسلسل المروج، (P ENTCUP2، أظهرت أن تكون التأسيسي في النباتات)، ج) بلاستيدات الخضراء استهداف تسلسل (CTS)، ج) بيروكسية استهداف تسلسل (PTS)، ود) سلسلة من المواقع لصق كما هو موضح سابقا 6.
  2. تصميم قاعدة للقاعدة في بناء مع سيليكون وتصميم البرمجيات. القرد هو مفتوح المصدر حزمة مجانية مفيدة لهذا العمل.
    ملاحظة: TriTag-1، لديه من أجل: ناقلات البلازميد، والمروج، ATG، موقع لصق المانحة، تسلسل الهدف بلاستيدات الخضراء، موقع المانحة لصق، موقع محايد، وصلة الموقع متقبل، تسلسل الهدف بيروكسية، لصق موقع متقبل، على النحو الوارد في GFP البلازميد ناقلات .
    1. تصميم سيليكون في بناء الحمض النووي بحيث هناك تداخلا 50-BP بين كل قطعة عند الطلب الاشعال لPCR. فمن الممكن استخدام التداخل 50 نقطة أساس كما الاشعال: 25 نقطة كل اتجاه.
      1. ومن المؤكد أن تتبع أصل كل القطع التسلسل. هو على النحو التالي: البلازميد التي يمكن زراعتها وminiprepped؛ تسلسل الخطية التي يمكن استخدامها كقالب PCR؛ أو تسلسل التي سوف تحتاج إلى أن يكونتوليفها تجاريا؟ العديد من الشركات تقدم خدمات منخفضة التكلفة توليف الحمض النووي لشظايا <500 سنة مضت. في هذه الحالة، TriTag نفسها هي 437 سنة مضت، لذا كان من المفيد لأجل ذلك تجاريا.
      2. فإن أفضل النتائج تأتي إذا كانت جميع أجزاء هي PCR تضخيم وتنقيته من الحمض النووي القالب بهم. علامة المقاومة هي مكان جيد لتقسيم هذا الحمض النووي الكبيرة إلى اثنين من القوالب الصغيرة التي هي أكثر سهولة PCR تضخيمها.
      3. انزيم التقييد تقييد DpnI يقطع الحمض النووي ميثليته. إذا كان القالب PCR لminiprep من E. القولونية، والعلاج DpnI إزالة الحمض النووي القالب تلويث.
  3. تنقية كل تسلسل الحمض النووي بشكل منفصل وأزل في الماء، أو TE العازلة EB.
    1. ناقلات المسام جزء 1، ~ 3،000 سنة مضت (الأسهم الخضراء). PCR تضخيمها وDpnI المعالجة.
    2. ناقلات المسام جزء 2، ~ 3،000 سنة مضت (الأسهم السوداء). PCR تضخيمها وDpnI المعالجة.
    3. TriTag إدراج، 437 سنة مضت (الأسهم الزرقاء). أمر تجاريا. Resuspend في DDH 2 O.
    4. P ENTCUP المروج، ~ 750 شركة بريتيش بتروليوم (الأسهم البرتقالية). PCR تضخيم وDpnI المعالجة.
  4. قياس تركيزات كل من قطع الحمض النووي. تهدف ل150 نانوغرام / ميكرولتر من القطع النواقل.
  5. اتخاذ قسامة من الجمعية مزيج جيبسون من الفريزر وذوبان الجليد على الجليد. هذا هو متاحة تجاريا، ولكن أيضا بسيطة لجعل في مختبر 12-14.
    1. هناك نوعان من الخطوات لهذه الوصفة: مزيج الرئيسي ل5X لزج و 15 ميكرولتر رد فعل بحجم مأخوذة 1.33x. مزيج الرئيسي 5X يحتوي على: 3 مل 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 300 ميكرولتر 1 M MgCl 2، 600 ميكرولتر 10 ملي من كل dNTP، 300 ميكرولتر 1 M DTT، 1.5 غرام PEG-8000، 20 ملغ NAD، وده 2 O إلى 6 مل. إعداد 320 ميكرولتر مأخوذة (18) وتجميد جميع ولكن واحدة في -20 درجة مئوية. فإن الحل يكون لزج جدا. تسمية هذه "5X الأيسوثرم العازلة"
    2. إلى واحد المتبقية (320 ميكرولتر)، إضافة 1.2 ميكرولتر T5 نوكلياز خارجية، و 20 ميكرولتر Phusion عالية من الاستثمارات الخارجية المباشرةelity البلمرة DNA، 160 ميكرولتر الحمض النووي طق يغاز و 700 ميكرولتر DDH 2 O. إعداد 15 ميكرولتر مأخوذة (~ 80) على الجليد في أنابيب PCR وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  6. تحديد وحدات التخزين لكميات متساوي المولية كل من شظايا. هناك عدد قليل من الآلات الحاسبة على الانترنت، بما في ذلك Gibthon.org. ينبغي أن يكون هناك ما مجموعه 5 ميكرولتر من كل قطعة الحمض النووي. إضافتها إلى ميكرولتر 15 جيبسون مزيج قسامة. إذا كان هذا يتطلب كميات صغيرة جدا لماصة، ويخفف من شظايا الحمض النووي و / أو استخدام قسامة أكثر من واحد.
    1. لا تنسى أن تعد السيطرة على الحمض النووي ناقلات وحدها (على سبيل المثال الجزء الحمض النووي الذي يحتوي على مقاومة المضادات الحيوية علامة) وجعل ما يصل حجم بالماء.
  7. احتضان الأنابيب في cycler الحرارية في 50-55 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة. استبدال على الجليد وتحول إلى E. القولونية عبر حرارة صدمة الخلايا المختصة كيميائيا. لا تستخدم الخلايا electrocompetent. تركيز الملح عالية وتركيز الحمض النووي منخفضة نسبياقد يسبب الخلايا لقوس.
    1. تطبيق كل ميكرولتر 20 إلى إعداد التجارية من 200 ميكرولتر الكالسيوم كلوريد المختصة E. القولونية.
      احتضان على الجليد 30 دقيقة و 60 ثانية صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية
    2. العودة إلى الجليد 2 دقيقة، وتطبيق 750 ميكرولتر SOC أو LB المتوسطة واستعادة تهتز في أنبوب microcentrifuge 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لوحة الخليط والتخفيفات المناسبة على LB + اساسه (أو غيرها من المضادات الحيوية المناسبة). وهذا قد يؤدي إلى ارتفاع الخلفية (وعدد أكبر من الأحداث إعادة التركيب غير المستهدفة) من الاستنساخ القائم على ربط التقليدية، ولكن الأمر يستحق أن يحجب حوالي 10 المستعمرات.
  8. تأكيد استنساخ عبر تسلسل وتخزين قسامة في -80 ° C

3. Biolistic ترنسفكأيشن من التبغ مع جين غون

هذا هو الاسلوب الذي أنشئ في إن الرب 18،19. يتم وصف الخطوات الرئيسية والاختلافات أدناه.

  1. تنمو 50-100 مل E. شاركلى أو 200 مل الأجرعية. ثقافة الإعدادية ماكسي. وهناك تركيز من حوالي 1،500 نانوغرام / ميكرولتر مطلوب للمتابعة.
  2. إعداد رصاصات بندقية الجينات كما هو موضح سابقا. تحميلها في جين غون.
  3. لترنسفكأيشن من نيكوتيانا benthamiana التبغ الأنسجة ورقة البشرة، واختيار ورقة كبيرة بالقرب من قاعدة النبات لمدة 3 أشهر من العمر. قطع عليه بعناية ووضعه الجانب الأسفل إلى الأعلى على مناشف ورقية مبللة في طبق بتري 15 سم.
  4. تعيين والضغط لجين غون إلى 200-250 رطل.
  5. تهدف بعناية جين غون بين أضلاعه على الجانب السفلي من ورقة، حوالي 3-5 سم فوق ذلك. الافراج عن السلامة وتسليم الجزيئات إلى ورقة. ويمكن استخدام كل رصاصة مرتين في نفس الموقع على ورقة. إذا كان ينفجر ورقة، وتجاهل بدء أوراق جديدة هناك بعض التباين في ورقة وصلابة بسبب ظروف النمو مثل العمر، والرطوبة وغيرها للحصول على 12 سم، وأوراق، ونتوقع أن تناسب حوالي 6 طلقات.
  6. تخزين ورقة، مع تغطية الجزء العلوي منطبق بتري لمدة 2-3 أيام في ضوء انخفاض على مقاعد البدلاء.
  7. دراسة ورقة في المجهر تشريح مجهزة مضان الأشعة فوق البنفسجية، والبحث عن الخلايا الفردية معربا عن GFP. تشريح 5-10 ملم أقسام ورقة.
  8. يغرق ورقة في شريحة المجهر بئر عميقة تحت ~ 200 ميكرولتر 0.1٪ تريتون X-100. المنظفات يساعد على منع فقاعات الهواء من تشكيل على السطح، وعميق شريحة المجهر بشكل جيد يسمح لمنطقة التصوير الأنسجة أكبر.

4. متحد البؤر المجهري لأنسجة Transfected

هذه التعليمات تختلف عن كل صك، ولذلك فمن الضروري الحصول على التدريب المناسب.

  1. للتجارب الكشف عن مضان، تعيين الليزر الإثارة إلى 489 نانومتر، وتعيين كشف مضخم إلى 500-569 نانومتر لمضان GFP و630-700 نانومتر لالكلوروفيل لصناعة السيارات في مضان. الصورة باستخدام الخلايا هدف المياه الغمر 40X.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كان جهد التصميم نتيجة لتخطيط كبير. رواية لهذا المشروع هو استخدام الربط بديلة لإنشاء ما قبل مرنا التي يتم ترجمتها إلى البروتينات وأعرب تفاضلي. يتم التعبير عن هذه البروتينات في العضيات المختلفة، في هذه الحالة بلاستيدات الخضراء، بيروكسية و / أو العصارة الخلوية. نحن تكي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الدراسة، تم وصفها استراتيجيات بسيطة لإضفاء الطابع المحلي على البروتين المعدلة وراثيا واحد لمقصورات الخلوية متعددة في النباتات. كان الهدف لتصميم بناء من شأنه أن التعبير عن جين واحد في عضية أكثر من واحد في نيكوتيانا benthamiana. وتشمل استراتيجيات التصميم الرشي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر جين شين من مستشفى ماساتشوستس العام للتبرع سخي من الشتلات نيكوتيانا benthamiana. ساعد جين بوش لنا إلى حد كبير في تقديم المشورة في زراعة النباتات وإنشاء منطقة غرفة النمو. عرضت توم فيرانتي من معهد ويس مساعدة حاسمة مع المجهري متحد البؤر. فإن الكتاب أود أن أشكر بصفة خاصة دون انجبير من مستشفى بوسطن للأطفال ومعهد لويس التبرع السخي من جين غون واللوازم المرتبطة بها. وقدمت التمويل لهذا المشروع من خلال اتفاقية تعاون مع وزارة الطاقة وكالة مشاريع البحوث المتقدمة (ARPA-E جائزة # DE-000079) لنظام تقييم الأداء، JCW، وأطباء العالم، ومن خلال Chimerion التكنولوجيا الحيوية، وشركة لMJV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Oligonucleotide primersIDT(custom)Design specifically for construct
GeneBlocksIDT(custom)500 bp oligonucleotides
ApE softwareU Utah(download)http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kitQiagen28004Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kitQiagen27104Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC BufferNEBM0532SUsed to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mixNEBE2611LMaster mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5TeknovaT1075Gibson assembly mix
1 M MgCl2G Biosiences82023-086Gibson assembly mix
dNTP mixFermentasR0192Gibson assembly mix
1 M DTTFermentasR0861Gibson assembly mix
PEG-8000Affymetrix19966Gibson assembly mix
NADApplichemA1124,0005Gibson assembly mix
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111KGibson assembly mix
Phusion polymeraseNEBF530SGibson assembly mix
Taq DNA ligaseNEBM0208LGibson assembly mix
Gibthon.orgWebsite to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kitQiagen12963Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun systemBioRad165-2451Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana(n/a)(n/a)Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscopeLeicaSP5 X MPImaging of resultant cells
Deep well slidesElectron Microscopy Sciences71561-01Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculatorhttp://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

References

  1. Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
  2. Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
  3. Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
  4. Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
  5. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
  6. Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
  7. Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
  8. Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
  9. Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
  10. Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
  11. Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
  12. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  13. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
  14. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  15. Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
  16. Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
  17. Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
  18. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  19. Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
  20. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

86 RNA benthamiana

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved