Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun.

Zusammenfassung

Um ein einzelnes Protein, mehrere subzelluläre Organellen Ziel, Pflanzen in der Regel duplizieren die relevanten Genen und Express jedes Gen einzeln mit Hilfe komplexer Regulierungsstrategien einschließlich Differentialpromotoren und / oder Signalsequenzen. Metabolische Ingenieure und synthetische Biologen interessiert Zielenzyme zu einer bestimmten Organelle mit einer Herausforderung: ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mehrfach klonen. Diese Arbeit stellt eine Lösung für diese Strategie: Nutzung alternatives Spleißen der mRNA. Diese Technologie nutzt die Vorteile der etablierten Chloroplasten und Peroxisomen-Targeting-Sequenzen und kombiniert sie zu einem einzigen mRNA, die alternativ gespleißt wird. Einige Splice-Varianten sind mit der Chloroplasten geschickt, um einige der Peroxisomen, und einige in das Cytosol. Hier wird das System für mehrere Targeting-Organellen mit alternativem Spleißen ausgebildet. In dieser Arbeit wurde GFP erwartet werden exprEssed in den Chloroplasten, Cytosol und Peroxisomen durch eine Reihe von rational entworfenen 5 'mRNA-Tags. Diese Tags haben das Potential, die Menge der Klonierung heterologer Gene erforderlich, wenn benötigt, in mehreren subzellulären Organellen ausgedrückt reduzieren. Die Konstrukte wurden in früheren Arbeiten ¹¹ ausgelegt und wurden mit Gibson Anordnung, eine Ligation unabhängigen Klonen Methode, die nicht Restriktionsenzyme erfordert geklont. Die resultierenden Plasmide wurden in Nicotiana benthamiana epidermale Blattzellen mit einem modifizierten Gene Gun-Protokoll eingeführt. Schließlich wurden umgewandelte Blätter mit der konfokalen Mikroskopie beobachtet.

Einleitung

Diese Arbeit ist eine Stoffwechseltechnik / synthetischen Biologie-Projekt, bei Pflanzenzellen werden ausgeführt, um ein Reporterprotein in mehreren Organellen ausdrücken, aber mit nur einem einzigen DNA-Konstrukt.

Ein Ansatz, um Proteine ​​an mehr als einem Ort gezielt beinhaltet Klonen mehrere genetische Kopien, die jeweils eine unterschiedliche Lokalisation Peptid. Jede Kopie muss durch sukzessive Rücktransformation eingeführt werden oder alternativ durch Rückkreuzung einzelnen Transformationen ^ein. Dies beinhaltet zusätzliche Klonen, und wird von einem Lokalisierungs Tag pro Terminus begrenzt.

Ein anderer Weg, um ein Protein zu mehreren Stellen lokalisiert ist, durch alternatives Splicing ^2-5. RNA wird aus einem einzigen Gen transkribiert werden, aber verschiedene Kopien des Transkripts sind unterschiedlich in mehr als einen Weg pro Zelle verarbeitet wird, häufig. Dies kann in mehr als einer Boten-RNA in der Zelle von einem einzigen Gen transkribiert führen. Diese unterschiedlichen messenger RNAs können für verschiedene Isoformen des gleichen Proteins in dem Fall einer Leserahmen, einem anderen Protein vollständig zu kodieren, oder. Obwohl alternative Spleißen ist in der Literatur seit vielen Jahren beschrieben worden ist, die Wirkmechanismen und Donor-und Rezeptor konservierten Spleißstellen werden zur Zeit nur in jüngerer ⁶ erläutert. Da diese Standorte werden besser beschrieben, eröffnen sie Chancen für den Maschinenbau.

Pflanzenstoffwechsel Ingenieure mit einer Herausforderung bei der Expression eines Proteins in mehreren Organellen konfrontiert. Ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mit einer separaten Signalsequenz an die Organellen von Interesse zu klonieren mehrere Male, jedes. Für ein einzelnes Gen in drei Organellen, ist dies nur drei Gene. Aber für einen Sechs Gen Stoffwechselweg erweitert dies auf 18 Gene eine signifikante Klonen Aufwand. Die Kombination mehrerer Lokalisationssequenzen in einem einzigen, alternativ gespleißte Gen Zeichenificantly reduziert diese Anstrengung. Zum Beispiel, Re-Engineering Photorespiration ^7,8 und ^9,10 isoprenoiden Synthese betrifft sowohl die Chloroplasten und Peroxisomen. In unserem Fall nutzten wir Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis thaliana beobachtet zuvor beschriebenen ^6. Wir rational gestaltete die mRNA-Sequenz, so dass die natürliche Spleißstellen allein, sondern platziert Sequenzen, die Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1) zu kodieren würde. Das exprimierte Protein kann oder kann nicht mit einem Tag, je nachdem, ob die prä-mRNA codiert, die es als ein Intron (Fig. 1g und 1h) ausgeschnitten. Für weitere Informationen über das Design der Konstrukte in dieser Arbeit vorgestellten, finden Sie im Artikel ¹¹ Begleiter.

Da dies immer noch eine signifikante Anstrengung Klonen, Gibson Anordnung, ein neues Verfahren zur Klonierung von DNA-Konstrukten, uim Aufbau sed. Gibson Verfahren kann für jede Sequenz verwendet werden, unabhängig von Restriktionsstellen (Fig. 2) ^12-14. Die spezifische Kombination von Enzymen erlaubt eine Ein-Schritt-, Isothermischer Zusammenbau. In diesem Verfahren werden mehrere doppelsträngige lineare DNA Teile ausgebildet sind, daß sie überlappende Sequenzen von ~ 50 bp. Die Gibson Montage Enzym-Mix teilweise verdaut die lineare DNA-Teile, Belichten Einzelstränge von homologen Sequenzen. Diese Teil einzelsträngigen Sequenzen erneut geglüht in der Reaktionsmischung, was zu einer schnellen, einem Schritt, sequenzunabhängige Ligation freien Subklonierung Reaktion.

Diese Arbeit beschreibt 1) rationale Design alternativ gespleißte Konstrukte für die Expression in Pflanzen Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol, 2), deren Klonierung mit dem neuen Ligation freie Methode von Gibson Montage, 3), deren Lieferung in Tabakblattzellen mit der Gene Gun und 4) Ergebnisse zeigen, Organellen-Targeting, als mit GFP beobachtetund konfokale Mikroskopie.

Protokoll

1. Entwurf von Alternativ-gespleißt Sequenzen für mehrere Organelle Targeting

1. Bestimmen Sie die Standorte für die endgültige Protein-Expression. Für diese Arbeit ist das Interesse an der Ausrichtung der Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol.
2. Verwenden Sie die Literatur, um Protein-und DNA-Sequenzen bekannt, dass Proteine, die Organellen von Interesse gezielt zu identifizieren. In diesem Fall wird ein Chloroplasten-Targeting-Sequenz aus Arabidopsis thaliana L-Methyltransferase isoaspartate ^6,15 und eine Peroxisomen-Zielsequenz aus Arabidopsis thaliana-Transthyretin wie S-Synthase Allantoin ^16,17 bestimmt.
3. Identifizieren Sie eine alternative Spleißen-Regime, die die Proteine ​​von Interesse für die richtige Zielorganellen sollten. Für diese Arbeit Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis ⁶ beobachtet. Die mRNA-Sequenz wurde neu gestaltet Verlassen der natürlichen Spleißstellen, sondern Sequenzen wurden Kodierung Chloroplasten-oder peroxis platziertome-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1).

2. Gibson Versammlung der DNA-Teile

Siehe auch Abbildung 2.

Die Gibson Montageverfahren ist abhängig von der Wirkung mehrerer Enzyme in einem vorgefertigten Mischung zu 1) teilweise verdauen die Enden des doppelsträngigen DNA-Einzelstränge auf und 2) Glühen kostenlose Basenpaare der benachbarten DNA-Teile. Dies ermöglicht die Klonierung der DNA-Fragmente ohne die Einschränkungen von Restriktionsstellen.

1. Wähle einen Auftrag für die Elemente in der DNA-Plasmid-Konstrukt. Als Beispiel TriTag-1 Elemente: a) einen Plasmidvektor (Poren, enthaltend ein GFP-Konstrukt bekannt, in Pflanzen, ein Kanamycin-Resistenz-Marker zu arbeiten, und Replikationsursprünge für E. coli und Agrobacterium tumefaciens Hosts), b) ein Promotor-Sequenz, (P _ENTCUP2 gezeigt konstitutiv zu sein in Pflanzen), C) einem Chloroplasten-Targeting-Sequenz (CTS), c) eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS), und d) eine Reihe von Spleißstellen wie zuvor ⁶ beschrieben.
2. Gestalten Sie das Konstrukt Basis-for-Basis mit in silico Design-Software. ApE ist ein Open-Source-Freeware-Paket, die für diese Arbeit.
   Hinweis: TriTag-1, hat die Reihenfolge: Plasmid-Vektor, einen Promotor, ATG, Splice-Donor-Stelle, Chloroplasten-Zielsequenz, Splice-Donor-Stelle, neutral, Spleiß-Akzeptor-Stelle, Peroxisomen-Zielsequenz, Splice-Akzeptor-Stelle, wie in GFP-Plasmid-Vektor enthalten ist .
   1. Entwerfen Sie die in silico DNA-Konstrukt, so dass eine 50-bp-Überlappung zwischen jedem Stück bei der Bestellung Primer für die PCR. Es ist möglich, die 50-bp-Überlappung als Primer verwendet: 25 bp in jeder Richtung.
      1. Achten Sie darauf, den Überblick über die Herkunft der einzelnen Stücke Reihenfolge halten. Ist es so: ein Plasmid gewachsen und miniprepped werden; eine lineare Sequenz, die als PCR-Matrize verwendet werden kann; oder eine Sequenz, die müssen seinkommerziell synthetisiert? Mehrere Firmen bieten Low-Cost-DNA-Synthese Dienstleistungen für Fragmente <500 bp. In diesem Fall wird die TriTag selbst ist 437 bp, so ist es vorteilhaft, sie kommerziell Ordnung.
      2. Die besten Ergebnisse werden kommen, wenn alle Fragmente mittels PCR amplifiziert und aus den Matrizen-DNA gereinigt. Die Resistenzmarker ist ein guter Ort, um dieses große DNA in zwei kleinere Vorlagen, die leichter sind PCR-amplifizierte teilen.
      3. Beschränkung Restriktionsenzym DpnI schneidet methylierte DNA. Wenn die PCR-Vorlage war ein Miniprep von E. coli, Dpnl Behandlung wird die Template-DNA kontaminiert entfernen.
3. Reinige alle DNA-Sequenzen getrennt und Elution in Wasser, TE-oder EB-Puffer.
   1. Poren Vektor-Teil 1, ~ 3000 bp (grüne Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt.
   2. Poren Vektor-Teil 2, ~ 3000 bp (schwarze Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt.
   3. TriTag Einsatz, 437 bp (blaue Pfeile). Handel bestellt. Resuspend in ddH ₂ O.
   4. P _{ENTCUP-Promotor,} ~ 750 bp (orange Pfeile). PCR-amplifiziert und DpnI behandelt.
4. Messung der Konzentrationen von jedem der DNA-Stücke. Ziel für 150 ng / ul der Vektor-Stücke.
5. Einen aliquoten der Gibson Montage-Mix aus dem Gefrierfach und tauen auf Eis. Dies ist im Handel erhältlich, sondern auch einfach zu machen im Labor ^14.12.
   1. Es gibt zwei Schritte, um dieses Rezept: eine viskose 5x Master-Mix und 15 ul Reaktions-Größe 1,33 x Aliquots. Der 5x Mastermix enthält: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 &mgr; l 1 M MgCl _2, 600 &mgr; l 10 mM von jedem dNTP, 300 &mgr; l 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD und ddH ₂ O 6 ml. Planen 320 ul Aliquots (18) und gefrier alle außer einer bei -20 ° C Die Lösung wird sehr viskos sein. Beschriften Sie diese "5X Isotherme Puffer"
   2. Zum einen verbleibenden (320 ul), fügen Sie 1,2 ul T5 Exonuclease, 20 ul Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, 160 ul Taq-DNA-Ligase und 700 ul ddH ₂ O. Bereiten Sie 15 ul Aliquots (~ 80) auf Eis in PCR-Röhrchen und bei -20 ° C
6. Bestimmen Volumina für äquimolare Mengen von jedem der Fragmente. Es gibt ein paar Online-Rechner, einschließlich Gibthon.org. Es sollten insgesamt 5 ul aller DNA-Stücke sein. Fügen Sie sie zu den 15 ul Aliquot Gibson mischen. Wenn dies erfordert Volumen zu klein, um Pipette verdünnen, die DNA-Fragmente und / oder mehr als einen aliquoten.
   1. Vergessen Sie nicht, eine Kontrolle der Vektor-DNA allein vorzubereiten (zB der DNA-Teil des Antibiotikaresistenz-Marker enthalten) und bis zur Marke mit Wasser.
7. Die Rohre in einem Thermocycler bei 50-55 ° C für 30-60 Minuten inkubiert. Ersetzen auf Eis und verwandeln sich in E. coli durch Hitzeschock chemisch kompetente Zellen. Verwenden Sie keine elektroZellen. Die hohe Salzkonzentration und der relativ niedrigen DNA-Konzentrationkann dazu führen, dass die Zellen Bogens.
   1. Wenden Sie alle 20 ul einer kommerziellen Herstellung von 200 ul Calciumchlorid-kompetenten E. coli.
      Inkubation auf Eis 30 min und 60 sec Hitzeschock bei 42 ° C
   2. Zurück zu Eis 2 min, gelten 750 ul SOC oder LB-Medium und erholen sich in einem Mikrozentrifugenröhrchen 30 min Schütteln bei 37 ° C Platte der Mischung und geeignete Verdünnungen auf LB + Kan (oder anderen geeigneten Antibiotikum). Dies kann zu höheren Hintergrund (und eine höhere Anzahl von Nicht-Ziel-Rekombination) als traditionelle Ligation-basierte Klonen führen, aber es lohnt sich, etwa 10 Kolonien zu screenen.
8. Bestätigen Sie mit Klon-Sequenz und speichern ein Aliquot bei -80 ° C

3. Biolistic Transfektion von Tabak mit der Gene Gun

Dies ist eine Technik, die in JoVE ^18,19 hergestellt wird. Schlüsselschritte und die Unterschiede werden unten beschrieben.

1. Wachsen 50-100 ml E. coLi oder 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep die Kultur. Eine Konzentration von etwa 1.500 ng / &mgr; l erforderlich, um fortzufahren.
2. Bereiten Gen Gewehrkugeln wie zuvor beschrieben. Legen Sie sie in die Gene Gun.
3. Für die Transfektion von Nicotiana benthamiana Tabakblatt epidermale Gewebe, wählen Sie ein großes Blatt in der Nähe der Basis eines 3 Monate alten Anlage. Sorgfältig schneiden Sie es und legen Sie es Unterseite nach oben auf nassen Papierhandtücher in einer 15 cm Petrischale.
4. Stellen Sie den Druck für die Er Gene Gun auf 200-250 psi.
5. Sorgfältig Ziel der Genkanone zwischen den Rippen auf der Unterseite eines Blattes, etwa 3-5 cm darüber. Lassen Sie die Sicherheit und liefern die Teilchen auf dem Blatt. Jede Kugel kann zweimal an der gleichen Stelle auf dem Blatt verwendet werden. Wenn die Blatt explodiert, verwerfen und beginnen ein neues Blatt-es gibt einige Varianz in Blatt Zähigkeit durch Wachstumsbedingungen wie Alter, Feuchtigkeit, etc. Für eine 12-cm-Blatt, erwarten, dass etwa 6 Aufnahmen passen.
6. Bewahren Sie die mit der Oberseite der eine überdachte Blatt,Petrischale für 2-3 Tage bei wenig Licht auf der Bank.
7. Untersuchen Sie das Blatt in einem Binokular mit UV-Fluoreszenz ausgestattet, und die Suche nach einzelnen Zellen, die GFP. Dissect 5-10 mm Abschnitte Blatt.
8. Tauchen Sie das Blatt in einem tiefen Brunnen Mikroskop-Objektträger unter ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Das Detergens verhindert Bildung von Luftblasen an der Oberfläche, und die Tiefbohrung Objektträger ermöglicht eine größere Gewebeabbildungsbereich.

4. Konfokale Mikroskopie transfizierter Tissue

Diese Anweisungen variieren für jedes Instrument, so ist es wichtig, gut ausgebildet zu werden.

1. Für die Fluoreszenzdetektion Experimente, stellen Sie die Anregungslaser bis 489 nm, und stellen Sie die Photomultiplier-Detektoren 500-569 nm für GFP-Fluoreszenz und 630-700 nm für Chlorophyll-Autofluoreszenz. Bild Zellen unter Verwendung eines 40x Wasserimmersionsobjektiv.

Ergebnisse

Der konstruktive Aufwand war eine Folge der erheblichen Planung. Neuartige an diesem Projekt ist der Einsatz von alternativen Spleißen, eine pre-mRNA, die in differentiell exprimierten Proteine ​​übersetzt wird, zu erstellen. Diese Proteine ​​werden in verschiedenen Organellen ausgedrückt, in diesem Fall die Chloroplasten, Peroxisomen und / oder Cytosol. Wir passten natürliche Arabidopsis-Gen, das alternativ gespleißte ist ⁶ und platziert bekannt Chloroplasten ⁶ und ¹⁷

Diskussion

In dieser Studie werden einfache Strategien zur Lokalisierung eines einzelnen transgenen Proteins mehrere Zellkompartimente in Pflanzen beschrieben. Das Ziel war, ein Konstrukt, das Gen in mehr als einer Organelle in Nicotiana benthamiana ausdrücken würde entwerfen. Strategien sind rationale Design von GFP-basierten DNA-Konstrukte, Gibson Montage, Lieferung der Plasmide zu Blattzellen mit der Gene Gun und Beobachtung der Ergebnisse mit der konfokalen Mikroskopie.

Drei verschiedene...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide primers	IDT	(custom)	Design specifically for construct
GeneBlocks	IDT	(custom)	500 bp oligonucleotides
ApE software	U Utah	(download)	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit	Qiagen	28004	Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27104	Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer	NEB	M0532S	Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix	NEB	E2611L	Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5	Teknova	T1075	Gibson assembly mix
1 M MgCl2	G Biosiences	82023-086	Gibson assembly mix
dNTP mix	Fermentas	R0192	Gibson assembly mix
1 M DTT	Fermentas	R0861	Gibson assembly mix
PEG-8000	Affymetrix	19966	Gibson assembly mix
NAD	Applichem	A1124,0005	Gibson assembly mix
T5 exonuclease	Epicentre	T5E4111K	Gibson assembly mix
Phusion polymerase	NEB	F530S	Gibson assembly mix
Taq DNA ligase	NEB	M0208L	Gibson assembly mix
Gibthon.org			Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit	Qiagen	12963	Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system	BioRad	165-2451	Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana	(n/a)	(n/a)	Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope	Leica	SP5 X MP	Imaging of resultant cells
Deep well slides	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE)	University of Utah		http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator			http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/