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要約

この作品は、選択的にバイオラッド遺伝子銃を用いてアッセイ、植物では細胞内小器官を標的化するための新しい方法を説明します。

要約

複数の細胞内小器官への単一のタンパク質を標的化するために、植物は典型的に関連性のある遺伝子を複製し、差動プロモーターおよび/またはシグナル配列を含む複雑な調節戦略を用いて別々に各遺伝子を発現する。メタボリックエンジニアや特定の細胞小器官に酵素を標的とすることに興味の合成生物学者は、チャレンジに直面している：複数の細胞小器官に局在していることがあるタンパク質のために、エンジニアは、同じ遺伝子を複数回複製しなければなりません。この作品は、この戦略に対する解決策を提示：mRNAの選択的スプライシングを利用する。この技術は確立された葉緑体およびペルオキシソーム標的化配列を利用して、選択的にスプライシングされた単一のmRNAにそれらを組み合わせたものです。いくつかのスプライスバリアントは、葉緑体、ペルオキシソームにいくつか、および細胞質ゾルへのいくつかに送信されます。ここで、システムは、複数のオルガネラが選択的スプライシングに標的化するために設計されている。本研究では、GFPは、exprがあると予想された合理的に設計された5 'のmRNA一連のタグによって葉緑体、細胞質ゾルおよびペルオキシソームでessed。これらのタグは、異種遺伝子は、複数の細胞内小器官で発現されることが必要なときに必要なクローニングの量を減少させる可能性を有する。構築物は、以前の研究11で設計し、ギブソン·アセンブリ、制限酵素を必要とせず、ライゲーション非依存性クローニング法を用いてクローニングした。得られたプラスミドは、改変された遺伝子銃プロトコールでベンサミアナタバコ葉表皮細胞に導入した。最後に、形質転換された葉を共焦点顕微鏡で観察した。

概要

この作品は、植物細胞が複数の細胞小器官ではなく、単一のDNA構築物でレポータータンパク質を発現するように遺伝子操作される代謝工学/合成生物学のプロジェクトです。

複数の場所へのタンパク質を標的化するための一つのアプローチは、複数の遺伝子のコピー、異なる局在化ペプチドを含むそれぞれクローニングすることを含む。各コピーは、単一のトランスフォームを1戻し交配によって、あるいは連続的な再変換によって導入するか、しなければならない。これは、追加のクローニングを必要とし、末端ごとに1つのローカライズタグによって制限されます。

複数の場所にタンパク質を局在化する別の方法は、選択的スプライシング2-5を介してである。 RNAは、単一の遺伝子から転写されるが、転写産物の異なるコピーは、セルごとに複数の方法で、多くの場合、異なる方法で処理されます。これは、単一の遺伝子から転写されたセル内の複数のメッセンジャーRNAをもたらすことができる。これらの異なるmessengeR RNAは、同じタンパク質、またはフレームシフトの場合は、全く別のタンパク質の異なるアイソフォームをコードすることができます。選択的スプライシングは、長年にわたって文献に記載されているが、作用及び保存された供与体および受容体スプライス部位のメカニズムは、より最近6解明されている。これらのサイトは、より良い説明されているように、彼らは、エンジニアリングのための機会を開く。

複数の細胞小器官にタンパク質を発現する際に植物代謝エンジニアが課題に直面しています。複数の細胞小器官に局在していることがあるタンパク質を、技術者は、対象とする細胞小器官にそれを指示する別々のシグナル配列と、同じ遺伝子のそれぞれを複数回複製しなければなりません。 3オルガネラにおける単一遺伝子の場合、これは単に三つの遺伝子である。しかし、6個の遺伝子の代謝経路のために、これは18の遺伝子、かなりのクローニングの努力に展開されます。シングル、選択的にスプライス遺伝子記号に複数の局在化配列を結合するificantlyこの努力が削減されます。例えば、リエンジニアリング光呼吸7,8およびイソプレノイド合成9,10は葉緑体およびペルオキシソームの両方を含む。天然のシロイヌナズナ系で観察されるように我々のケースでは、先に6に記載のスプライス部位を利用した。当社は、合理的にだけでは自然なスプライス部位を残してmRNA配列を再設計したが、選択的にスプライスイントロン（ 図1）内の葉緑体またはペルオキシソームターゲティングタグをコードするであろう配列が配置されます。発現されたタンパク質は、またはそれをエンコードされたmRNA前駆体はイントロン（ 図1Gおよび1H）として切り出したかどうかに応じて、タグを持っていない可能性があります。この作品で提示コンストラクトのデザインの詳細については、関連記事11を参照してください。

これはまだかなりのクローニングの努力、ギブソンアセンブリ、DNA構築物をクローニングするための新しい方法であるため、uは建設中のsed。ギブソン方法に関わらず、制限部位（ 図2）12〜14、任意の配列のために使用することができる。酵素の具体的なミックスは、ワンステップ、等温アセンブリを可能にします。この方法では、いくつかの二本鎖の線状DNA部分は、それらが約50塩基対の配列が重複しているように設計されている。ギブソン·アセンブリ酵素混合物は、部分的相同配列の一本鎖を露出させる、直鎖DNA部分を消化する。これらの部分的な一本鎖配列は、迅速なワンステップ、配列に依存し、ライゲーションフリーサブクローニング反応において得られた反応混合物に再アニールされる。

この作品は、ギブソンのアセンブリの新しいライゲーションのないメソッドを使用して、1）合理的な設計選択的スプライシングを受けた植物の葉緑体、ペルオキシソーム、およびサイトゾルでの発現のための構造、2）そのクローニング、遺伝子銃でタバコの葉の細胞への3）の配送を説明し、 GFPで観察されたように、オルガネラターゲティングを示す4）結果および共焦点顕微鏡。

プロトコル

ターゲットと複数のオルガネラのための選択的にスプライス配列の1。デザイン

  1. 最終的なタンパク質発現のための部位を決定。この作業のために、関心は葉緑体、ペルオキシソーム、および細胞質ゾルをターゲットにしている。
  2. 関心対象の細胞小器官へのタンパク質を標的化することが知られているタンパク質およびDNA配列を同定するために文献を使用する。この場合、葉緑体は、 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、L-アスパラギン酸メチル6,15から配列を標的とシロイヌナズナのトランスサイレチンのようなS-アラントイン合成酵素16,17から配列を標的ペルオキシソームを決定した。
  3. 正しい細胞小器官への関心のタンパク質をターゲットとすべき代替スプライシング体制を特定します。この作業のため、自然のシロイヌナズナシステム 6で観察されるようなスプライス部位。 mRNA配列は、天然のスプライス部位を残して再設計されましたが、シーケンスは、符号化葉緑体やperoxisを置いた選択的にスプライスイントロン（ 図1）内のタグをOMEターゲティング。

DNAのパーツの2。ギブソン総会

図2も参照してください。

ギブソンの組立方法は、部分的に隣接するDNA部分の一本鎖および2）アニール相補塩基対を作るために二本鎖DNAの末端のダイジェスト）を1に予め作られた混合物中のいくつかの酵素の作用に依存する。これは、制限部位の制限なしにDNA断片のクローニングを可能にする。

  1. DNAプラスミド構築物における要素の順序を選択します。 a）は、プラスミド、植物、カナマイシン耐性マーカーで作業することが知られているGFP構築物を含むベクター（孔、および大腸菌およびアグロバクテリウム·ホスト·ツメファシエンス ）、b）工程aのための複製起点：一例としてTriTag-1の要素を有しているプロモーター配列、（P ENTCUP2、植物において構成的であることが示されている）、c）の葉緑体配列（CTS）と、c）ペルオキシソーム標的化配列（PTS）を標的、およびd）スプライス部位の一連の6先に説明したように。
  2. インシリコデザイン· ソフトウェアで構築ベース用ベースを設計します。 APEはこの仕事に便利なオープンソースのフリーウェアパッケージです。
    プラスミドベクターに含まれるプラスミドベクター、プロモーター、ATG、スプライスドナー部位、葉緑体標的配列、スプライスドナー部位、中性部位、スプライスアクセプター部位、ペルオキシソーム標的配列、スプライスアクセプター部位、GFP：注：TriTag-1は、順序を有する。
    1. PCR用のプライマーをご注文の際に各ピース間50bpの重複が存在するようなインシリコ DNA構築物を設計します。 25bpの各方向：これは、プライマーとして50 bpのオーバーラップを使用することが可能である。
      1. シーケンス片の起源を追跡するようにしてください。それはのようになります。成長させ、ミニプレップするプラスミド; PCRの鋳型として用いることができる直鎖状配列;である必要があるか、シーケンス商業的に合成された？いくつかの企業が断片<500bpのための低コストのDNA合成サービスを提供しています。それは商業的にご注文することが有利だったので、この場合は、TriTag自体は437 bpである。
      2. すべてのフラグメントをPCRで増幅し、その鋳型DNAから精製された場合、最良の結果が来る。耐性マーカーをより容易にPCRで増幅された二つの小さなテンプレートに、この大きなDNAを分割するには良い場所です。
      3. 制限制限酵素DpnIを、メチル化DNAを切断する。 PCRの鋳型は、 大腸菌からのミニプレップした場合大腸菌、DpnIを処理は、混入のテンプレートDNAを除去します。
  3. 別途、すべてのDNA配列を浄化した水、TEまたは緩衝液EBで溶出する。
    1. 気孔ベクター部分1、〜3,000 BP（緑の矢印）。 PCRは増幅され、治療をDpnI。
    2. 気孔ベクター部分2、〜3,000 BP（黒矢印）。 PCRは増幅され、治療をDpnI。
    3. TriTag INSERT、437 BP（青の矢印）。商業的になっております。 RのddH 2 Oにesuspend
    4. P ENTCUPプロモーター 、〜750塩基対（オレンジの矢印）。 PCRで増幅し、DpnIを処理された。
  4. DNA断片のそれぞれの濃度を測定する。ベクトル片の150 ngの/μLを目指す。
  5. 冷凍庫からギブソンアセンブリミックスの分量を取り、氷上で解凍する。これは、ラボ12月14日に行うことが商業的に入手可能なだけでなく、簡単です。
    1. 粘性5Xマスターミックスと15μlの反応サイズの1.33倍の分量：このレシピへの2つのステップがあります。 5Xマスターミックスには含まれています。3ミリリットルの1Mトリス-HCl、pH7.5、300μlの1 M MgCl 2を 、各dNTP、300μlの1 M DTT、1.5グラムのPEG-8000、20 mgのNAD、および蒸留H 2の600μlの10 mMの6ミリリットルのO。 320μlの一部（18）を調製し、-20℃で1が、すべてを凍結する解決策は非常に粘性になります。これらの「5X等温線バッファを "ラベル
    2. （320μl）を、残りの1に、1.2μLT5エキソヌクレアーゼ、20μLのPhusionハイ-FIDを追加elity DNAポリメラーゼ、160μLのTaq DNAリガーゼと700μlの蒸留H 2 O -20℃でPCR管中の氷とストアに15μLずつ（〜80）を準備
  6. 各フラグメントの等モル量のボリュームを決定します。 Gibthon.orgを含むいくつかのオンライン計算機があります。すべてのDNA断片5μlの合計があるはずです。ギブソンは分量を混ぜて15μLに追加します。これは、ピペットに小さすぎるボリュームを必要とする場合、DNA断片を希釈および/または複数のアリコートを使用する。
    1. 単独のベクターDNA（抗生物質耐性マーカーを含む例えば DNA部分）の制御を準備し、水でボリュームを構成することを忘れないでください。
  7. 30〜60分間50〜55℃でサーマルサイクラーにチューブをインキュベートする。氷の上で交換して、Eに変換する熱ショック、化学的にコンピテントセルを経由して大腸菌 。エレクトロコンピテント細胞を使用しないでください。高塩濃度および比較的低いDNA濃度細胞はアークが発生することがあります。
    1. 200μlの塩化カルシウムコンピテントの市販製剤に全20μLを適用大腸菌 。
      42℃で氷30分および熱ショック60秒でインキュベート
    2. 氷2分に戻り、750μlのSOCまたはLB培地を適用し、37℃でマイクロ遠心チューブに30分を振っ回復LB +菅（またはその他の適切な抗生物質）に混合し、適切な希釈液をプレート。これは、従来のライゲーションに基づくクローニングよりも高いバックグラウンド（および非標的組換え事象の数が多い）になることがありますが、約10個のコロニーをスクリーニングすることは価値がある。
  8. 配列を介してクローンを確認し、-80℃で一定分量を保存する

遺伝子銃とタバコの3。微粒子銃トランスフェクション

これはJoveの18,19年に設立された技術である。重要なステップとの相違点を以下に説明する。

  1. 50〜100を成長ミリリットルE. COLiや200ミリリットルアグロバクテ 。文化をマキシプレップ。約1,500 NG /μLの濃度は、継続するために必要とされている。
  2. 前述したように、遺伝子銃の弾丸を準備します。遺伝子銃にロードします。
  3. ベンサミアナタバコタバコの葉の表皮組織のトランスフェクションのために、3ヶ月の植物の根元に近い大葉を選択します。丁寧にカットさ15cmシャーレに湿ったペーパータオルの上にボトム側を上に配置します。
  4. 200〜250 PSIへの遺伝子銃He圧力を設定します。
  5. 慎重に約3〜5センチメートルその上、葉の下側のリブの間の遺伝子銃を目指しています。安全性を解放し、リーフに粒子を送達。各弾丸は、葉上の同じ場所に二度使用されてもよい。葉が爆発した場合、新しい葉があるため、12 cmの葉のためのそのような年齢、水分などの成長条件への葉の靭性のある分散があるを破棄し、起動し、約6ショットに合うように期待しています。
  6. の上で覆われた葉を格納ベンチで暗い場所で2〜3日間、ペトリ皿。
  7. UV蛍光を装備した解剖顕微鏡で葉を調べ、GFPを発現する個々のセルを検索します。葉の5〜10ミリメートルのセクションを分析。
  8. 〜200μlの0.1％トリトンX-100の下にディープウェル顕微鏡スライドに葉を沈める。界面活性剤は、表面上に気泡を防ぐことができ、及びディープウェル顕微鏡スライドは、より大きな組織の撮像領域を可能にする。

トランスフェクションされた組織の4。共焦点顕微鏡

これらの命令は、すべての楽器ごとに異なりますので、適切な訓練を受けた取得することが不可欠である。

  1. 蛍光検出実験のために、489 nmの励起レーザーを設定し、GFP蛍光とクロロフィルの自家蛍光のために630から700ナノメートルのための500から569 nmの光電子増倍管検出器を設定します。 40倍水浸対物レンズを用いて画像セル。

結果

設計作業は、重要な計画の結果であった。このプロジェクトへの新規で示差的に発現するタンパク質に翻訳されるmRNA前駆体を作成するための選択的スプライシングを使用することである。これらのタンパク質は、この場合には、異なる細胞小器官で発現される葉緑体、ペルオキシソームおよび/または細胞質ゾル。我々は、代わりに6を接合される天然のシロイヌナズナ遺伝子?...

ディスカッション

本研究では、単純な戦略は、植物内の複数の細胞区画に一つのトランスジェニックタンパク質をローカライズするために記載されている。目標は、 ベンサミアナタバコの複数の細胞小器官に単一の遺伝子を発現し構造物を設計することでした。戦略は合理的にGFPベースのDNA構築物の設計、ギブソンアセンブリ、遺伝子銃で葉細胞へのプラスミドの配信、および共焦点顕微鏡を用いた結...

開示事項

著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

著者は、 ベンサミアナタバコ苗の寛大な寄付のためにマサチューセッツ総合病院のジェンシーンに感謝したいと思います。ジェン·ブッシュは、植物の成長、成長チャンバ領域を設定する際の助言が大きく私たちを助けた。ウィス大学のトム·フェランテは、共焦点顕微鏡で重要なヘルプを提供した。著者は、特に遺伝子銃および関連物資の寛大な寄付のためにボストン小児病院とWyssさん研究所のドンIngberに感謝したいと思います。このプロジェクトの資金は、MJVため、PAS、JCW、およびMDM、およびChimerionバイオテクノロジーによって、株式会社のためのエネルギー省高等研究計画局（ARPA-E賞＃DE-000079）との協力協定を通じて提供されていました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Oligonucleotide primersIDT(custom)Design specifically for construct
GeneBlocksIDT(custom)500 bp oligonucleotides
ApE softwareU Utah(download)http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kitQiagen28004Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kitQiagen27104Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC BufferNEBM0532SUsed to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mixNEBE2611LMaster mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5TeknovaT1075Gibson assembly mix
1 M MgCl2G Biosiences82023-086Gibson assembly mix
dNTP mixFermentasR0192Gibson assembly mix
1 M DTTFermentasR0861Gibson assembly mix
PEG-8000Affymetrix19966Gibson assembly mix
NADApplichemA1124,0005Gibson assembly mix
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111KGibson assembly mix
Phusion polymeraseNEBF530SGibson assembly mix
Taq DNA ligaseNEBM0208LGibson assembly mix
Gibthon.orgWebsite to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kitQiagen12963Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun systemBioRad165-2451Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana(n/a)(n/a)Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscopeLeicaSP5 X MPImaging of resultant cells
Deep well slidesElectron Microscopy Sciences71561-01Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculatorhttp://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

参考文献

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