АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта работа описывает новый способ селективного ориентации субклеточных органелл в растениях, анализировали с использованием BioRad Gene Gun.

Аннотация

В целях выявления один белок нескольким субклеточных органелл, растения, как правило, дублируют соответствующие гены, и выразить каждый ген по отдельности, используя сложные стратегий в области регулирования, включая дифференциальных промоутеров и / или сигнальные последовательности. Метаболические инженеры и синтетические биологи, заинтересованные в ориентации ферменты для конкретной органеллы столкнулись с проблемой: белок, который должен быть локализован в более чем одной органеллы, инженер должен клонировать и того же гена многократно. Эта работа представляет собой решение этой стратегии: освоение альтернативного сплайсинга мРНК. Эта технология использует преимущества установленном хлоропластов и пероксисомы ориентации последовательностей и объединяет их в единую мРНК, которая альтернативного сплайсинга. Некоторые варианты сплайсинга отправляются в хлоропласт, некоторые к пероксисоме, а некоторые в цитозоль. Здесь система предназначена для многократного органелл ориентации с альтернативного сплайсинга. В этой работе, GFP как ожидается, будет выражениеEssed в хлоропластов, цитозоле и пероксисоме по серии рационально спроектированными 5 'мРНК тегов. Эти теги имеют потенциал, чтобы уменьшить количество клонирования требуется при гетерологические гены должны быть выражены в нескольких внутриклеточных органелл. Конструкции были разработаны в предыдущей работе 11, и были клонированы с использованием Gibson собрание, перевязки независимый метод клонирования, который не требует ферменты рестрикции. Полученные плазмиды вводили в Nicotiana benthamiana эпидермальный клетках листа с измененным протоколом генной пушки. Наконец, преобразованные листья наблюдались с конфокальной микроскопии.

Введение

Эта работа является метаболической инженерии / синтетическая биология проект, в котором растительные клетки, сконструированные для экспрессии репортера белка в нескольких органелл, но только с одной конструкции ДНК.

Один из подходов к белков-мишеней в более чем одном месте включает клонирование несколько генетических копий, каждая из которых содержит различной локализации пептида. Каждая копия должна быть введена путем последовательного retransformation, или, наоборот, обратным скрещиванием одинокий преобразований 1. Это включает в себя дополнительную клонирование, и ограничивается одной метке локализации на конце.

Еще один способ локализовать белок в нескольких местах через альтернативного сплайсинга 2-5. РНК транскрибируется из одного гена, но разные копии транскрипта обрабатываются по-разному, часто в более чем одним способом на ячейку. Это может привести к более чем одной РНК в клетке транскрибируется из одного гена. Такие разные MessengeR может кодировать РНК для различных изоформ одного и того же белка, или в случае сдвигу рамки, другим белком в целом. Хотя альтернативный сплайсинг был описан в литературе в течение многих лет, механизмы действия и консервативной донора и рецепторных сайтов сплайсинга только быть выяснены в последнее время 6. Как эти сайты в настоящее время лучше описать, они открывают возможности для машиностроения.

Инженеры метаболические завод столкнулись с проблемой при выражении белок в нескольких органелл. Для белка, который должен быть локализован в более чем одной органеллы, инженер должен клонировать и того же гена многократно, каждый с отдельным сигнальной последовательности направляя ее на органеллы интерес. Для одного гена в трех органелл, это просто три гена. Но в течение шести генов метаболизма, это расширяет до 18 генов, значительных усилий клонирования. Объединение нескольких последовательностей локализации в единый, альтернативно-сплайсированному знакificantly уменьшает эти усилия. Например, реинжиниринг фотодыхание 7,8 и изопреноид синтез 9,10 включает в себя как хлоропластов и пероксисомах. В нашем случае мы воспользовались сайтов сплайсинга как это наблюдается в естественной Arabidopsis системы THALIANA описано ранее 6. Мы рационально переработан последовательность мРНК оставив естественное сайтов сплайсинга в одиночку, но размещены последовательности, которые бы кодируют хлоропласты-или пероксисомы таргетирования теги течение альтернативно-сращены интронов (рис. 1). Экспрессированный белок может иметь или не иметь метку, в зависимости от того, был вырезан пре-мРНК, которая кодируется как интрона (данные 1g и 1h). Более подробную информацию о проектировании конструкций, представленных в этой работе, см. в статье спутником 11.

Потому что это все еще значительные усилия клонирование, Гибсон монтаж, новый метод клонирования ДНК конструкты, является исед в строительстве. Способ Gibson могут быть использованы для любой последовательности, независимо от сайтов рестрикции (рис. 2) 12-14. Удельный смесь ферментов позволяет за один шаг, изотермический сборки в. В этом способе, несколько двухцепочечные линейные части ДНК выполнены так, что они имеют перекрывающиеся последовательности ~ 50 б. Гибсон сборка Смесь ферментов частично переваривает линейные части ДНК, подвергая одиночные нити гомологичных последовательностей. Эти частичные одноцепочечные последовательности повторно отжигали в реакционной смеси, что привело к быстрому, одноступенчатый, независимый от последовательности, лигирование, свободной от реакции субклонирования.

Эта работа описывает 1) рациональную конструкцию альтернативного сплайсинга конструкции для выражения в хлоропластах растений, пероксисомах и cytosols, 2) их клонирование с помощью нового перевязки без метод Gibson сборки, 3) их доставка в табачного листа клеток с генной пушки, и 4) результаты, показывающие органелл адресности, как это наблюдается с GFPи конфокальной микроскопии.

протокол

1. Проектирование альтернативы-сращены последовательностей сразу для нескольких органелл таргетинга

  1. Определить места для выражения окончательного белка. За эту работу, интерес в пристреливать хлоропластов, пероксисомы и цитозоль.
  2. Используйте литературу для идентификации белковых и ДНК последовательности, известные белки-мишени в органеллах интерес. В этом случае последовательность хлоропласта из Arabidopsis ориентации THALIANA L-метилтрансферазы isoaspartate 6,15 и пероксисом последовательность ориентации от арабидопсис транстиретином, как S-синтазы аллантоин 16,17 определены.
  3. Определить альтернативный-сплайсинга режим, который должны быть направлены на белки, представляющие интерес для правильных органелл. За эту работу, сайты сплайсинга как это наблюдается в естественной системе Arabidopsis 6. Последовательность мРНК был переработан оставляя природных объектов сплайсинга, но последовательности были размещены кодирования хлоропластов или peroxisОме таргетирования теги в качестве альтернативы-сращены интронов (рис. 1).

2. Гибсон Ассамблея части ДНК

См. также Рисунок 2.

Метод сборки Гибсон зависит от действия ряда ферментов в предварительно сделанные смеси до 1) частично переварить концы двухцепочечной ДНК, чтобы сделать единичные нити и 2) отжига бесплатные пар оснований соседних частей ДНК. Это позволяет клонирования ДНК-фрагментов без ограничений сайтах рестрикции.

  1. Выбрать заказ на элементы в плазмидной ДНК конструкции. В качестве примера TriTag-1 имеет элементы: а) вектор плазмиды (пор, содержащей GFP конструкцию, известную работать в растениями, маркер устойчивости к канамицину, и начала репликации для кишечной палочки и Agrobacterium tumefaciens хозяев), б) промоторной последовательности, (Р ENTCUP2, показано, что учредительный в растениях), В) хлоропластов последовательность (CTS), ориентированная, в) пероксисомы последовательность (PTS), и г адресность) серию сайтов сплайсинга, как описано ранее 6.
  2. Дизайн-конструкция базы-в-базы с в разработке программного обеспечения силикомарганца. APE является открытым исходным кодом бесплатный пакет полезны для этой работы.
    Примечание: TriTag-1, имеет порядок: плазмиды вектор, промоутер, АТГ, сайт сплайсинга донора, хлоропластов последовательность-мишень, сращивания донором сайт, нейтральный сайт, сращивания акцептор сайт, пероксисомы последовательность-мишень, сращивания акцептор сайт, GFP, содержащиеся в вектор плазмиды .
    1. Проектирование в силико конструкцию ДНК таким образом, что существует 50-ВР перекрытие между каждой части при заказе праймеров для ПЦР. Можно использовать 50 п.о. перекрытие в качестве праймеров: 25 пар оснований в каждом направлении.
      1. Обязательно следить за происхождении каждого из кусков последовательности. Это как: плазмиды, чтобы быть выращены и miniprepped; линейная последовательность, которая может быть использована в качестве матрицы для ПЦР; или последовательность, должны бытьсинтезированы в коммерческих целях? Несколько компаний предлагают недорогие услуги синтеза ДНК фрагментов <500 б.п.. В этом случае сама является TriTag 437 п.о. так что это было выгодно, чтобы заказать его в промышленных масштабах.
      2. Наилучшие результаты придет тогда, когда все фрагменты ПЦР-амплифицировали и очищали от их матричной ДНК. Маркер устойчивости является хорошим местом, чтобы разделить эту большую ДНК в двух небольших шаблонов, легче ПЦР-усиливается.
      3. Ограничение Рестрикционный DpnI режет метилированную ДНК. Если шаблон ПЦР был Miniprep из Е. палочка, лечение DpnI удалит загрязняющих матричной ДНК.
  3. Очищают все последовательности ДНК отдельно и элюирования в воде, TE или буфера EB.
    1. пор векторная часть 1, ~ 3000 б.п. (зеленые стрелки). ПЦР-амплификации и ДПНИ лечить.
    2. пор вектор часть 2, ~ 3000 б.п. (черные стрелки). ПЦР-амплификации и ДПНИ лечить.
    3. TriTag вставка, 437 б.п. (синие стрелки). Заказал на коммерческой основе. Resuspend в DDH 2 O.
    4. P ENTCUP промоутер, ~ 750 б.п. (оранжевые стрелки). ПЦР-усиливается и DpnI лечить.
  4. Измерение концентрации каждого из кусочков ДНК. Стремитесь к 150 нг / мкл векторных штук.
  5. Возьмите аликвоту актовом смеси Гибсон из морозильника и разморозить на льду. Это имеется в продаже, но и просто сделать в лаборатории 12-14.
    1. Есть два шага к этому рецепту: вязкая 5x мастер микс и 15 мкл реакции размера 1.33x аликвоты. Master Mix 5x содержит: 3 мл 1 М Трис-HCl, рН 7,5, 300 мкл 1 М MgCl 2, 600 мкл 10 мМ каждого дНТФ, 300 мкл 1 М DTT, 1,5 г ПЭГ-8000, 20 мг NAD и DDH 2 O 6 мл. Подготовьте 320 мкл аликвоты (18) и заморозить все, кроме одного при -20 ° С Решение будет достаточно вязким. Этикетка эти "5X изотермы буфер"
    2. Тому, оставшихся (320 мкл), добавить 1,2 мкл T5 экзонуклеазы, 20 мкл Phusion High-FIDelity ДНК-полимераза, 160 мкл Taq ДНК-лигазы и 700 мкл DDH 2 O. Подготовка 15 мкл аликвоты (~ 80) на льду в ПЦР пробирок и хранить при -20 ° С.
  6. Определить объем для эквимолярных количеств каждого из фрагментов. Есть несколько онлайн калькуляторы, в том числе Gibthon.org. Там должно быть в общей сложности 5 мкл всех частей ДНК. Добавьте их в 15 мкл Гибсон смешать аликвоты. Если это требуется объемы слишком малы, чтобы пипетки, развести фрагментов ДНК и / или использовать более одного аликвоты.
    1. Не забудьте подготовить контроль векторной ДНК в покое (например, часть ДНК, содержащий маркер устойчивости к антибиотику) и составляют объем с водой.
  7. Инкубировать пробирки в амплификатор при 50-55 ° С в течение 30-60 минут. Заменить на льду и превращаются в Е. палочка через теплового шока химически компетентные клетки. Не используйте Электрокомпетентные клетки. Высокая концентрация соли и концентрация относительно низким ДНКможет привести к клеткам дуги.
    1. Применить все 20 мкл к коммерческой подготовки 200 мкл хлоридом кальция компетентную E. палочка.
      Инкубируют на льду 30 мин и теплового шока 60 сек при 42 ° С
    2. Вернуться на лед 2 мин, применяется 750 мкл SOC или LB среду и восстановить встряхивая в микроцентрифужных трубки 30 мин при 37 ° С Plate смесь и соответствующие разведения на LB + Кан (или другого соответствующего антибиотика). Это может привести к более высоким фоне (и большим числом событий рекомбинации нецелевых), чем традиционные перевязки основе клонирования, но стоит экран около 10 колоний.
  8. Подтверждение клон через последовательность и хранить аликвоты при -80 ° С

3. Biolistic Трансфекцию табака с генной пушки

Это техника, которая устанавливается в Юпитер 18,19. Основные этапы и различия описаны ниже.

  1. Расти 50-100 мл E. Колорадолитий или 200 мл Agrobacterium. Макси-приготовительному культуру. Концентрации от примерно 1500 нг / мкл требуется, чтобы продолжить.
  2. Подготовка генной пушки пули, как описано выше. Загрузите их в генной пушки.
  3. Для трансфекции Nicotiana benthamiana табачного листа эпидермальной ткани, выбрать большой лист близко к основанию 3-месячной завода. Аккуратно вырежьте его и поместить его нижней стороной вверх на влажных бумажных полотенец в блюдо 15 см Петри.
  4. Установите давление He для генной пушки до 200-250 фунтов на квадратный дюйм.
  5. Осторожно целью генной пушки между ребрами на нижней стороне листа, около 3-5 см выше него. Отпустите безопасность и доставить частицы к листу. Каждый пуля может быть использован дважды в том же месте на листе. Если лист взрывается, отбросить и начать новый лист-есть некоторые различия в лист вязкости в зависимости от условий роста, таких как возраст, влаги и т.д. Для 12-см листа, ожидайте соответствовать приблизительно 6 выстрелов.
  6. Храните лист, покрытый верхней частиЧашка Петри в течение 2-3 дней при низкой освещенности на скамейке.
  7. Осмотрите лист в рассекает микроскоп оснащен ультрафиолетовой люминесценции, и поиск отдельных клеток, экспрессирующих GFP. Проанализируйте 5-10 мм разделы листа.
  8. Погрузите лист в глубокой микроскопа хорошо скользят под ~ 200 мкл 0,1% Тритон Х-100. Моющее средство помогает предотвратить образование воздушных пузырей на поверхности, а скважина стекло микроскопа позволяет большей площади изображения ткани.

4. Конфокальной микроскопии трансфектированных ткани

Эти инструкции отличаться для каждого инструмента, поэтому важно, чтобы должным образом обучены.

  1. Для экспериментов обнаружения флуоресценции, установить лазер возбуждения в 489 нм и установить фотоэлектронных детекторов в 500-569 нм для GFP флуоресценции и 630-700 нм для хлорофилла автофлуоресценции. Клетки изображение, используя 40х воды погружения цели.

Результаты

Дизайн усилий явилось результатом значительного планирования. Роман к этому проекту является использование альтернативного сплайсинга для создания пре-мРНК, которая в переводе на дифференциально выраженных протеинов. Эти белки экспрессируются в разных органеллах, в данном случае х?...

Обсуждение

В этом исследовании, простые стратегии описаны для локализации одну трансгенную белка в несколько клеточных компартментах в растениях. Цель заключается в разработке конструкции, которая бы выразить один ген в более чем одной органеллы в Nicotiana benthamiana. Стратегии включают рациональ?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Джен Шин из Массачусетского общего госпиталя за щедрое пожертвование Nicotiana benthamiana саженцев. Джен Буш помог нам значительно в консультации в выращивании растений и создание растильню область. Том Ферранте из Висс институт предложил важную помощь с конфокальной микроскопии. Авторы особенно хотел бы поблагодарить Дона Ingber Детской больнице Бостона и Висс институт по щедрому пожертвованию генной пушки и связанных поставок. Финансирование этого проекта была оказана в рамках соглашения о сотрудничестве с Департаментом энергетики Агентства перспективных исследовательских проектов (ARPA-E Award # DE-000079) для PAS, JCW, и МДМ, и через Chimerion биотехнологии, Inc для MJV.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Oligonucleotide primersIDT(custom)Design specifically for construct
GeneBlocksIDT(custom)500 bp oligonucleotides
ApE softwareU Utah(download)http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kitQiagen28004Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kitQiagen27104Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC BufferNEBM0532SUsed to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mixNEBE2611LMaster mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5TeknovaT1075Gibson assembly mix
1 M MgCl2G Biosiences82023-086Gibson assembly mix
dNTP mixFermentasR0192Gibson assembly mix
1 M DTTFermentasR0861Gibson assembly mix
PEG-8000Affymetrix19966Gibson assembly mix
NADApplichemA1124,0005Gibson assembly mix
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111KGibson assembly mix
Phusion polymeraseNEBF530SGibson assembly mix
Taq DNA ligaseNEBM0208LGibson assembly mix
Gibthon.orgWebsite to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kitQiagen12963Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun systemBioRad165-2451Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana(n/a)(n/a)Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscopeLeicaSP5 X MPImaging of resultant cells
Deep well slidesElectron Microscopy Sciences71561-01Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculatorhttp://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

Ссылки

  1. Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
  2. Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
  3. Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
  4. Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
  5. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
  6. Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
  7. Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
  8. Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
  9. Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
  10. Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
  11. Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
  12. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  13. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
  14. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  15. Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
  16. Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
  17. Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
  18. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  19. Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
  20. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

86Nicotiana benthamiana

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены