发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

这个工作描述了一种新颖的方法，用于选择性地靶向亚细胞器在植物中，使用BioRad公司基因枪进行测定。

摘要

为了针对单一蛋白质多亚细胞器，植物通常复制有关的基因，并使用复杂的监管策略，包括不同的启动子和/或信号序列分别表达各自的基因。代谢工程和感兴趣的目标酶到特定的细胞器合成生物学家都面临着一个挑战:对于一种蛋白质，是被定位于一个以上的细胞器，工程师必须复制相同的基因多次。这项工作提出了解决这一策略:利用mRNA的选择性剪接。这项技术需要建立叶绿体和过氧化物酶体靶向序列的优势，将它们组合成一个单一的mRNA被选择性剪接。一些剪接变体将被发送到叶绿体，一些对过氧化物酶，以及一些到细胞质。这里该系统被设计用于多细胞器靶向与可变剪接。在这项工作中，GFP预计将EXPRessed在叶绿体，细胞质和过氧化物酶体通过一系列合理设计5'基因标签。这些标记必须减少当异源基因需要被表达于多种细胞内的细胞器需要克隆的量的电位。该构建体被设计成在先前的工作11，以及使用吉布森装配，不需要限制酶结扎独立克隆方法进行克隆。将得到的质粒导入本氏烟草叶表皮细胞与改性基因枪协议。最后，叶变换观察与激光共聚焦显微镜。

引言

这项工作是代谢工程/合成生物学项目，其中植物细胞工程表达报告蛋白在多种细胞器，但只有一个单一的DNA结构。

一种方法对目标蛋白以多个位置包括克隆多个基因拷贝，每个包含一个不同的本地化的肽。每个副本都必须通过连续的重转换被引入，或者，通过回交单转换1。这涉及到额外的克隆，并通过每总站1定位标记的限制。

另一种方式来定位一个蛋白到多个位置是通过选择性剪接2-5。 RNA是从一个单一的基因转录，但转录物的不同副本中每细胞多于一个的方式处理不同，往往。这可能会导致在从一个单一的基因转录的细胞多于一个信使RNA。这些不同的信使Ř的RNA可编码为同一蛋白质的不同的同种型，或在一个移码，不同的蛋白质完全的情况。虽然选择性剪接在文献中已经描述了许多年，操作和保守的供体和受体剪接位点的机制仅被阐明，最近6。由于这些网站都被更好地描述，他们打开了工程的机会。

在多个细胞器表达一种蛋白质，当植物代谢的工程师都面临着一个挑战。为一种蛋白质，是将其定位于一个以上的细胞器中，工程师必须克隆同一基因多次，每一个独立的信号序列，它引导到感兴趣的细胞器。在三个细胞器的单个基因，这简直就是三个基因。但是，对于一个六基因代谢途径，这种扩展到18个基因，一个显著克隆的努力。结合多种定位序列成一个单一的，或者拼接基因标志ificantly减少了这方面的努力。例如，重新设计光呼吸7,8和类异戊二烯合成9,10同时涉及叶绿体和过氧化物酶体。在我们的例子中，我们利用了剪接位点作为一个自然拟南芥系统观察前面所述6。我们合理地重新设计的mRNA序列而使天然剪接位点单，但放置顺序，将在交替剪接的内含子（ 图1）内的编码叶绿体或过氧化物酶体靶向标记。所表达的蛋白质可能有或可能没有一个标签，这取决于前体mRNA编码它是否被切除的内含子（ 图1g和1小时 ）。就在这项工作中提出的结构的设计的更多信息，请参阅本文的姊妹篇11。

因为这仍是一个显著克隆的努力，吉布森组装，克隆DNA结构的新方法，为used的建设。可以使用吉布森方法对于任何序列，无论限制性位点（ 图2）12-14。酶的特定组合允许单步​​，等温组件。在该方法中，一些双链线性DNA部分被设计为使得它们具有的〜50bp的重叠序列。吉布森组装酶混合物部分消化线性DNA部分，露出的单链同源序列。这些部分单链的序列被重新​​退火的反应混合物中，导致快速的一步，顺序无关的，结扎无亚克隆反应。

这项工作说明1）合理设计选择性剪接表达在植物叶绿体，过氧化物酶和细胞液的结构，2）他们的克隆使用吉布森组件的新结扎-free方法，3）其输送到烟叶细胞与基因枪，和4）结果显示细胞器的定位，与绿色荧光蛋白观察和共聚焦显微镜。

研究方案

的或者拼接序列的多细胞器靶向1。设计

  1. 确定网站最终蛋白的表达。对于这项工作，兴趣是在瞄准的叶绿体，过氧化物酶体和细胞质。
  2. 使用该文献以确定已知的靶蛋白与感兴趣的细胞器的蛋白质和DNA序列。在这种情况下，叶绿体靶向序列来自拟南芥的L-isoaspartate甲基6,15，和来自拟南芥转甲状腺素状的S-尿囊素合酶16,17靶向序列的过氧化物酶进行测定。
  3. 找出一个替代剪接制度，应该感兴趣的蛋白定位到正确的细胞器。对于这项工作，剪接位点作为一个自然拟南芥系统6观察。 mRNA序列进行了重新设计留下天然剪接位点，但序列置于编码叶绿体或peroxis青梅靶向的交替剪接内含子内标签（ 图1）。

2，吉布森DNA的组装部件

参见图2。

吉布森组装方法在预制的组合，以1取决于几种酶的作用）部分地消化双链DNA的末端，使单链和2）退火免费碱基对的DNA邻近的部位。这允许DNA片段的克隆没有限制酶切位点的限制。

  1. 选择用于在该DNA的质粒构建体中的元素的顺序。作为一个例子TriTag-1具有的要素:a）一种质粒载体（孔，含有已知在植物中卡那霉素抗性标记的工作GFP的构建体，和复制的大肠杆菌和根癌土壤杆菌宿主），b）一种起源启动子序列，（P ENTCUP2，证明是组成型植物），三）靶向序列（CTS）的叶绿体，c）一种过氧化物酶体靶向序列（PTS），以及d）如前面6描述了一系列的剪接位点。
  2. 设计构建基为基带，在硅片设计软件。 APE是一个开放源码的免费软件包对这项工作非常有用。
    注:TriTag-1，具有顺序为:质粒载体，启动子，ATG，剪接供体位点，叶绿体靶序列，剪接供体位点，中性的网站，剪接受体位点，过氧化物酶体靶序列，剪接受体位点，绿色荧光蛋白为包含在质粒载体。
    1. 设计在硅片 DNA结构，使得订货引物进行PCR时，有每片之间有50 bp的重叠。它可以使用50个碱基的引物:25 bp的每个方向。
      1. 一定要保持每个序列块的起源轨道。它是为:质粒进行种植和微量制备;一个线性序列，可被用作PCR的模板;或一个序列，将需要合成的商业？有几家公司为片段<500 bp的提供低成本DNA合成服务。在这种情况下，TriTag本身是437碱基所以这是有利的，商业上订。
      2. 最好的结果会来，如果所有的片段的PCR扩增，并从它们的模板DNA进行纯化。抗性标记是一个好地方来划分这个大的DNA成两个较小的模板更容易PCR扩增的。
      3. 限制限制性内切酶切割DPNI甲基化DNA。如果PCR的模板是从E.一个小量制备大肠杆菌，DPNI处理将去除污染的DNA模板。
  3. 单独净化所有的DNA序列和洗脱水，TE或缓冲的EB。
    1. 孔载体部分1，〜3,000 bp的（绿色箭头）。 PCR扩增并进行DPNI处理。
    2. 孔载体部分2，〜3,000 bp的（黑色箭头）。 PCR扩增并进行DPNI处理。
    3. TriTag插入，437个基点（蓝色箭头）。商业订购。 Řesuspend在DDH 2 O。
    4. P ENTCUP子，〜750个基点（橙色箭头）。 PCR扩增，并进行DPNI处理。
  4. 测量各DNA片段的浓度。瞄准150纳克/微升向量件。
  5. 取吉布森组件组合的等分试样出冰箱和解冻冰上。这是市售的，而且简单，使在实验室12-14。
    1. 有两个步骤来此配方:一种粘稠的5倍预混液和15μl的反应大小的1.33倍等分。的5倍主混合物含有:3毫升的1M的Tris-HCl pH为7.5，加入300μl的1M MgCl 2的，每种dNTP各600微升的10mM，300微升的1M DTT，加入1.5g PEG-8000，20毫克NAD和双蒸0到6毫升准备320微升等分（18），并冻结所有，但一个在-20°C。该解决方案将非常粘稠。标注这些"5X等温线的缓冲区"
    2. 要剩下的一个（320微升），加1.2μLT5核酸外切酶，20微升的Phusion高-FIDelity DNA聚合酶，160微升的Taq DNA连接酶和700微升双蒸2 O。制备15微升等分试样（〜80），在冰上在PCR管中并储存于-20℃。
  6. 确定卷的每个片段的等摩尔量。有几个在线计算器，包括Gibthon.org。应该有一个总的5微升所有DNA碎片。将它们添加到15μL吉布森混合等分。如果这需要体积太小，移液管，稀释的DNA片段和/或使用一个以上的等分试样。
    1. 不要忘了准备单独的载体DNA的控制（ 如含有抗生素抗性标记的DNA的一部分），并与水的体积。
  7. 孵育在热循环仪的管在50-55℃30-60分钟。装上冰和转化为E。通过热休克化学感受态细胞大肠杆菌 。不要使用电感受态细胞。在高盐浓度和相对低的DNA浓度可能导致细胞电弧。
    1. 适用于所有20μl到一个商业的200微升氯化钙制备感受态大肠杆菌 。
      在冰上孵育30分钟，热休克60秒，在42℃下
    2. 返回到冰2分钟，应用750微升SOC或LB培养基中，并回收摇动在微量离心管30分钟，在37℃下板放在LB +阚（或其它适当的抗生素）的混合物中，并适当稀释。这可能导致较高的背景（和一些非靶重组事件更高）比传统的结扎的克隆，但它是值得的，筛选大约10个菌落。
  8. 通过序列确认克隆和存储的等分试样在-80℃下

3，基因枪法烟草的转染与基因枪

这是一种建立在朱庇特的18,19技术。关键步骤和差异如下所述。

  1. 增长50-100毫升大肠杆菌合作Li或200毫升农杆菌 。马克西 - 预习文化。约1500纳克/ A浓度微升才能继续。
  2. 制备基因枪子弹如前所述。它们加载到基因枪。
  3. 对于本氏烟烟叶表皮组织的转染，选择大叶近3个月的旧厂房的基础。小心切开它，并把它底部朝上湿纸巾15厘米的培养皿中。
  4. 的压力，他对基因枪设置为200-250磅。
  5. 仔细瞄准基因枪肋骨之间在叶的底部，约3-5厘米以上吧。释放安全和递送颗粒的叶。每个子弹在叶上的同一位置，可以使用两次。如果叶爆炸，丢弃，并开始新的一页，有叶韧性一些差异，由于生长条件如年龄，水分等。对于一个12厘米的叶片，期望以适合约6张。
  6. 存储叶子，覆盖着一顶培养皿在板凳上弱光2-3天。
  7. 检查配备了紫外荧光解剖显微镜的叶子，然后搜索表达GFP单个细胞。剖析叶5-10毫米的部分。
  8. 淹没在叶下〜200微升0.1％的Triton X-100深井显微镜幻灯片。洗涤剂有助于防止气泡的表面上形成，且深井泵显微镜载玻片允许更大的组织成像区域。

4，激光共聚焦转染组织的显微镜

这些指令各有不同，每一个仪器，所以它必须得到适当的培训。

  1. 用于荧光检测的实验中，激发激光器设置为489 nm，而设置在光电倍增管探测器500-569纳米的GFP荧光和630-700 nm的叶绿素自发荧光。用40倍水浸泡的目的细胞图像。

结果

设计工作是显著规划的结果。小说这个项目是利用选择性剪接来创建一个前体mRNA被翻译成差异表达蛋白。这些蛋白被表达在不同的细胞器，在这种情况下，叶绿体，过氧化物酶体和/或细胞质中。我们适于天然拟南芥基因被选择性剪接6，并置于已知叶绿体6和过氧化物酶体17定位在备用的外显子序列（TriTag-1和TriTag-2）。 TriTag-3由嵌入在叶绿体序列的低复杂性区域中的...

讨论

在这项研究中，简单的策略描述了用于定位的单个转基因蛋白在植物中多种细胞区室。我们的目标是设计构造，它会表达一个单一的基因在烟草本塞姆氏多个细胞器。策略包括合理的设计基于GFP的DNA构建体，吉布森组装，交付质粒叶细胞与基因枪，并观察其结果与激光共聚焦显微镜。

三种不同的短，N-末端标签被设计为同时叶绿体，过氧化物酶体和胞质溶胶定位11?...

披露声明

作者什么都没有透露。

致谢

作者要感谢马萨诸塞州总医院的仁为辛本氏烟苗的慷慨捐赠。仁布什帮助我们大大的意见，在植物生长，并设立一个生长室面积。韦斯研究所的汤姆·费兰特共聚焦显微镜提供了重要的帮助。作者要特别感谢波士顿儿童医院唐Ingber和威斯研究所基因枪和相关耗材的慷慨捐赠。资助这项计划是通过与能源高级研究计划署的署（ARPA-E奖＃DE-000079）为PAS，JCW，和MDM的合作协议规定，并通过Chimerion生物技术公司的MJV。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Oligonucleotide primersIDT(custom)Design specifically for construct
GeneBlocksIDT(custom)500 bp oligonucleotides
ApE softwareU Utah(download)http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kitQiagen28004Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kitQiagen27104Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC BufferNEBM0532SUsed to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mixNEBE2611LMaster mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5TeknovaT1075Gibson assembly mix
1 M MgCl2G Biosiences82023-086Gibson assembly mix
dNTP mixFermentasR0192Gibson assembly mix
1 M DTTFermentasR0861Gibson assembly mix
PEG-8000Affymetrix19966Gibson assembly mix
NADApplichemA1124,0005Gibson assembly mix
T5 exonucleaseEpicentreT5E4111KGibson assembly mix
Phusion polymeraseNEBF530SGibson assembly mix
Taq DNA ligaseNEBM0208LGibson assembly mix
Gibthon.orgWebsite to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kitQiagen12963Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun systemBioRad165-2451Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana(n/a)(n/a)Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscopeLeicaSP5 X MPImaging of resultant cells
Deep well slidesElectron Microscopy Sciences71561-01Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE) University of Utah http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculatorhttp://django.gibthon.org/tools/ligcalc/

参考文献

  1. Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
  2. Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
  3. Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
  4. Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
  5. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
  6. Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
  7. Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
  8. Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
  9. Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
  10. Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
  11. Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
  12. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  13. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
  14. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  15. Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
  16. Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
  17. Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
  18. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  19. Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
  20. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

86 DNA RNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。