Transient espressione genica in tabacco con all'Assemblea Gibson e Gene Gun

Riepilogo

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.

Abstract

Al fine di indirizzare una singola proteina a più organelli subcellulari, piante tipicamente duplicare i geni rilevanti, ed esprimono ogni gene separatamente utilizzando complesse strategie di regolamentazione, tra cui promotori differenziali e / o sequenze di segnali. Ingegneri metaboliche e biologi sintetici interessato a colpire enzimi per un particolare organello trovano ad affrontare una sfida: per una proteina che è da localizzare a più di un organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte. Si presenta una soluzione a questa strategia: sfruttando splicing alternativo dell'mRNA. Questa tecnologia sfrutta cloroplasto stabilito e dei perossisomi mira sequenze e li combina in un unico mRNA che viene alternativamente impiombata. Alcune varianti di splicing vengono inviati al cloroplasto, alcuni al perossisoma, e alcuni al citosol. Qui il sistema è progettato per multipli organello targeting con splicing alternativo. In questo lavoro, GFP si aspettava di essere espressed nei cloroplasti, citosol, e perossisomi da una serie di razionalmente progettati 5 'tag mRNA. Questi tag hanno il potenziale per ridurre la quantità di clonazione necessaria quando i geni eterologhi devono essere espressi in più organelli subcellulari. I costrutti sono stati progettati in opera precedente ^11, e sono stati clonati usando Gibson assembly, un metodo di clonazione indipendente legatura che non richiede enzimi di restrizione. I plasmidi risultanti sono stati introdotti in Nicotiana benthamiana celle foglia epidermica con un protocollo Gene Gun modificato. Infine, foglie trasformate sono state osservate con microscopia confocale.

Introduzione

Questo lavoro è un progetto di ingegneria / biologia sintetica metabolica in cui le cellule vegetali sono progettati per esprimere una proteina reporter in diversi organelli ma solo con un singolo costrutto di DNA.

Un approccio per proteine ​​bersaglio a più di una posizione comporta clonazione più copie genetiche, ciascuna contenente un diverso peptide localizzazione. Ogni copia deve essere introdotto da successive ritrasformazione, o, in alternativa, da backcrossing singole trasformazioni ^1. Ciò comporta la clonazione supplementare, ed è limitata da un tag di localizzazione per ogni terminale.

Un altro modo per localizzare una proteina a più riprese è attraverso splicing alternativo ^2-5. RNA è trascritto da un singolo gene, ma diverse copie della trascrizione sono trattati in modo diverso, spesso in più di un modo per cella. Ciò può comportare più di un RNA messaggero nella cella trascritto da un singolo gene. Questi diversi messengeRNA R possono codificare per diverse isoforme della stessa proteina, o nel caso di un frameshift, una proteina diversa. Sebbene splicing alternativo è stato descritto in letteratura per molti anni, i meccanismi di azione e donatore conservati e splice siti recettoriali sono solo stati chiariti più recente ^6. Poiché questi siti vengono meglio descritti, si aprono opportunità per l'ingegneria.

Gli ingegneri metaboliche delle piante si trovano ad affrontare una sfida quando esprime una proteina in più organelli. Per una proteina che è da localizzare a più organello, il tecnico deve clonare il gene stesso più volte, ciascuno con una sequenza segnale separato dirigendolo al organello di interesse. Per un singolo gene in tre organelli, questo è semplicemente tre geni. Ma per una via metabolica sei gene, questo si espande a 18 geni, un notevole sforzo di clonazione. La combinazione di più sequenze di localizzazione in un unico segno gene alternativa-impiombatoriduce ificantly questo sforzo. Ad esempio, re-engineering fotorespirazione ^7,8 e sintesi isoprenoide ^9,10 coinvolge sia i cloroplasti e perossisomi. Nel nostro caso abbiamo approfittato dei siti di splicing come osservato in un sistema di Arabidopsis thaliana naturale descritto in precedenza ^6. Abbiamo razionalmente riprogettato la sequenza di mRNA di lasciare i siti di splicing naturali solo, ma messo sequenze che codificano tag-perossisomi rivolti-cloroplasto o all'interno introni alternativamente-splicing (Figura 1). La proteina espressa può o non può avere un tag, a seconda che il pre-mRNA che codifica è stato escisso come un introne (Figure 1g e 1h). Per ulteriori informazioni sulla progettazione dei costrutti presentati in questo lavoro, vedere l'articolo compagna ^11.

Perché questo è ancora uno sforzo significativo clonazione, il montaggio Gibson, un nuovo metodo di clonazione costrutti di DNA, è used in costruzione. Il metodo Gibson può essere utilizzato per qualsiasi sequenza, indipendentemente siti di restrizione (Figura 2) ^12-14. Il mix specifico di enzimi permette un solo passaggio, assemblaggio isotermica. In questo metodo, più parti a doppio filamento lineare di DNA sono progettati in modo tale che essi hanno sequenze sovrapposte di ~ 50 bp. L'assemblaggio miscela enzimatica Gibson digerisce parzialmente le parti di DNA lineari, esponendo singoli filamenti di sequenze omologhe. Questi parziali sequenze a singolo filamento sono ri-ricotti nella miscela di reazione, con un conseguente rapido, one-step, sequenza-indipendente, reazione subcloning privo di legatura.

Questo lavoro descrive 1) progettazione razionale costrutti splicing alternativo per l'espressione di cloroplasti delle piante, perossisomi, e citosol, 2) la loro clonazione utilizzando il nuovo metodo privo di legatura di riunione Gibson, 3) la loro consegna nelle cellule delle foglie di tabacco con Gene Gun, e 4) I risultati mostrano il targeting organelli, come osservato con GFPe microscopia confocale.

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Protocollo

1. Progettazione di sequenze alternativa-splicing per multipla Organelle Targeting

1. Determinare i siti per l'espressione finale di proteine. Per questo lavoro, l'interesse è in mira la cloroplasti, perossisomi, e citosol.
2. Utilizzare la letteratura per identificare proteine ​​e DNA sequenze note di indirizzare le proteine ​​per organelli di interesse. In questo caso un cloroplasto di targeting sequenza di Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferasi ^6,15, e un perossisomi mira sequenza di Arabidopsis thaliana transthyretin come S-allantoina sintasi ^16,17 sono stati determinati.
3. Identificare un regime-splicing alternativo che dovrebbe indirizzare le proteine ​​di interesse per gli organelli corretti. Per questo lavoro, splice siti come osservato in un sistema di Arabidopsis naturale ^6. La sequenza di mRNA è stata ridisegnata lasciando i siti di splicing naturali, ma le sequenze sono stati collocati codifica peroxis-cloroplasto oome-targeting tag all'interno introni alternativamente-splicing (Figura 1).

2. Assemblea Gibson di parti di DNA

Vedi anche figura 2.

Il metodo di assemblaggio Gibson dipende dall'azione di numerosi enzimi in un mix pre-made a 1) parzialmente digerire le estremità del DNA a doppio filamento di rendere filamenti singoli e 2) ricottura paia di basi gratuiti della vicina pezzi di DNA. Questo permette la clonazione di frammenti di DNA senza le limitazioni dei siti di restrizione.

1. Scegliere un ordine per gli elementi del costrutto di DNA plasmidico. Come esempio TriTag-1 ha elementi di: a) un vettore plasmidico (pori, contenente un costrutto GFP noto a lavorare in piante, un marcatore di resistenza alla kanamicina, e origini di replicazione di E. coli e Agrobacterium tumefaciens host), b) una sequenza promotore, (P _ENTCUP2, mostrato come costitutivo in piante), C) un cloroplasto rivolti sequenza (CTS), c) una sequenza di targeting perossisomi (PTS), e d) una serie di siti di splicing come descritto in precedenza ^6.
2. Progettare la base-per-base costrutto con il software di progettazione in silico. Scimmia è un pacchetto freeware open source utile per questo lavoro.
   Nota: TriTag-1, ha l'ordine: plasmide vettore, promoter, ATG, sito di splice donatore, cloroplasti sequenza bersaglio, sito donatore di splicing, luogo neutro, accettore sito di splice, perossisomi sequenza bersaglio, accettore sito di splice, GFP contenute nel vettore plasmidico .
   1. Progettare il silico costrutto di DNA in modo tale che vi sia una sovrapposizione di 50 bp tra ogni pezzo al momento dell'ordine primer per PCR. È possibile utilizzare la sovrapposizione 50 bp come primer: 25 bp ciascuna direzione.
      1. Essere sicuri di tenere traccia della provenienza di ciascuno dei pezzi di sequenza. E 'come: un plasmide di essere coltivate e miniprepped; una sequenza lineare che può essere utilizzato come modello PCR; o una sequenza che dovrà esseresintetizzato in commercio? Diverse aziende offrono servizi di sintesi del DNA a basso costo per frammenti <500 bp. In questo caso, il TriTag sé è 437 bp quindi era vantaggioso per ordinare commercialmente.
      2. I migliori risultati arriveranno se tutti i frammenti siano PCR-amplificati e purificati dalla loro DNA template. Il marcatore di resistenza è un buon posto per dividere questo grande DNA in due modelli più piccoli che sono più facilmente PCR-amplificato.
      3. Di restrizione restrizione enzima DpnI taglia il DNA metilato. Se il modello di PCR era una miniprep da E. coli, trattamento DpnI rimuoverà il contaminante DNA stampo.
3. Purificare tutte le sequenze di DNA separatamente ed eluire in acqua, TE o tampone EB.
   1. parte PORE vettore 1, ~ 3000 bp (frecce verdi). PCR amplificato e DpnI trattata.
   2. PORE vettore parte 2, ~ 3000 bp (frecce nere). PCR amplificato e DpnI trattata.
   3. TriTag inserto, 437 bp (frecce blu). Ordinato in commercio. Resuspend in DDH ₂ O.
   4. P _ENTCUP promotore, ~ 750 bp (frecce arancioni). PCR-amplificato e DpnI trattata.
4. Misurare le concentrazioni di ciascuno dei pezzi di DNA. Obiettivo per 150 ng / ml dei pezzi di vettore.
5. Prelevare un 'aliquota del mix di montaggio Gibson fuori dal freezer e scongelare sul ghiaccio. Questa è disponibile in commercio, ma anche di semplice realizzazione in laboratorio ^12-14.
   1. Ci sono due passi per questa ricetta: a 5x master mix viscoso e 15 reazione dimensioni aliquote di 1.33x microlitri. Il master mix 5x contiene: 3 ml di 1 M Tris-HCl pH 7.5, 300 ml 1 M MgCl _2, 600 microlitri 10 mM di ciascun dNTP, 300 ml 1 M DTT, 1,5 g di PEG-8000, 20 mg di NAD, e DDH ₂ O a 6 ml. Preparare 320 microlitri aliquote (18) e congelare tutti tranne uno a -20 ° C. La soluzione sarà molto viscoso. Etichettare questi "tampone isoterma 5X"
   2. Per quello rimanente (320 ml), aggiungere 1,2 microlitri T5 Exonuclease, 20 microlitri Phusion Alto-Fidelity DNA polimerasi, 160 microlitri Taq DNA Ligase e 700 ml DDH ₂ O. Preparare 15 aliquote microlitri (~ 80) sul ghiaccio in provette per PCR e conservare a -20 ° C.
6. Determinare il volume di quantità equimolari di ciascuno dei frammenti. Ci sono alcuni calcolatori online, tra cui Gibthon.org. Ci dovrebbe essere un totale di 5 ml di tutti i pezzi di DNA. Aggiungerli al 15 microlitri Gibson mix aliquota. Se questo richiede volumi troppo piccolo per pipetta, diluire i frammenti di DNA e / o utilizzare più di una aliquota.
   1. Non dimenticate di preparare un controllo del DNA vettore da solo (ad esempio, la parte di DNA che contiene il marcatore di resistenza agli antibiotici) e portare a volume con acqua.
7. Incubare le provette in un termociclatore a 50-55 ° C per 30-60 minuti. Sostituire su ghiaccio e trasformare in E. coli attraverso le cellule chimicamente competenti shock termico. Non utilizzare cellule elettrocompetenti. La concentrazione di sale e la concentrazione di DNA relativamente bassapuò causare le cellule a arco.
   1. Applicare tutte le 20 microlitri di una preparazione commerciale di 200 microlitri di calcio cloruro competente E. coli.
      Incubare 30 min in ghiaccio e shock termico 60 sec a 42 ° C
   2. Ritorno al ghiaccio 2 min, applicare 750 microlitri SOC o terreno LB e recuperare agitazione in una provetta 30 minuti a 37 ° C. Piatto il composto e diluizioni adeguate LB + Kan (o altro antibiotico appropriato). Questo può tradursi in background maggiore (e un numero maggiore di eventi di ricombinazione non-target) rispetto ai tradizionali clonazione a base di legatura, ma vale la pena di schermo di circa 10 colonie.
8. Conferma clone tramite sequenza e memorizzare una aliquota a -80 ° C

3. Biolistic trasfezione di tabacco con il Gene Gun

Questa è una tecnica che si instaura in JoVE ^18,19. Passaggi chiave e le differenze sono descritte di seguito.

1. Crescere 50-100 ml E. coli o 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep cultura. Una concentrazione di circa 1.500 ng / ml è necessaria per continuare.
2. Preparare gene proiettili di pistola come descritto in precedenza. Caricarli nella Gene Gun.
3. Per la trasfezione di Nicotiana benthamiana tabacco foglia tessuto epidermico, scegliere un grande foglia vicino alla base di un impianto di 3 mesi. Tagliare con cautela e metterlo lato inferiore su tovaglioli di carta bagnati in un piatto di 15 centimetri Petri.
4. Impostare la pressione Lui per il Gene Gun a 200-250 psi.
5. Orientare con attenzione la pistola genica tra nervature sul lato inferiore di una foglia, circa 3-5 cm sopra di esso. Rilasciare la sicurezza e fornire le particelle all'anta. Ogni proiettile può essere utilizzato per due volte nella stessa posizione sulla foglia. Se esplode foglia, scartano e avviare una nuova foglia-c'è qualche variazione in foglia tenacità a causa di condizioni di crescita, come l'età, l'umidità, ecc Per una foglia di 12 cm, si aspettano per adattarsi circa 6 colpi.
6. Conservare la foglia, coperto con la parte superiore di unCapsula di Petri per 2-3 giorni in condizioni di scarsa luminosità in panchina.
7. Esaminare la foglia in un microscopio dissezione dotato di fluorescenza UV, e la ricerca di singole cellule che esprimono GFP. Sezionare 5-10 mm sezioni di foglia.
8. Immergere la foglia in un vetrino da microscopio ben profondità sotto ~ 200 microlitri 0,1% Triton X-100. Il detersivo aiuta a prevenire la formazione di bolle d'aria sulla superficie, e la profonda microscopio ben vetrino consente una grande area di esposizione del tessuto.

4. Microscopia confocale di Tissue trasfezionati

Queste istruzioni variano per ogni strumento, quindi è essenziale per ottenere adeguatamente formati.

1. Per gli esperimenti di rivelazione di fluorescenza, impostare il laser di eccitazione a 489 nm, e impostare i rivelatori fotomoltiplicatori a 500-569 nm per GFP fluorescenza e 630-700 nm per la clorofilla auto-fluorescenza. Celle di immagine utilizzando un obiettivo 40x immersione in acqua.

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Risultati

Lo sforzo progettuale è stato il risultato di una pianificazione significativa. Novel di questo progetto è l'uso di splicing alternativo per creare un pre-mRNA che viene tradotto in proteine ​​differenzialmente espressi. Queste proteine ​​sono espresse in diversi organelli, in questo caso il cloroplasti, perossisomi e / o citosol. Abbiamo adattato gene Arabidopsis naturale che viene alternativamente impiombato ^6, e collocato conosciuti cloroplasto ⁶ e perossisomi ¹⁷

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Discussione

In questo studio, strategie semplici sono descritti per la localizzazione di una singola proteina transgenica a più compartimenti cellulari nelle piante. L'obiettivo era di progettare costrutto che esprimesse un singolo gene in più di un organello in Nicotiana benthamiana. Le strategie includono progettazione razionale di base di GFP-costrutti di DNA, il montaggio Gibson, la consegna dei plasmidi a celle foglia con il Gene Gun, e l'osservazione dei risultati con microscopia confocale.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide primers	IDT	(custom)	Design specifically for construct
GeneBlocks	IDT	(custom)	500 bp oligonucleotides
ApE software	U Utah	(download)	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit	Qiagen	28004	Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27104	Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer	NEB	M0532S	Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix	NEB	E2611L	Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5	Teknova	T1075	Gibson assembly mix
1 M MgCl2	G Biosiences	82023-086	Gibson assembly mix
dNTP mix	Fermentas	R0192	Gibson assembly mix
1 M DTT	Fermentas	R0861	Gibson assembly mix
PEG-8000	Affymetrix	19966	Gibson assembly mix
NAD	Applichem	A1124,0005	Gibson assembly mix
T5 exonuclease	Epicentre	T5E4111K	Gibson assembly mix
Phusion polymerase	NEB	F530S	Gibson assembly mix
Taq DNA ligase	NEB	M0208L	Gibson assembly mix
Gibthon.org			Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit	Qiagen	12963	Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system	BioRad	165-2451	Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana	(n/a)	(n/a)	Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope	Leica	SP5 X MP	Imaging of resultant cells
Deep well slides	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE)	University of Utah		http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator			http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/