Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

Résumé

Ce travail décrit un nouveau procédé pour cibler sélectivement des organelles sous-cellulaires dans les plantes, dosés par la BioRad Gene Gun.

Résumé

Afin de cibler une seule protéine à plusieurs organites intracellulaires, plantes généralement double emploi avec les gènes pertinents, et d'exprimer chaque gène séparément à l'aide des stratégies de réglementation complexes, y compris les promoteurs de différentiels et / ou des séquences de signaux. Ingénieurs métaboliques et les biologistes synthétiques intéressés à cibler les enzymes à un organite particulier sont confrontés à un défi: Pour une protéine qui doit être localisée à plus d'un organite, l'ingénieur doit cloner le gène même plusieurs fois. Ce travail présente une solution à cette stratégie: exploiter l'épissage alternatif de l'ARNm. Cette technique tire parti du chloroplaste établi et des séquences de ciblage de peroxysome et les combine en un seul ARNm qui est épissé de façon alternative. Certains variants d'épissage sont envoyés vers le chloroplaste, les uns pour le peroxysome, et certains au cytosol. Ici, le système est conçu pour les multiples ciblant un organite de l'épissage alternatif. Dans ce travail, la GFP a été prévu pour être exprEssed dans le chloroplaste, cytosol, et peroxysomes par une série d'conçus rationnellement 5 'de l'ARNm des tags. Ces balises ont le potentiel de réduire la quantité de clonage nécessaire lorsque des gènes hétérologues doivent être exprimés en plusieurs organites intracellulaires. Les constructions ont été conçues dans le travail précédent ^11, et ont été clones en utilisant Gibson assemblage, un procédé de clonage indépendant de la ligature qui ne nécessite pas d'enzymes de restriction. Les plasmides résultants ont été introduits dans les cellules épidermiques des feuilles de Nicotiana benthamiana avec un protocole Gene Gun modifié. Enfin, les feuilles transformées ont été observées par microscopie confocale.

Introduction

Ce travail est un projet d'ingénierie / de la biologie synthétique métabolique dans lequel les cellules végétales sont modifiées pour exprimer une protéine rapporteur dans plusieurs organites mais avec une seule construction d'ADN.

Une approche pour cibler des protéines à plus d'un emplacement de clonage implique de multiples copies génétiques, chacune contenant un peptide de localisation différente. Chaque copie doit être introduite par retransformation successifs, ou encore, par rétrocroisement transformations simples ^1. Il s'agit de clonage supplémentaire, et est limitée par une balise de localisation par terminus.

Une autre façon de localiser une protéine à plusieurs endroits à travers l'épissage alternatif ^2-5. ARN est transcrit à partir d'un seul gène, mais différentes copies de la transcription sont traitées différemment, souvent dans plus d'un titre par cellule. Cela peut entraîner plus d'un ARN messager dans la cellule transcrit à partir d'un gène unique. Ces différents messengeARN R peut coder pour différentes isoformes de la même protéine, ou dans le cas d'un décalage du cadre, une protéine différente. Bien que l'épissage alternatif ont été décrits dans la littérature depuis de nombreuses années, les mécanismes d'action et de donneur conservée et les sites d'épissage des récepteurs ne sont élucidés, plus récemment, ^6. Comme ces sites sont mieux décrites, elles ouvrent des opportunités pour l'ingénierie.

ingénieurs métaboliques des plantes sont confrontés à un défi en exprimant une protéine dans plusieurs organites. Pour une protéine qui doit être localisée à plus d'un organite, le mécanicien doit cloner le gène même plusieurs fois, chacune avec une séquence signal séparé le diriger vers l'organite d'intérêt. Pour un gène unique en trois organelles, il s'agit simplement de trois gènes. Mais pour une voie métabolique six gène, cela élargit à 18 gènes, un effort significatif de clonage. Combinaison de plusieurs séquences de localisation en un seul signe de gène, alternativement épisséréduit ificantly cet effort. Par exemple, re-engineering photorespiration ^7,8 et la synthèse des isoprénoïdes ^9,10 implique à la fois les chloroplastes et les peroxysomes. Dans notre cas, nous avons profité de sites d'épissage comme observé dans un système naturel de Arabidopsis thaliana décrit précédemment ^6. Nous rationnelle redessiné la séquence d'ARNm de quitter les sites d'épissage naturels seul, mais placés séquences qui coder chloroplastes ou des balises péroxisome ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1). La protéine exprimée peut être ou ne pas avoir une étiquette, selon que le pré-ARNm codé qui a été excisé sous la forme d'un intron (figures 1g et 1h). Pour plus d'informations sur la conception des constructions présentées dans ce travail, s'il vous plaît voir l'article de compagnon ^11.

Parce que c'est encore un effort significatif de clonage, assemblage Gibson, une nouvelle méthode de clonage des constructions d'ADN, est used dans la construction. Procédé Gibson peut être utilisée pour n'importe quelle séquence, indépendamment de sites de restriction (figure 2) ^{de 12 à 14.} La composition précise des enzymes permet en une seule étape, l'assemblage isotherme. Dans ce procédé, plusieurs parties linéaires à double brin d'ADN ont été conçus de telle sorte qu'ils ont des séquences chevauchantes de ~ 50 bp. L'ensemble de mélange d'enzymes Gibson digère partiellement les parties d'ADN linéaires, exposant simples brins de séquences homologues. Ces séquences simple brin partiels sont à nouveau recuit dans le mélange réactionnel, résultant en une seule étape, indépendante de la séquence, la réaction de ligature sous-clonage libre-rapide.

Ce travail décrit une) conception rationnelle constructions épissage alternatif pour l'expression dans les chloroplastes des plantes, les peroxysomes, et cytosols, 2) leur clonage en utilisant le nouveau procédé d'assemblage Gibson libre ligature, 3) leur livraison dans les cellules de la feuille de tabac avec le pistolet à gènes, et 4) des résultats montrant ciblage organite, comme observé avec la GFPet microscopie confocale.

Protocole

1. Conception de séquences d'épissage alternative-pour Multiple Organelle ciblage

1. Déterminer les sites d'expression de la protéine finale. Pour ce travail, l'intérêt est de cibler le chloroplaste, peroxysomes, et cytosol.
2. Utilisez la littérature pour identifier les protéines et les séquences d'ADN connues pour cibler des protéines vers les organites d'intérêt. Dans ce cas, une séquence de ciblage du chloroplaste d'Arabidopsis thaliana L-méthyltransférase isoaspartate ^6,15, et une séquence de ciblage de peroxysome de Arabidopsis thaliana transthyrétine-S-comme l'allantoïne ^16,17 synthase ont été déterminés.
3. Identifier un régime alternatif-épissage qui devrait cibler les protéines d'intérêt pour les organites correctes. Pour ce travail, les sites d'épissage comme observé dans un système de Arabidopsis naturel ^6. La séquence de l'ARNm a été redessiné en laissant les sites d'épissage naturels, mais les séquences codantes ont été placés peroxis chloroplastiques ouome-balises de ciblage dans les introns épissés alternativement-(Figure 1).

2. Assemblée Gibson des parties ADN

Voir aussi la figure 2.

Le procédé d'assemblage Gibson dépend de l'action de plusieurs enzymes dans un mélange de pré-mesure pour 1) digérer partiellement les extrémités de l'ADN double brin de faire brins simples et 2) recuire les paires de bases complémentaires de parties de l'ADN voisin. Ceci permet le clonage de fragments d'ADN, sans les limitations des sites de restriction.

1. Choisir une commande pour les éléments dans le produit d'assemblage d'ADN plasmidique. A titre d'exemple TriTag-1 a des éléments de: a) un vecteur plasmidique (pores, contenant une construction de GFP connu pour fonctionner dans les plantes, un marqueur de résistance à la kanamycine, et des origines de replication pour E. coli et Agrobacterium tumefaciens des hôtes), b) un séquence de promoteur, (P _ENTCUP2, montré pour être constitutive dans les plantes), C) une séquence de ciblage du chloroplaste (CTS), c) une séquence de ciblage des peroxysomes (PTS), et d) une série de sites d'épissage tel que décrit précédemment ^6.
2. Concevoir la base de base de construction avec des logiciels de design in silico. ApE est un logiciel gratuit open source utile pour ce travail.
   Remarque: TriTag-1, a l'ordre: vecteur plasmidique, promoteur, ATG, site donneur d'épissage, séquence cible chloroplastes, site donneur d'épissage, un site neutre, site accepteur d'épissage, séquence cible peroxysomes, site accepteur d'épissage, GFP figurant dans le vecteur plasmidique .
   1. Concevoir la construction d'ADN en silico telle qu'il y ait un chevauchement de 50 pb entre chaque pièce lors de la commande des amorces pour PCR. Il est possible d'utiliser le chevauchement de 50 pb comme amorces: 25 paires de bases respectivement.
      1. Assurez-vous de garder une trace de l'origine de chacun des morceaux de séquence. Est-il aussi: un plasmide d'être cultivées et miniprepped; une séquence linéaire qui peut être utilisé comme matrice de PCR; ou une séquence qui devra êtresynthétisé dans le commerce? Plusieurs entreprises offrent des services de synthèse d'ADN à faible coût pour les fragments <500 pb. Dans ce cas, la TriTag lui-même est 437 pb si il était avantageux de commander le commerce.
      2. Les meilleurs résultats sont si tous les fragments sont amplifiés par PCR et purifiés à partir de leur ADN matrice. Le marqueur de résistance est un bon endroit pour partager ce grand ADN en deux modèles plus petits qui sont plus facilement amplifié par PCR.
      3. Restriction enzyme de restriction Dpnl coupe l'ADN méthylé. Si la matrice de PCR était une miniprep à partir de E. coli, le traitement Dpnl va supprimer la matrice d'ADN contaminant.
3. Purifier toutes les séquences d'ADN et éluer séparément dans l'eau, ou du tampon TE EB.
   1. vecteur de pores partie 1, ~ 3000 pb (flèches vertes). PCR amplifié et traité Dpnl.
   2. vecteur de pores partie 2, ~ 3000 pb (flèches noires). PCR amplifié et traité Dpnl.
   3. TriTag insert, 437 pb (flèches bleues). Commandé le commerce. Resuspend dans le trou DDH ₂ O.
   4. P _ENTCUP promoteur, ~ 750 pb (flèches oranges). PCR-amplifié et traité Dpnl.
4. Mesurer les concentrations de chacun des morceaux d'ADN. But pour 150 ng / ul des morceaux de vecteur.
5. Prélever une partie aliquote de l'ensemble mélange Gibson du congélateur et décongeler sur la glace. C'est disponible dans le commerce, mais aussi simple à faire dans le laboratoire ^12-14.
   1. Il ya deux étapes à cette recette: un mélange maître de 5x visqueux et 15 pi 1,33 aliquotes réaction de taille. Le mélange maître 5x contient: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 ul de 1 M de _MgCl2, 600 ul de 10 mM de chaque dNTP, 300 ul de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, et le trou DDH ₂ O à 6 ml. Préparer 320 aliquotes (18) et de geler tous mais à -20 ° C. La solution sera très visqueux. Étiqueter ces "tampon isotherme 5X"
   2. Pour celui qui reste (320 pi), ajouter 1,2 pi T5 Exonuclease, 20 pl Phusion Haute-Fidelity ADN polymérase, 160 pi de Taq ADN ligase et 700 pi ddH ₂ O. Préparer 15 aliquotes (~ 80) sur la glace dans des tubes PCR et conserver à -20 ° C.
6. Déterminer les volumes de quantités équimolaires de chacun des fragments. Il ya quelques calculatrices en ligne, y compris Gibthon.org. Il devrait y avoir un total de 5 ul de tous les morceaux d'ADN. Ajoutez-les à la 15 pi Gibson mélanger aliquote. Si cela nécessite des volumes trop petits à la pipette, diluer les fragments d'ADN et / ou d'utiliser plus d'une aliquote.
   1. N'oubliez pas de préparer un contrôle de l'ADN du vecteur seul (par exemple, la partie de l'ADN contenant le marqueur de résistance à un antibiotique) et porter au volume avec de l'eau.
7. Incuber les tubes dans un cycleur thermique à 50-55 ° C pendant 30-60 minutes. Remplacer sur la glace et se transformer en E. coli via choc thermique cellules chimiquement compétentes. Ne pas utiliser des cellules électrocompétentes. La forte concentration en sel et la concentration d'ADN relativement faiblepeut causer des cellules à l'arc.
   1. Appliquer tous les 20 pi à une préparation commerciale de 200 pi du chlorure de calcium E. compétente coli.
      Incuber sur de la glace 30 min et 60 sec choc thermique à 42 ° C
   2. Retour à la glace 2 min, appliquer 750 pi SOC ou milieu LB et récupérer secouant dans un tube à centrifuger 30 min à 37 ° C. Plaque du mélange et des dilutions appropriées sur LB + Kan (ou autre antibiotique approprié). Il peut en résulter fond supérieur (et un nombre plus élevé d'événements de recombinaison non-cibles) que le traditionnel clonage basé ligature, mais il est utile de dépister environ 10 colonies.
8. Confirmez clone par séquence et stocker une aliquote à -80 ° C

3. Biolistic transfection de tabac avec le pistolet à gènes

Il s'agit d'une technique qui est établi dans JoVE ^18,19. Étapes et les principales différences sont décrites ci-dessous.

1. Cultivez 50-100 ml E. coli 200 ml ou Agrobacterium. Maxi-prep la culture. Une concentration d'environ 1 500 ng / pl est nécessaire pour continuer.
2. Préparer gènes balles d'arme à feu tel que décrit précédemment. Chargez-les dans le pistolet à gènes.
3. Pour la transfection de Nicotiana benthamiana tabac tissu feuille épidermique, choisissez une grande feuille près de la base d'une usine de 3 mois. Découpez soigneusement et placez-le côté bas en haut sur des serviettes en papier humide dans une boîte de Petri de 15 cm.
4. Régler la pression Il pour le pistolet à gènes à 200-250 psi.
5. Viser soigneusement le pistolet à gènes entre les nervures sur la face inférieure d'une feuille, environ 3-5 cm au-dessus. Relâcher la sécurité et délivrer les particules à la feuille. Chaque puce peut être utilisée deux fois au même endroit sur la feuille. Si l'explosion de la feuille, jeter et recommencer une feuille-il nouveau, c'est une certaine variation dans la feuille ténacité en raison de conditions de croissance tels que l'âge, l'humidité, etc Pour un 12 cm feuille, s'attendre à tenir environ 6 coups.
6. Rangez la feuille, couvert avec le haut d'unBoîte de Pétri pendant 2-3 jours en basse lumière sur le banc.
7. Examinez la feuille dans un microscope de dissection équipé fluorescence UV, et la recherche de cellules individuelles exprimant la GFP. Disséquer 5-10 sections mm de feuille.
8. Plonger la feuille dans une lame de microscope dans des puits profonds sous ~ 200 ul de 0,1% de Triton X-100. Le détergent permet d'éviter les bulles d'air de se former sur la surface, et la glissière de microscope bien profond permet une plus grande surface d'imagerie des tissus.

4. Microscopie confocale de tissus transfectées

Ces instructions varient pour chaque instrument, il est donc essentiel de se bien formés.

1. Pour les expériences de détection par fluorescence, réglez le laser d'excitation à 489 nm, et définir les détecteurs photomultiplicateurs à 500-569 nm pour fluorescence de la GFP et de 630 à 700 nm pour la chlorophylle auto-fluorescence. cellules de l'image en utilisant un objectif 40x immersion dans l'eau.

Résultats

L'effort de conception est le résultat d'une planification importante. Roman de ce projet est l'utilisation de l'épissage alternatif de créer un pré-ARNm qui est traduit en protéines exprimées de façon différentielle. Ces protéines sont exprimées dans différents organelles, dans ce cas, le chloroplaste, des peroxysomes et / ou cytosol. Nous avons adapté gène d'Arabidopsis naturel qui est épissage alternatif ^6, et placé chloroplaste ⁶ et ¹⁷ pero...

Discussion

Dans cette étude, des stratégies simples sont décrits pour la localisation d'une seule protéine transgénique à plusieurs compartiments cellulaires chez les plantes. L'objectif était de concevoir construction qui exprimerait un seul gène dans plus d'un organite dans Nicotiana benthamiana. Les stratégies comprennent la conception rationnelle de constructions à base d'ADN GFP, assemblage Gibson, la livraison des plasmides aux cellules de la feuille avec le pistolet à gènes, et l'obs...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide primers	IDT	(custom)	Design specifically for construct
GeneBlocks	IDT	(custom)	500 bp oligonucleotides
ApE software	U Utah	(download)	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit	Qiagen	28004	Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27104	Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer	NEB	M0532S	Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix	NEB	E2611L	Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5	Teknova	T1075	Gibson assembly mix
1 M MgCl2	G Biosiences	82023-086	Gibson assembly mix
dNTP mix	Fermentas	R0192	Gibson assembly mix
1 M DTT	Fermentas	R0861	Gibson assembly mix
PEG-8000	Affymetrix	19966	Gibson assembly mix
NAD	Applichem	A1124,0005	Gibson assembly mix
T5 exonuclease	Epicentre	T5E4111K	Gibson assembly mix
Phusion polymerase	NEB	F530S	Gibson assembly mix
Taq DNA ligase	NEB	M0208L	Gibson assembly mix
Gibthon.org			Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit	Qiagen	12963	Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system	BioRad	165-2451	Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana	(n/a)	(n/a)	Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope	Leica	SP5 X MP	Imaging of resultant cells
Deep well slides	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE)	University of Utah		http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator			http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/