Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

Resumen

Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

Resumen

Con el fin de dirigirse a una sola proteína a múltiples orgánulos subcelulares, las plantas normalmente duplican los genes pertinentes, y expresan cada gen por separado utilizando estrategias regulatorias complejas incluyendo promotores diferenciales y / o secuencias de señal. Ingenieros metabólicos y biólogos sintéticos interesadas en la orientación de las enzimas a un orgánulo particular, se enfrentan a un desafío: Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen múltiples veces. Este trabajo presenta una solución a esta estrategia: aprovechar splicing alternativo del mRNA. Esta tecnología se aprovecha de cloroplasto establecido y secuencias de peroxisomas focalización y los combina en un único ARNm que se empalmados alternativamente. Algunas variantes de empalme se envían al cloroplasto, algunos hasta el peroxisoma, y ​​algunos al citosol. Aquí, el sistema está diseñado para múltiples orgánulo que apunta con el corte y empalme alternativo. En este trabajo, se espera que las buenas prácticas agrarias para ser exprEssed en el cloroplasto, citosol, y peroxisomas por una serie de diseñados racionalmente 5 'etiquetas de ARNm. Estas etiquetas tienen el potencial de reducir la cantidad de clonación requerido cuando los genes heterólogos necesitan ser expresado en múltiples orgánulos subcelulares. Las construcciones fueron diseñadas en el trabajo anterior ^11, y se clonaron utilizando el montaje de Gibson, un método de clonación independiente de ligación que no requiere enzimas de restricción. Los plásmidos resultantes se introdujeron en las células epidérmicas de la hoja de Nicotiana benthamiana con un protocolo modificado pistola de genes. Finalmente, las hojas transformadas se observaron con microscopía confocal.

Introducción

Este trabajo es un proyecto de ingeniería / biología sintética metabólica en la que las células vegetales están diseñados para expresar una proteína reportera en varios orgánulos, pero con una única construcción de ADN.

Un enfoque para dirigir proteínas a más de un lugar de clonación implica múltiples copias genéticas, cada uno que contiene un péptido de localización diferente. Cada copia debe ser introducida por los sucesivos retransformación, o alternativamente, por retrocruzamiento transformaciones individuales ^1. Esto implica la clonación por adición, y está limitado por una etiqueta de localización por terminal.

Otra forma de localizar una proteína para múltiples ubicaciones es a través de splicing alternativo ^2-5. ARN se transcribe a partir de un único gen, pero diferentes copias de la transcripción se procesa de manera diferente, a menudo en más de una forma por célula. Esto puede resultar en más de un ARN mensajero en la célula transcrito a partir de un único gen. Estos diferentes messengeARN R puede codificar para diferentes isoformas de la misma proteína, o en el caso de un desplazamiento del marco, una proteína totalmente diferente. Aunque splicing alternativo ha sido descrita en la literatura para muchos años, los mecanismos de acción y de donantes conservadas y sitios de empalme del receptor sólo están siendo elucidados más recientemente ^6. A medida que se describen mejor estos sitios, se abren oportunidades para la ingeniería.

Ingenieros metabólicos Plant se enfrentan a un desafío cuando la expresión de una proteína en múltiples orgánulos. Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen varias veces, cada una con una secuencia señal separada dirigir a los orgánulos de interés. Para un solo gen en tres orgánulos, esto es simplemente tres genes. Sin embargo, para una vía metabólica de seis genes, esto se expande a 18 genes, un importante esfuerzo de clonación. Combinación de varias secuencias de localización en un único signo de genes empalmados alternativamente-reduce ificantly este esfuerzo. Por ejemplo, la reingeniería de la fotorrespiración ^7,8 y la síntesis de isoprenoides ^9,10 involucra tanto a los cloroplastos y peroxisomas. En nuestro caso nos aprovechamos de los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis thaliana naturales descrito previamente ^6. Nos racionalmente rediseñado la secuencia de ARNm de salir de los sitios de empalme naturales solo, pero colocamos secuencias que codifican cloroplasto-o etiquetas al peroxisoma dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1). La proteína expresada puede o no puede tener una etiqueta, dependiendo de si la pre-ARNm que lo codifica se escindió como un intrón (Figuras 1g y 1h). Para obtener más información sobre el diseño de las construcciones que se presentan en este trabajo, por favor vea el artículo del compañero ^11.

Debido a que este es todavía un esfuerzo significativo clonación, montaje Gibson, un nuevo método para la clonación de las construcciones de ADN, es used en la construcción. El método de Gibson puede ser utilizado para cualquier secuencia, con independencia de los sitios de restricción (Figura 2) ^12-14. La mezcla específica de enzimas permite un solo paso, el montaje isotérmica. En este método, varias partes de ADN lineal de doble cadena están diseñados de tal manera que tienen secuencias solapantes de ~ 50 pb. El conjunto de mezcla de enzimas Gibson digiere parcialmente las partes lineales de ADN, la exposición de cadenas simples de secuencias homólogas. Estas secuencias de una sola hebra parciales se vuelven a recocidas en la mezcla de reacción, lo que resulta en una, de un solo paso, independiente de la secuencia, la reacción subclonación-ligadura libre rápida.

Este trabajo describe 1) Diseño de construcciones racionales empalmados alternativamente para la expresión en los cloroplastos de las plantas, los peroxisomas, y citosoles, 2) su clonación utilizando el nuevo método de ligadura libre de reunión Gibson, 3) de su entrega a las células de las hojas de tabaco con la pistola de genes, y 4) resultados que muestran la orientación de orgánulos, como se observa con las buenas prácticas agrariasy microscopía confocal.

Protocolo

1. Diseño de secuencias Alternativamente empalmados-en caso de pluralidad Orgánulos Focalización

1. Determinar los sitios para la expresión de la proteína final. Para este trabajo, el interés se centra en la orientación del cloroplasto, peroxisomas y citoplasma.
2. Usar la literatura para identificar las secuencias de proteínas y de ADN conocidos que atacan las proteínas de los orgánulos de interés. En este caso, una orientación del cloroplasto secuencia de Arabidopsis thaliana-L isoaspartate metiltransferasa ^6,15, y una secuencia dirigida a los peroxisomas de Arabidopsis thaliana-transtiretina como S-alantoína sintasa ^16,17 fueron determinado.
3. Identificar un régimen alternativo de empalme que deben orientar las proteínas de interés a los orgánulos correctas. Para este trabajo, los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis naturales ^6. La secuencia de ARNm fue rediseñado dejando los sitios de empalme naturales, pero las secuencias de codificación se colocaron peroxis cloroplastos oome de metas de etiquetas dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1).

2. Asamblea Gibson de piezas de ADN

Ver también la Figura 2.

El método de montaje Gibson depende de la acción de varias enzimas en una mezcla pre-hechos a 1) digerir parcialmente los extremos de la doble hebra de ADN para hacer de hebras sencillas y 2) de recocido pares de bases complementarias de la vecina partes de ADN. Esto permite la clonación de fragmentos de ADN sin las limitaciones de los sitios de restricción.

1. Elige un órden para los elementos de la construcción del plásmido de ADN. Como un ejemplo TriTag-1 tiene elementos de: a) un vector plásmido (poros, que contiene una construcción de GFP se sabe que funciona en plantas, un marcador de resistencia a kanamicina, y orígenes de replicación para E. coli y Agrobacterium tumefaciens anfitriones), b) una secuencia de promotor, (P _ENTCUP2, demostrado ser constitutiva en plantas), C) una secuencia de direccionamiento de cloroplastos (CTS), c) una secuencia de dirección de peroxisomas (PTS), y d) una serie de sitios de empalme como se ha descrito previamente ^6.
2. Diseñar la base para la construcción de la base con en el software de diseño de silico. ApE es un paquete de software gratuito de código abierto útil para este trabajo.
   Nota: TriTag-1, tiene la orden: vector de plásmido, promotor, ATG, sitio de empalme de donantes, secuencia diana del cloroplasto, el sitio donador de empalme, lugar neutral, el sitio aceptor de empalme, secuencia diana de peroxisomas, sitio aceptor de empalme, las buenas prácticas agrarias, que figura en el plásmido vector .
   1. Diseñar el silico construcción de ADN de tal que hay un solapamiento de 50 pb entre cada pieza en el pedido cebadores para la PCR. Es posible usar la superposición de 50 pb como los cebadores: 25 pb cada dirección.
      1. Asegúrese de no perder de vista el origen de cada uno de los pedazos de secuencia. Es como: un plásmido ser cultivadas y miniprepped; una secuencia lineal que se puede utilizar como una plantilla de PCR; o una secuencia que tiene que sersintetizado comercialmente? Varias compañías ofrecen servicios de síntesis de ADN de bajo costo para los fragmentos de <500 pb. En este caso, la propia TriTag es 437 pb por lo que era conveniente pedirlo en el mercado.
      2. Los mejores resultados vendrán si todos los fragmentos son amplificado por PCR y purificados a partir de su plantilla de ADN. El marcador de resistencia es un buen lugar para dividir esta gran ADN en dos plantillas más pequeñas que son más fácilmente amplificado por PCR.
      3. Enzima de restricción Restricción DpnI corta el ADN metilado. Si la plantilla de PCR era un miniprep a partir de E. coli, el tratamiento DpnI se retire la plantilla de ADN contaminante.
3. Purificar todas las secuencias de ADN por separado y se produzca la elución en agua, o TE Buffer EB.
   1. Pore ​​vector parte 1, ~ 3000 pb (flechas verdes). Amplificó por PCR y DpnI tratada.
   2. Pore ​​vector parte 2, ~ 3000 pb (flechas negras). Amplificó por PCR y DpnI tratada.
   3. TriTag inserción, 437 pb (flechas azules). Pedido comercialmente. Resuspend en ddH ₂ O.
   4. P promotor _ENTCUP, ~ 750 pb (flechas de color naranja). Amplificado por PCR y DpnI tratada.
4. Medir las concentraciones de cada una de las piezas de ADN. Apunta a 150 ng / l de las piezas de vectores.
5. Tomar una alícuota de la mezcla de ensamblaje Gibson del congelador y descongelar en hielo. Este está disponible comercialmente, pero también fácil de hacer en el laboratorio ^12-14.
   1. Hay dos pasos para esta receta: una mezcla maestra 5x viscosa y 15 alícuotas 1.33x reacción de tamaño mL. La mezcla maestra 5x contiene: 3 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 300 l 1 M de MgCl _2, 600 l 10 mM de cada dNTP, 300 l de DTT 1 M, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, y ddH ₂ O a 6 ml. Preparar 320 ml de alícuotas (18) y la congelación de todos menos uno a -20 ° C. La solución será bastante viscoso. Etiquetar estos "tampón 5X isoterma"
   2. Para el resto (320 l), añadir 1,2 l T5 Exonucleasa, 20 l Phusion alta FidElity ADN polimerasa, 160 l de Taq ADN ligasa y 700 l ddH ₂ O. Preparar 15 ml de alícuotas (~ 80) en el hielo en tubos de PCR y se almacena a -20 ° C.
6. Determinar los volúmenes de cantidades equimolares de cada uno de los fragmentos. Hay algunas calculadoras en línea, incluyendo Gibthon.org. Debe haber un total de 5 l de todas las piezas de ADN. Añadir a la l 15 Gibson mezclar alícuota. Si esto requiere volúmenes demasiado pequeño para pipeta, diluir los fragmentos de ADN y / o utilizar más de una parte alícuota.
   1. No te olvides de preparar un control del ADN vector solo (por ejemplo, la parte de ADN que contiene el marcador de resistencia a los antibióticos) y completar el volumen con agua.
7. Incubar los tubos en un termociclador a 50-55 ° C durante 30-60 minutos. Vuelva a colocar en hielo y se transforman en E. coli mediante choque térmico células químicamente competentes. No utilice células electrocompetentes. La alta concentración de sal y la concentración de ADN relativamente bajapueden hacer que las células ARC.
   1. Aplicar todos los 20 l de una preparación comercial de 200 l de cloruro de calcio competente de E. coli.
      Incubar en hielo 30 min y el calor de choque 60 segundos a 42 ° C
   2. Volver a hielo 2 min, aplicar 750 l de SOC o medio LB y recuperar agitación en un tubo de microcentrífuga de 30 min a 37 ° C. Placa de la mezcla y las diluciones adecuadas en LB + Kan (u otro antibiótico adecuado). Esto puede resultar en un mayor fondo (y un mayor número de eventos de recombinación no objetivo) que la clonación basada en la ligadura tradicional, pero vale la pena analizar cerca de 10 colonias.
8. Confirmar clon a través de la secuencia y almacenar una parte alícuota a -80 ° C

3. Biolístico transfección de Tabaco de la pistola de Gene

Esta es una técnica que se establece en JoVe ^18,19. Los pasos clave y las diferencias se describen a continuación.

1. Crecer 50-100 ml E. coLi o 200 ml de Agrobacterium. Maxi-prep de la cultura. Una concentración de aproximadamente 1500 ng / l se requiere para continuar.
2. Preparar balas de pistola de genes tal como se describe anteriormente. Cargarlos en la pistola de genes.
3. Para la transfección de Nicotiana benthamiana tabaco tejido foliar epidérmica, elija una hoja grande cerca de la base de una planta de 3 meses de edad. Corte con cuidado y colocarlo parte inferior hacia arriba en toallas de papel húmedas en un plato de 15 cm de Petri.
4. Ajustar la presión de Él para la pistola de genes de 200 a 250 psi.
5. Apuntar con cuidado la pistola de genes entre las costillas en la parte inferior de una hoja, unos 3-5 cm por encima de ella. Suelte la seguridad y entregar las partículas a la hoja. Cada bala puede ser utilizado dos veces en el mismo lugar en la hoja. Si estalla la hoja, descartan y empezar una nueva vida-hay una cierta variación en la hoja de la dureza debido a las condiciones de crecimiento, tales como la edad, la humedad, etc Para una hoja de 12 cm, le espera para encajar alrededor de 6 disparos.
6. Guarde la hoja, cubierta con la parte superior de unPlaca de Petri durante 2-3 días con poca luz en el banquillo.
7. Examine la hoja en un microscopio de disección equipado con fluorescencia UV, y la búsqueda de las células individuales que expresan GFP. Diseccionar 5-10 mm secciones de la hoja.
8. Sumerja la hoja en un portaobjetos de microscopio de pozo profundo en ~ 200 l 0,1% de Triton X-100. El detergente ayuda a prevenir la formación de burbujas de aire en la superficie, y la profunda portaobjetos de microscopio y permite una zona de formación de imágenes de tejido más grande.

4. Microscopía Confocal del tejido Transfectadas

Estas instrucciones varían para cada instrumento, por lo que es esencial para conseguir una formación adecuada.

1. Para los experimentos de detección por fluorescencia, ajuste el láser de excitación a 489 nm, y establecer los detectores fotomultiplicadores de 500-569 nm para GFP fluorescencia y 630-700 nm para la clorofila autofluorescencia. Celdas de imagen utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x.

Resultados

El esfuerzo de diseño fue el resultado de una planificación significativa. Novela de este proyecto es la utilización del splicing alternativo para crear un pre-ARNm que se traduce en proteínas expresadas diferencialmente. Estas proteínas se expresan en diferentes orgánulos, en este caso el cloroplasto, peroxisomas y / o citosol. Adaptamos gen Arabidopsis natural que se empalmados alternativamente ^6, y se coloca conocidos cloroplasto ⁶ y peroxisomas ¹⁷ secuencias dirigidas ...

Discusión

En este estudio, se describen estrategias simples para la localización de una única proteína transgénica a múltiples compartimentos celulares en plantas. El objetivo era diseñar constructo que expresara un solo gen en más de un orgánulo en Nicotiana benthamiana. Las estrategias incluyen el diseño racional de construcciones de ADN basada en GFP, el montaje de Gibson, la entrega de los plásmidos de células de las hojas con la pistola de genes, y la observación de los resultados con microscopía confoc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide primers	IDT	(custom)	Design specifically for construct
GeneBlocks	IDT	(custom)	500 bp oligonucleotides
ApE software	U Utah	(download)	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit	Qiagen	28004	Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27104	Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer	NEB	M0532S	Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix	NEB	E2611L	Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5	Teknova	T1075	Gibson assembly mix
1 M MgCl2	G Biosiences	82023-086	Gibson assembly mix
dNTP mix	Fermentas	R0192	Gibson assembly mix
1 M DTT	Fermentas	R0861	Gibson assembly mix
PEG-8000	Affymetrix	19966	Gibson assembly mix
NAD	Applichem	A1124,0005	Gibson assembly mix
T5 exonuclease	Epicentre	T5E4111K	Gibson assembly mix
Phusion polymerase	NEB	F530S	Gibson assembly mix
Taq DNA ligase	NEB	M0208L	Gibson assembly mix
Gibthon.org			Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit	Qiagen	12963	Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system	BioRad	165-2451	Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana	(n/a)	(n/a)	Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope	Leica	SP5 X MP	Imaging of resultant cells
Deep well slides	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE)	University of Utah		http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator			http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/