Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

Resumo

Este trabalho descreve um novo método para alvejar seletivamente organelas subcelulares nas plantas, analisadas usando o BioRad Gene Gun.

Resumo

A fim de orientar uma única proteína para várias organelas subcelulares, plantas tipicamente duplicar os genes relevantes e expressar cada gene separadamente usando estratégias regulatórias complexas, incluindo promotores diferenciais e / ou seqüências de sinais. Engenheiros metabólicas e biólogos sintéticos interessadas no direccionamento enzimas para um organelo particular, são confrontados com um desafio: Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes. Este trabalho apresenta uma solução para esta estratégia: o aproveitamento splicing alternativo do mRNA. Esta tecnologia aproveita de cloroplasto estabelecida e seqüências peroxissoma segmentação e as combina em um único mRNA que é alternativamente emendados. Algumas variantes de processamento são enviados para o cloroplasto, algum do peroxissoma, e outros para o citosol. Aqui o sistema é projetado para múltiplo organela alvo com splicing alternativo. Neste trabalho, a GFP era esperado para ser exprEssed no cloroplasto, citosol, peroxissoma e por uma série de racionalmente concebidos 5 'tags de mRNA. Estas etiquetas têm o potencial de reduzir a quantidade de clonagem necessária quando os genes heterólogos têm de ser expressos em vários organelos subcelulares. As construções foram concebidas em trabalho anterior ^11, e foram clonados utilizando a montagem de Gibson, um método de clonagem independente de ligação que não necessita de enzimas de restrição. Os plasmídeos resultantes foram introduzidos na Nicotiana benthamiana células da epiderme da folha, com um protocolo modificado do gene da arma. Finalmente, as folhas transformadas foram observadas por microscopia confocal.

Introdução

Este trabalho é um projeto de engenharia biologia / sintético metabólica em que as células de plantas são projetados para expressar uma proteína repórter em várias organelas, mas com apenas uma única construção de DNA.

Uma abordagem para proteínas alvo de mais do que um local envolve múltiplas cópias genéticas de clonagem, contendo cada um péptido localização diferente. Cada cópia deve ser introduzido por sucessivas retransformação ou, alternativamente, por retrocruzamentos transforms solteiro ^1. Isto envolve a clonagem adicional, e é limitada por uma etiqueta de localização por terminal.

Outra maneira para localizar uma proteína de múltiplos locais é através de splicing alternativo ^2-5. O RNA é transcrito a partir de um único gene, mas cópias diferentes da transcrição são processados ​​de maneira diferente, muitas vezes em mais do que uma maneira por célula. Isto pode resultar em mais do que um ARN mensageiro na célula transcrito a partir de um único gene. Estes messenge diferenteRNAs r pode codificar para diferentes isoformas da mesma proteína, ou no caso de uma mudança de enquadramento, uma proteína completamente diferente. Apesar de splicing alternativo foi descrito na literatura durante muitos anos, os mecanismos de acção e de doador conservada e locais de união de receptor apenas estão a ser elucidados mais recentemente ^6. Como estes sites estão sendo mais bem descrito, abrem-se oportunidades para a engenharia.

Engenheiros metabólicos da planta são confrontados com um desafio ao expressar uma proteína em várias organelas. Para que uma proteína que é para ser localizada a mais de um organelo, o engenheiro necessário clonar o mesmo gene várias vezes, cada uma com uma sequência de sinal separado dirigindo-a para o organelo de interesse. Para um único gene em três organelas, este é simplesmente três genes. Mas, para uma via metabólica de seis genes, esta expande-se para 18 genes, um esforço significativo clonagem. Combinando várias seqüências de localização em um sinal de um único gene, alternativamente emendadosificantly reduz esse esforço. Por exemplo, fotorrespiração reengenharia ^7,8 e síntese isoprenoid ^9,10 envolve tanto os cloroplastos e peroxissomos. No nosso caso, se aproveitou de locais de splicing como observado em um sistema de Arabidopsis thaliana naturais descrito anteriormente ^6. Nós racionalmente redesenhado a sequência de mRNA deixando os locais de splicing naturais sozinho, mas colocado sequências que codificam alvos-peroxissoma-cloroplasto ou dentro dos intrões alternativamente emendados (Figura 1). A proteína expressa pode ou não ter uma etiqueta, dependendo se o pré-ARNm que codificava foi excisada como um intrão (Figuras 1g e 1h). Para mais informações sobre o projeto das construções apresentadas neste trabalho, consulte o artigo do companheiro ^11.

Porque este é ainda um esforço significativo clonagem, montagem Gibson, um novo método para a clonagem de arquétipos de ADN, é used na construção. O método de Gibson pode ser usado para qualquer sequência, independentemente de sítios de restrição (Figura 2) ^12-14. A combinação específica de enzimas permite um único passo, a montagem isotérmico. Neste método, diversas peças de ADN de cadeia dupla linear são concebidos de tal modo que eles têm sequências sobrepostas de ~ 50 pb. A mistura de enzimas montagem Gibson digere parcialmente as partes de ADN lineares, expondo cadeias simples de seqüências homólogas. Estas sequências de cadeia simples parciais são re-recozido na mistura de reacção, resultando em um, de uma etapa, independente da sequência, de reacção rápida subclonagem livre de ligação.

Este trabalho descreve um) projeto racional construções alternativamente emendados para expressão em cloroplastos de plantas, peroxissomos, e citosois, 2) sua clonagem usando o novo método sem ligadura da montagem Gibson, 3) a sua entrega nas células da folha de tabaco com o gene Gun, e 4) Os resultados mostram a segmentação organelo, como observado com a GFPe microscopia confocal.

Protocolo

1. Projeto de Seqüências Alternativamente-emendados para vários Organelle Segmentação

1. Determinar os locais de expressão de proteína final. Para este trabalho, o interesse é na segmentação do cloroplasto, peroxissomo e citosol.
2. Use a literatura para identificar seqüências de proteínas e de DNA conhecidos como alvo proteínas para organelas de interesse. Neste caso, uma sequência de direccionamento a partir de cloroplastos de Arabidopsis thaliana L-isoaspartate metiltransferase ^6,15, e uma sequência de direccionamento de peroxissoma de Arabidopsis thaliana, como a transtirretina-S-alantoína sintase ^16,17 foram determinados.
3. Identificar um regime-splicing alternativo que deve direcionar as proteínas de interesse para as organelas corretas. Para este trabalho, splice sites, observada num sistema de Arabidopsis naturais ^6. A seqüência de mRNA foi redesenhado deixando os locais de splicing naturais, mas as sequências foram colocadas de codificação-cloroplastos ou peroxisome-targeting tags dentro dos íntrons alternativamente-emendados (Figura 1).

2. Assembléia Gibson de Peças de DNA

Veja também a Figura 2.

O método de montagem Gibson depende da ação de várias enzimas em uma mistura pré-fabricados a 1) digerir parcialmente as extremidades do DNA de cadeia dupla de fazer cadeias simples e 2) anneal pares de bases de cortesia da vizinha partes de DNA. Isto permite a clonagem de fragmentos de DNA, sem as limitações de locais de restrição.

1. Escolher uma ordem para os elementos na construção de plasmídeo de ADN. Como exemplo TriTag-1 tem elementos de: a) um vector de plasmídeo (poro, contendo uma construção de GFP conhecido para trabalhar em plantas, um marcador de resistência a canamicina, e origens de replicação para E. coli e Agrobacterium tumefaciens hospedeiros), b) um sequência de promotor, (P _ENTCUP2, expressa constitutivamente em plantas), C) uma sequência de direccionamento do cloroplasto (CTS), c) uma sequência de peroxissoma (PTS), e d alvo) de uma série de locais de união, tal como descrito anteriormente ^6.
2. Projetar o base-para-base de construção com em software de projeto silico. Macaco é um pacote gratuito de código aberto útil para este trabalho.
   Nota: TriTag-1, tem a ordem: plasmídeo vetor, promotor, ATG, local dador, seqüência alvo cloroplasto, área doadora emenda, local neutro, local aceitante emenda, seqüência alvo peroxisome, local aceitante emenda, GFP como contido no plasmídeo vetor .
   1. Projetar o in silico construção de DNA de tal forma que há uma sobreposição de 50 pb entre cada peça ao encomendar primers para PCR. É possível usar a sobreposição de 50 pb, como iniciadores: 25 pb cada direcção.
      1. Certifique-se de manter o controle da origem de cada uma das peças de seqüência. É como: um plasmídeo a ser cultivadas e miniprepped; uma sequência linear que podem ser utilizados como um molde de PCR; ou uma sequência que terá de sersintetizado comercialmente? Várias empresas oferecem serviços de síntese de DNA de baixo custo para os fragmentos <500 pb. Neste caso, o próprio TriTag é de 437 pb, pelo que foi vantajoso por ordem comercialmente.
      2. Os melhores resultados virão se todos os fragmentos são amplificados por PCR e purificou-se a partir deles o DNA molde. O marcador de resistência é um bom local para dividir esta grande de ADN em dois modelos menores, que são mais facilmente amplificado por PCR.
      3. Enzima de restrição Dpnl restrição corta DNA metilado. Se o molde de PCR era uma miniprep de E. coli, o tratamento Dpnl irá remover o ADN molde contaminante.
3. Purificar todas as seqüências de DNA separadamente e eluição em água, TE ou tampão EB.
   1. Pore ​​vetor parte 1, ~ 3000 pb (setas verdes). Amplificado por PCR e Dpnl tratada.
   2. Pore ​​vetor parte 2, ~ 3000 pb (setas pretas). Amplificado por PCR e Dpnl tratada.
   3. TriTag inserção, 437 bp (setas azuis). Ordenada comercialmente. Resuspend em DDH ₂ O.
   4. P _ENTCUP promotor, ~ 750 bp (setas laranja). Amplificado por PCR e Dpnl tratada.
4. Medem-se as concentrações de cada uma das partes de ADN. Apontar para 150 ng / mL das peças vetoriais.
5. Tome uma alíquota do mix montagem Gibson fora do freezer e descongelar em gelo. Isto está comercialmente disponível, mas também simples de fazer no laboratório ^12-14.
   1. Há duas etapas para esta receita: um master mix 5x viscoso e 15 ul alíquotas 1.33x reação porte. A mistura principal 5x contém: 3 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 300 ul de 1 M de _MgCl2, 600 ul de 10 mM de cada dNTP, 300 ul de 1 M DTT, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, e ddH ₂ O 6 ml. Prepare 320 mL alíquotas (18) e congelar todos, mas um a -20 ° C. A solução irá ser bastante viscoso. Rotular essas "tampão isotérmica 5X"
   2. Para o restante (320 mL), adicionar 1,2 mL T5 exonuclease, 20 ul Phusion alta-FIDElity DNA polimerase, 160 uL de Taq ADN ligase e 700 ul ddH ₂ O. Preparar 15 mL alíquotas (~ 80) em gelo em tubos de PCR e armazenar a -20 ° C.
6. Determinar os volumes de quantidades equimolares de cada um dos fragmentos. Existem algumas calculadoras on-line, incluindo Gibthon.org. Deve haver um total de 5 mL de todas as partes de ADN. Adicione-os a 15 mL Gibson misturar alíquota. Se isto requer volumes muito pequenos a pipeta, diluir os fragmentos de DNA e / ou de usar mais do que uma alíquota.
   1. Não se esqueça de preparar um controle do DNA vetor sozinho (por exemplo, a parte do DNA que contém o marcador de resistência a antibióticos) e completar o volume com água.
7. Incubar os tubos num ciclizador térmico a 50-55 ° C durante 30-60 minutos. Substituir no gelo e se transformar em E. coli através de choque térmico células quimicamente competentes. Não use pilhas electrocompetentes. A concentração elevada de sal e a concentração relativamente baixa de ADNpode fazer com que as células de arco.
   1. Aplicar todos os 20 ul de uma preparação comercial de 200 ul de cálcio-cloreto de E. competente coli.
      Incubar em gelo 30 min e choque térmico de 60 seg a 42 ° C
   2. Retornar ao gelo 2 min, aplicar 750 ul de meio LB SOC ou recuperar e agitação num tubo de microcentrifugação de 30 minutos a 37 ° C. Placa da mistura e diluições apropriadas em LB + Kan (ou outro antibiótico apropriado). Isso pode resultar em maior fundo (e um maior número de eventos de recombinação não-alvo) do que o tradicional clonagem baseada ligadura mas vale a pena para a tela cerca de 10 colônias.
8. Confirmar clone através de sequência e armazenar-se uma alíquota a -80 ° C

3. Biobalística transfecção de tabaco com o Gene Gun

Esta é uma técnica que está estabelecida em Jove ^18,19. As principais etapas e as diferenças são descritas a seguir.

1. Crescer 50-100 ml E. coL ou 200 ml de Agrobacterium. A cultura-prep Maxi. Uma concentração de cerca de 1.500 ng / mL é necessário para continuar.
2. Prepare gene arma balas como descrito anteriormente. Coloque-os no Gene Gun.
3. Para a transfecção de Nicotiana benthamiana tabaco tecido foliar da epiderme, escolha uma folha grande perto da base de uma planta de 3 meses de idade. Cortá-la com cuidado e coloque-o lado de baixo para cima em papel-toalha molhada em um prato de 15 centímetros de Petri.
4. Ajuste a pressão Ele para o Gene Gun para 200-250 psi.
5. Procurar com cuidado o Gene Gun entre as nervuras no lado inferior de uma folha, a cerca de 3-5 cm acima dela. Solte a segurança e entregar as partículas para a folha. Cada bala pode ser usada duas vezes no mesmo local sobre a folha. Se as folhas explode, descartar e começar uma nova folha-haja alguma variação na dureza foliar, devido às condições de crescimento, tais como a idade, umidade, etc Para uma folha de 12 cm, à espera de encaixar cerca de 6 tiros.
6. Armazenar a folha, coberto com a parte superior de umPlaca de Petri para 2-3 dias com pouca luz no banco.
7. Examine a folha em um microscópio de dissecação equipado com fluorescência UV, e procurar por células individuais que expressam GFP. Dissecar 5-10 seções mm de folha.
8. Mergulhe a folha em um slide poço profundo microscópio em ~ 200 mL de 0,1% Triton X-100. O detergente ajuda a impedir que as bolhas de ar formando na superfície, e o poço de lâmina de microscópio permite uma área de imagem de tecido maiores.

4. Microscopia confocal do tecido Transfectadas

Estas instruções variam para cada instrumento, por isso é essencial para se devidamente treinado.

1. Para os experimentos de detecção de fluorescência, definir o laser de excitação a 489 nm, e definir os detectores fotomultiplicadores de 500-569 nm para fluorescência da GFP e 630-700 nm para clorofila auto-fluorescência. Células de imagem usando um objetivo de imersão em água 40x.

Resultados

O esforço do projeto foi o resultado de um planejamento significativo. Novel para este projecto é a utilização de processamento alternativo para criar uma pré-ARNm que é traduzido em proteínas diferencialmente expressas. Estas proteínas são expressas em diferentes organelos, neste caso, o cloroplasto, peroxisoma e / ou citoplasma. Foram adaptados gene Arabidopsis natural que é alternativamente emendados ^6, e colocadas conhecido cloroplasto ⁶ e ¹⁷ sequências de direcci...

Discussão

Neste estudo, as estratégias simples são descritos para a localização de uma única proteína transgénica para vários compartimentos celulares em plantas. O objetivo era projetar construção que expressasse um único gene em mais de uma organela em Nicotiana benthamiana. As estratégias incluem desenho racional de construções de DNA baseado em GFP, montagem Gibson, a entrega dos plasmídeos de células da folha com o Gene Gun, e observação dos resultados com a microscopia confocal.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotide primers	IDT	(custom)	Design specifically for construct
GeneBlocks	IDT	(custom)	500 bp oligonucleotides
ApE software	U Utah	(download)	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute kit	Qiagen	28004	Used to purify PCR products
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen	27104	Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid
Phusion Master Mix with GC Buffer	NEB	M0532S	Used to PCR-amplify gene of interest
Gibson assembly reaction mix	NEB	E2611L	Master mix of the following 9 ingredients
1 M Tris-HCl pH7.5	Teknova	T1075	Gibson assembly mix
1 M MgCl2	G Biosiences	82023-086	Gibson assembly mix
dNTP mix	Fermentas	R0192	Gibson assembly mix
1 M DTT	Fermentas	R0861	Gibson assembly mix
PEG-8000	Affymetrix	19966	Gibson assembly mix
NAD	Applichem	A1124,0005	Gibson assembly mix
T5 exonuclease	Epicentre	T5E4111K	Gibson assembly mix
Phusion polymerase	NEB	F530S	Gibson assembly mix
Taq DNA ligase	NEB	M0208L	Gibson assembly mix
Gibthon.org			Website to simplify calculations
Plasmid PLUS Maxi kit	Qiagen	12963	Used to prepare DNA for gene gun bullets
Gene Gun system	BioRad	165-2451	Includes all parts necessary
Nicotania benthamiana	(n/a)	(n/a)	Gift of Jen Sheen, MGH
Confocal microscope	Leica	SP5 X MP	Imaging of resultant cells
Deep well slides	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Used for confocal imaging
A Plasmid Editor (ApE)	University of Utah		http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:Ligation calculator			http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/