JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول باستخدام بحار بوساطة الطفرات ينقول مصغرة himar1 لتوليد مكتبة متحولة عالية الكثافة الإدراج إلى الشاشة، وعزل وتحديد الجينات رواية المنظمين في prototypic الزائفة الزنجارية سلالة PAO1.

Abstract

الزائفة الزنجارية هي سالبة الجرام، بكتيريا البيئية مع قدرات التمثيل الغذائي تنوعا. P. الزنجارية هو الممرض الانتهازية البكتيرية التي تنص على الالتهابات الرئوية المزمن في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF). الافراط في السكاريد المحفظة تسمى الجينات، والمعروف أيضا باسم mucoidy، ويشجع على تشكيل الأغشية الحيوية مخاطي التي هي أكثر مقاومة من خلايا العوالق للعلاج الكيميائي للمضادات الحيوية ودفاعات المضيف. بالإضافة إلى ذلك، التحويل من nonmucoid إلى النمط الظاهري مخاطي هو علامة السريرية لظهور عدوى مزمنة في CF. الإفراط الجينات التي كتبها P. الزنجارية هي عملية ماص للطاقة التي ضرائب ثقيلة على الطاقة الخلوية. لذلك، يتم تنظيم الجينات في إنتاج عالية P. الزنجارية. من أجل فهم أفضل تنظيم الجينات، وصفنا بروتوكول باستخدام مصغرة himar1 ينقول الطفرات لتحديد الجينات منظم الروايةق في سلالة PAO1 prototypic. يتكون هذا الإجراء من خطوتين أساسيتين. أولا، ونقل ينقول مصغرة himar1 (pFAC) من المضيف E. القولونية SM10/λpir إلى المتلقي P. الزنجارية PAO1 عبر اقتران متحدر من والدين لإنشاء مكتبة متحولة عالية الكثافة الإدراج، والتي تم اختيارها على لوحات الزائفة عزلة أجار تستكمل مع الجنتاميسين. ثانيا، نحن فحص وعزل مستعمرات مخاطية لرسم خريطة للموقع من خلال الإدراج العكسية PCR باستخدام بادئات الحمض النووي لافتا إلى الخارج من الكاسيت الجنتاميسين وتسلسل الحمض النووي. باستخدام هذا البروتوكول، حددنا اثنين من المنظمين رواية الجينات، mucE (PA4033) وkinB (PA5484)، في سلالة PAO1 مع البرية من نوع mucA ترميز عامل مكافحة سيغما MucA للسيد الجينات منظم ALGU (AlgT، σ 22) . يمكن تعديل هذا البروتوكول الطفرات الإنتاجية العالية لتحديد الجينات الأخرى ذات الصلة الفوعة تسبب تغيير في كولونيويورك التشكل.

Introduction

قدرة الانتهازية، الممرض سالبة الجرام الزائفة الزنجارية لتحفيزه على إنتاج الجينات هو أحد العوامل الرئيسية في قدرتها على إنشاء بيوفيلم. الافراط في الجينات هو النمط الظاهري غالبا ما يشار إليها باسم mucoidy. عزل مستعمرات مخاطية من sputa الأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) يدل على وجود عدوى مزمنة، ويرتبط مباشرة مع الانخفاض العام في صحة المريض 1. حاليا، فمن المفهوم أن تنظيم وإنتاج الجينات في P. الزنجارية يحدث في المقام الأول على اثنين من operons. الأول هو الاوبرون السكروز الجينات، والذي يحتوي على 12 الجينات (algD - alg8 - alg44 - algK - الالم - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - الطحالب) التي هي المسئولة عن تصنيع وتصدير البوليمر الجينات عبر والجبلة المحيطية إلى خارج الخلية environmeالإقليم الشمالي 2-5. والاوبرون الثاني هو مجموعة من الجينات التي تبدأ مع عامل سيغما بديل ALGU / T والمستمر مع mucA، mucB، وmucD. ALGU / T هو منظم إيجابية، في حين تصنف mucAB-D كما المنظمين السلبية لإنتاج الجينات 6-8. بالإضافة إلى ذلك، والمنظمين النسخي، مثل AlgB، AlgQ، الغر، وRpoN، وكذلك في مرحلة ما بعد النسخي وتعديل آخر متعدية عن طريق التحكم القمع مقيضة، والنشاط كيناز (KinB) والتحلل البروتيني intramembrane، وأيضا ثبت أن تشارك في الجينات تنظيم 9-14.

تم إنشاء ينقول ناقلات صغيرة himar1 المعروفة باسم pFAC أصلا في مختبر الدكتور Mekalanos 'في كلية هارفارد الطبية 15. يتكون البلازميد pFAC عنصر القابلة للنقل يحيط بها اثنان يكرر مقلوب من 27 نقطة أساس وكاسيت الجنتاميسين المقاومة في الوسط (aacC1: 534 بي بي)، جين ترميز hyperactإيف transposase مارينر 16، والجينات ترميز β-اكتاماز (بلوخ) (الشكل 1). تسلسل المعلومات عن العنصر القابلة للنقل من pFAC متاح في عدد انضمام بنك الجينات: DQ366300 13. في pFAC، هناك موقع استنساخ متعددة (MCS) وراء الجينات aacC1 والذي يستخدم لتحديد موقع الإدراج الكروموسومات باستخدام العكسية PCR. واحدة ميزة كبيرة مع استخدام ينقول مصغرة himar1 هو ليس هناك حاجة لعوامل المضيف محددة للتبديل (الطفرات). بالإضافة إلى ذلك، هناك وفرة عالية من TA المواقع الإدراج ثنائي النوكليوتيد جدت في جميع أنحاء الجينوم من P. الزنجارية. على سبيل المثال، TA المواقع ثنائي النوكليوتيد الإدراج يحدث و94404 100229 مرات في PAO1 (6264404 بت في الثانية، بنك الجينات عدد الانضمام NC_002516.2) وPA14 (6537648 بت في الثانية؛ رقم الوصول بنك الجينات NC_008463) الجينوم، على التوالي. بسبب وفرة من TA ثنائي النوكليوتيد في الجينوم، ميني himar1 ينقول يمكن أن يسبب عالية الكثافة والطفرات العشوائية، والتي هي مناسبة خاصة لتحليل الجينات الفوعة والجينات التي تنظم للغاية. نظريا، يمكن للينقول مصغرة himar1 إدراجها في أي الجينات غير الضرورية داخل جينوم P. الزنجارية. وهذا يوفر مواقع الإدراج TA حوالي 18 في إطار القراءة المفتوح في الجينوم PAO1.

هنا، نحن تصف البروتوكول باستخدام مصغرة himar1 بوساطة الطفرات ينقول لتحديد المنظمين رواية mucoidy في P. الزنجارية. وبشكل أكثر تحديدا، ونحن مترافق biparentally متجه pFAC تحتوي على ينقول مصغرة himar1 من E. القولونية SM10/λpir في nonmucoid أنموذجية التغذي سلالة PAO1. بعد دمج ينقول في الجينوم، سلالة المتلقي هو مثقف على الزائفة عزلة أجار (PIA) التي تحتوي على التريكلوسان الذي يمنع نمو E. القولونية. وبالتالي، مكتبة من المسوخ من P. يمكن اختيار الزنجارية من النمو على PIA وحة تستكمل مع الجنتاميسين وجود النمط الظاهري مخاطي. ملاحظة، صحيح سوف مقابل ومتحولة التكامل بوساطة ينقول يكون النمط الظاهري المقاومة والحساسة للكربنيسيلين الجنتاميسين. في هذه الدراسة، تم عزل ما يقرب من 80،000 من المسوخ الإدراج PAO1 من خلال أربعة الإقتران منفصلة. نحن بعد ذلك فرزها لعزلات مخاطي، وتحديد موقع من قبل الإدراج تقييد انزيم الهضم، وربط والعكسية PCR. أجرينا تحليل لطخة الجنوبية باستخدام المقاومة كاسيت الجنتاميسين كما تحقيقا لرؤية عدد من الإدراج في الجينوم. توصلنا إلى أن أكثر من 90٪ من المسوخ التي تم الحصول عليها في الاقتران باستخدام هذا البروتوكول لم يحصل إلا على نسخة واحدة من himar1 في الجينوم وعرض النمط الظاهري المقاومة والحساسة للكربنيسيلين الجنتاميسين. وقد تم تحديد ما مجموعه 32 عزلات مخاطي، تم تعيين 22 منهم إلى مواضع مختلفة من P. الزنجارية PAO1كروموسوم. هذا المعدل من الإدراج توفر تغطية كافية لتحديد العديد من المنظمين رواية من الإفراط الجينات.

Protocol

1. إعداد سلالات البكتيرية ومتحدر من والدين إختبارات

  1. تطعيم E. القولونية SM10/λpir/pFAC في 5 مل من مرق لوريا (LB) تستكمل مع 15 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين ومكان في حاضنة تهتز بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. تطعيم P. الزنجارية سلالة PAO1 في 5 مل من LB، ومكان في حاضنة تهتز بين عشية وضحاها في 42 درجة مئوية.
  3. قياس OD 600 من الثقافات بين عشية وضحاها وتخلط كميات متساوية من PAO1 وE. القولونية pFAC مثل أن الحجم النهائي بين 1-1،4 مل.
  4. خليط أجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. وفي الوقت نفسه، تجف لوحات LB للاقتران: ترك لوحات مفتوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
  6. إزالة كافة ولكن 50 ميكرولتر من طاف من خليط الخلية.
  7. resuspend الكرية خلية في 50 ميكرولتر المتبقية من طاف وماصة على لوحة LB جافة في قطرة واحدة مدمجة.
  8. وضع بعناية لوحة في غطاء الدخان لتجف (IMPORTANT ملاحظة: لا تدع خلايا موزعة على اللوحة، وهذا سوف يقلل بشكل كبير من كفاءة تصريف الافعال).
  9. مرة واحدة الحبرية جافة، عكس لوحة LB واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة.
  10. في حين أن خليط الخلايا واحتضان، وإعداد كبيرة (150 OD × 15 مم) لوحات مع PIA 300 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. قبل الاستخدام، وإزالة أي الرطوبة المتبقية عن طريق وضع في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
  11. بعد الحضانة من الخليط خلية كاملة، وجمع الخلايا باستخدام التلقيح حلقة عقيمة وفي أنبوب microcentrifuge تحتوي على 1 مل LB ودوامة، أو ماصة، لتخلط جيدا.
  12. تنتشر الخلايا بالتساوي على لوحات كبيرة تحتوي على PIA 300 ميكروغرام / مل جنتاميسين. (هام: للحصول على هذه الخطوة، فمن الأفضل لإضافة كميات متزايدة من خليط الخلية لفصل الصفائح (مثل لوحة 1: 10 ميكرولتر، لوحة 2: 50 ميكرولتر، لوحة 3: 100 ميكرولتر، لوحة 4: 500 ميكرولتر، الخ) .
  13. احتضان بين عشية وضحاها في 37° C.

2. كشف وعزل المستعمرات موكويد

  1. إزالة لوحات من الحاضنة ودراسة للمستعمرات مخاطية.
  2. عزل مستعمرة مخاطي واحد ومتتالية للعزلة على لوحات صغيرة (100 OD × 10 ملم) مع PIA و 300 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين.
  3. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  4. كرر الخطوة 2.2 على الثقافة بين عشية وضحاها السابقة.
  5. كرر الخطوات من 2،2-2،4 مرتين أخريين لتحديد استقرار عزل مخاطي.
  6. بعد الخطوة عزل النهائي، تطعيم 4.5 مل من LB مع مستعمرة مخاطي واحد واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر في 37 درجة مئوية.
  7. اليوم التالي، والتسمية 3 أنابيب microcentrifuge لكل متحولة مخاطي.
  8. إعداد اثنين من 1.25 مل aliquots من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 2 أنابيب لاستخراج الحمض النووي الجيني وتحديد الموقع ينقول الإدراج (انظر البروتوكول 3).
  9. بالإضافة إلى ذلك، أرشفة كل متحولة مخاطي من قبل pipetting 1 مل الثقافة بين عشية وضحاها إلى appropriatcryovial المسمى اعل المحتوية على حجم مساو من 10٪ الحليب الخالي من الدسم. المحل في -86 درجة مئوية.

3. gDNA تقييد الهضم وربط

  1. استخراج gDNA من متحولة مخاطي باستخدام أي أسلوب المفضل (على سبيل المثال. الفينول كلوروفورم، عمود الدوران، الخ).
  2. تحديد تركيز gDNA، هضم ما مجموعه 2 ميكروغرام مع 1 ميكرولتر من نوكلياز داخلية تقييد سالي، 0.5 ميكرولتر من ألبومين المصل البقري، 5 ميكرولتر من العازلة سالي انزيم (100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 10 ملي MgCl 2 ، 1 ملم Dithiothrietol (DTT)، ودرجة الحموضة 7.9 في درجة حرارة الغرفة)، وحجم مناسب من DH 2 O لتحقيق إجمالي حجم 50 ميكرولتر.
  3. هضم الحمض النووي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. (هام: اعتمادا على كفاءة انزيم التقييد، فإنه قد يكون من الضروري إضافة 1 ميكرولتر إضافية للهضم واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة هذا بالإضافة إلى ملخص ليلة وضحاها.)
  4. تنقية DIGEالحمض النووي STED باستخدام أي أسلوب المفضل (مثل الاغاروز هلام تنقية، والأعمدة تدور) وأزل مع 25 ميكرولتر من العازلة.
  5. Ligate الحمض النووي يهضم عن طريق خلط 11 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى مع التركيز المفضل لل~ 10-20 نانوغرام / ميكرولتر، 1.5 ميكرولتر من العازلة ربط (330 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5 خلات، 660 ملي خلات البوتاسيوم، المغنيسيوم خلات 100 ملم، 5 ملم DTT)، 1.5 ميكرولتر من 100 ملي ATP و 1 ميكرولتر الحمض النووي يغاز.
  6. احتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم تعطيل انزيم التي يحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية. (ملاحظة: احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة أطول قد تزيد من نجاح عملية ربط).

4. العكسية PCR (iPCR) وتحليل تسلسل

  1. أداء iPCR على المنتج ربط باستخدام التالية إلى الأمام وعكس الاشعال والتدوير الحراري thermocycling الشروط:
    إلى الأمام التمهيدي (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
    -عكسي التمهيدي (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
    Thermocycler كونديستعقد:
    1. 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    2. 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. 58 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    4. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    5. 72 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
    6. 10 ° C الانتظار.
    كرر الخطوات من 2-4 لمدة 34 دورات.
    (ملاحظة: يمكن تخزين المنتجات أسهب iPCR في 4 درجات مئوية)
  2. أداء الاغاروز الكهربائي للهلام لتأكيد نجاح iPCR التضخيم.
  3. أداء التسلسل على المنتج iPCR باستخدام Gm3OUT وGm5OUT الاشعال. يتم تعيين موقع الإدراج وتوجه himar1 بها.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 1، وبحار ينقول ناقلات صغيرة himar1، pFAC، يحتوي على اثنين من 27 سنة مضت يكرر مقلوب مع مواقع الإدراج TA المرافقة المقاومة aacC1 الجنتاميسين كاسيت، مع σ المروج 70 التابعة لها، وموقع الاستنساخ متعددة (MCS). بالإضافة إلى ذلك، يحتوي pFAC ناقل...

Discussion

من المهم أن نلاحظ أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في الأنواع الأخرى الزائفة مع هذه التعديلات: احتضان P. المتألقة وP. الكريهة عند 30 درجة مئوية، وP. الشتوتسرية في 42 درجة مئوية، P. stuzeri ينبغي مثقف على لوحات LB تستكمل مع 150 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين؛ على خط...

Disclosures

المؤلف هونغ وى D. يو هو موظف العلوم رئيس وأحد مؤسسي تكاثر مبكر تكنولوجيز، ذ.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل الوطنية للملاحة الجوية والفضاء إدارة ولاية فرجينيا الغربية الفضاء غرانت اتحاد (ناسا WVSGC)، ومؤسسة التليف الكيسي (CFF-YU11G0) والمعاهد الوطنية للصحة وP20RR016477 P20GM103434 لشبكة فكرة ولاية فرجينيا الغربية للتميز بحوث الطبية الحيوية. نشكر Vonya M. Eisinger للمساعدة التقنية مع هذا العمل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothDifco240230via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agarDifco292710via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)Fisher Scientific08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)Fisher Scientific08-757-14
GlycerolFisher ScientificBP229-4
Benchtop Shaking IncubatorNew Brunswick ScientificInnova 4080shake at 200 rpm
Cabinet IncubatorVWR1540
Benchtop MicrocentrifugeSorvall75-003-287via Fisher Scientific
SmartSpec Plus SpectrophotometerBio-Rad170-2525or preferred method/vendor
Diposable Inoculation LoopsFisher Scientific22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge TubesFisher Scientific05-408-129
2.0 ml Cryogenic VialsCorning430659via Fisher Scientific
15 ml TubesFisher Scientific05-539-12
Skim MilkDifcoDF0032-17-3via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250) Qiagen69506or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)Qiagen28106or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen27106or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation KitEpicentre TechnologiesLK6201Hvia Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath LabnetNC0205808via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonucleaseNew England BioLabsR0138L
EasyStart Micro 50Molecular BioProducts6020via Fisher Scientific
Taq DNA PolymeraseNew England BioLabsM0267L
iCycler, ThermocyclerBio-Rad170-8740
LE agaroseGenemate3120-500via Fisher Scientific
Gentamycin SulfateFisher ScientificBP918-1
2.0 ml Cryogenic VialsCorning430659via Fisher Scientific

References

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
  2. Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
  3. Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
  4. Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
  5. Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
  6. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).. J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
  7. Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
  8. Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
  9. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
  10. Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
  11. Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
  12. Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
  13. Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
  14. Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
  15. Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
  16. Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

85 mucoidy himar1 pFAC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved