זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon ספן מיני himar1 ליצירת ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה למסך, לבודד ולזהות רגולטורים אלגינט רומן בPAO1 מתח Pseudomonas aeruginosa אב הטיפוס.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק גראם שלילי, סביבתי עם יכולות מטבוליות צדדי. פ aeruginosa הוא פתוגן חיידקים אופורטוניסטי הקובע דלקות ריאה כרוניות בחולי סיסטיק פיברוזיס (CF). ייצור יתר של פוליסכריד קופסית נקרא אלגינט, הידוע גם mucoidy, מקדם את הקמתה של biofilms רירני שהם עמידים יותר מאשר תאי פלנקטון לכימותרפיה אנטיביוטיקה והגנה מארחת. בנוסף, ההמרה מnonmucoid לפנוטיפ רירני היא סמן קליני לתחילתה של דלקת כרונית בCF. ייצור יתר אלגינט על ידי פ ' aeruginosa הוא תהליך endergonic מיסי אנרגיה בתאים כבד. לכן, ייצור אלגינט מוסדר מאוד בפ aeruginosa. כדי להבין טוב יותר רגולציה אלגינט, אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis transposon מיני himar1 לזיהוי רגולטור אלגינט רומןים בPAO1 זן אב טיפוס. ההליך מורכב משני שלבים בסיסיים. ראשית, העברנו את transposon מיני himar1 (pFAC) מהמארח א coli SM10/λpir לנמען P. aeruginosa PAO1 באמצעות נטיית biparental ליצור ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה, אשר נבחרו על צלחות אגר בידוד Pseudomonas בתוספת gentamycin. שנית, אנו הוקרנו ובודדנו את מושבות רירני למפה אתר ההחדרה באמצעות PCR ההפוך באמצעות פריימרים DNA מצביעים החוצה מקלטת gentamycin ורצפי DNA. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו שני רגולטורים רומן אלגינט, mucE (PA4033) וkinB (PA5484), בPAO1 מתח עם mucA פראי מסוג קידוד הגורם אנטי סיגמא MucA לרגולטור אלגינט מאסטר AlgU (AlgT, σ ²²⁾ . פרוטוקול mutagenesis תפוקה גבוהה זה יכול להיות שונה לזיהוי גנים הקשורים לאלימות אחרים הגורם לשינוי בקולומורפולוגיה ניו יורק.

Introduction

היכולת של האופורטוניסטי, הפתוגן גראם השלילי Pseudomonas aeruginosa לoverproduce אלגינט היא גורם מרכזי ביכולתה להקים biofilm. ייצור יתר של אלגינט הוא הפנוטיפ המכונה לעתים קרובות כmucoidy. הבידוד של מושבות רירני מספוטה של אנשים לוקים בסיסטיק פיברוזיס (CF) הוא מעיד על זיהום כרוני, והיא קשור באופן ישיר עם ירידה כללית בבריאותו של החולה ^1. נכון לעכשיו, הוא הבין כי הרגולציה וייצור של אלגינט בפ aeruginosa מתרחש בעיקר בשני operons. הראשון הוא אופרון biosynthetic אלגינט, המכיל 12 גנים (algD - alg8 - alg44 - algK - alge - algG - algX - algL - algI - algJ - algF - אצה) שאחראים לסינתזה והיצוא של פולימר אלגינט פני periplasm לenvironme תאיNT ^2-5. אופרון השני הוא אשכול גנים החל עם גורם סיגמא האלטרנטיבי algU / T וממשיך בmucA, mucB, וmucD. AlgU / T הוא רגולטור חיובי, בעוד mucAB-D מסווגים כרגולטורים שליליים של ייצור אלגינט ^6-8. בנוסף, רגולטורים תעתיק, כגון AlgB, AlgQ, AlgR, וRpoN, כמו גם לאחר תעתיק ושינוי שלאחר translational על ידי שליטת catabolite דיכוי, פעילות קינאז (KinB) וproteolysis intramembrane, יש גם הוכחו להיות מעורבים באלגינט הרגולציה ^9-14.

וקטור transposon מיני himar1 המכונה pFAC נוצר במקור במעבדה של ד"ר Mekalanos בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד ^15. פלסמיד pFAC מורכב מאלמנט transposable המוקף שתי חזרות הפוכות של 27 bps וקלטת gentamycin התנגדות באמצע (aacC1: 534 נ"ב), גן מקודד hyperactive transposase ספן ^16, וβ-lactamase גן קידוד (בלה) (איור 1). מידע רצף עבור אלמנט transposable של pFAC זמין במספר הצטרפות GenBank: ¹³ DQ366300. בpFAC, יש אתר שיבוט מרובה (MCS) מאחורי גן aacC1 המשמש לזיהוי של אתר ההכנסה כרומוזומליות באמצעות PCR ההפוך. אחד יתרונות גדולים בשימוש בtransposon מיני himar1 אין גורמי מארח ספציפיים נדרשים לטרנספוזיציה (mutagenesis). בנוסף, יש שפע גבוה של החדרת אתרי dinucleotide ת"א נמצאים בכל הגנום של פ aeruginosa. לדוגמא, אתרי החדרת dinucleotide ת"א מתרחש 94,404 ו100,229 פעמים בPAO1 (6,264,404 bps, מספר הצטרפות GenBank NC_002516.2) וPA14 (6,537,648 bps; מספר גישת GenBank NC_008463) הגנום, בהתאמה. בגלל השפע של dinucleotide ת"א בגנום, מיני himar1 Transposon יכול לגרום לצפיפות גבוהה וmutagenesis האקראי, שהוא מתאים במיוחד לניתוח של גנים ארסיות והגנים שקבועים בתקנות. באופן תיאורטי, transposon מיני himar1 יכול להכניס לתוך כל גן חיוני בתוך הגנום של פ aeruginosa. זה מספק כ 18 אתרי החדרה ת"א לכל מסגרת קריאה פתוחה בגנום PAO1.

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon מיני himar1 לזהות רגולטורים רומן של mucoidy בפ aeruginosa. באופן ספציפי יותר, אנו biparentally מצומדת וקטור pFAC מכיל transposon מיני himar1 מE. coli SM10/λpir לPAO1 מתח prototrophic nonmucoid. לאחר transposon משולב בגנום, מתח הנמען הוא תרבית על אגר בידוד Pseudomonas טריקלוזן (PIA) המכיל אשר מעכב את הצמיחה של E. coli. לפיכך, ספרייה של מוטציות של פ ניתן לבחור aeruginosa על ידי הגידול בצלחת PIA בתוספת gentamycin ואת הנוכחות של פנוטיפ רירני. שים לב, לעומת מוטציה אינטגרציה בתיווך transposon יהיה אמיתי הפנוטיפ עמיד וcarbenicillin רגיש gentamycin. במחקר זה, כ -80,000 מוטציות החדרת PAO1 היו מבודדות באמצעות ארבעה פעלים נפרדים. אנחנו מכן הוקרנו מבודדים רירני, וקבענו את האתר של הכנסה על ידי עיכול אנזים הגבלה, קשירה והפוכה ה-PCR. ביצענו ניתוח כתם דרום באמצעות קלטת התנגדות gentamycin כמו בדיקה כדי לראות את המספר של החדרה לגנום. אנחנו קבענו כי יותר מ 90% ממוטציות שהושגו לנטיית שימוש בפרוטוקול זה היה עותק אחד בלבד של himar1 בגנום ומוצגים הפנוטיפ עמיד וcarbenicillin רגיש gentamycin. כולל של 32 מבודדים רירני זוהו, 22 שלהם מופו ללוקוסים של פ שונים aeruginosa PAO1כרומוזום. שיעור זה של הכנסה מספק כיסוי הולם לזהות כמה רגולטורים רומן של ייצור יתר אלגינט.

Protocol

1. הכנה של זני חיידקים וBiparental נטיה

1. לחסן E. coli SM10/λpir/pFAC ב 5 מיליליטר של מרק לוריא (LB) בתוספת 15 מיקרוגרם / מיליליטר של gentamycin ומקום בחממה רועדת הלילה בשעה 37 ° C.
2. לחסן פ PAO1 aeruginosa המתח ב 5 מיליליטר של LB, ומקום בחממה רועדת הלילה בשעה 42 ° C.
3. מדוד OD ₆₀₀ של תרבויות לילה ולערבב כמויות שווה של PAO1 וא coli pFAC כך שהנפח הסופי הוא בין 1-1.4 מיליליטר.
4. תערובת צנטריפוגה ב 6,000 XG במשך 5 דקות.
5. בינתיים, ייבוש צלחות LB לנטייה: להשאיר צלחות פתוחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
6. הסר את כל אבל 50 μl של supernatant מתערובת תא.
7. Resuspend התא גלולה ב μl 50 הנותר של supernatant וטפטף על צלחת LB יבשה בטיפה אחת קומפקטית.
8. למקם את הצלחת בזהירות במנדף לייבוש (impoהערה RTANT: אל תתנו לתאים משתרעים על פני הצלחת, זה יהיה להקטין באופן משמעותי את היעילות של נטיה).
9. ברגע שרביב הוא יבש, להפוך את צלחת LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות.
10. בעוד תערובת התא היא דוגרת, להכין צלחות פיא (150 OD x 15 מ"מ) גדולות עם 300 מיקרוגרם / מיליליטר של gentamycin. לפני השימוש, הסר את כל לחות שיורית על ידי הצבת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות.
11. לאחר הדגירה של תערובת התא היא מלאה, לאסוף את התאים באמצעות לולאת חיסון סטרילי ובצינור microcentrifuge המכיל 1 מיליליטר LB ומערבולת, או פיפטה, לערבב ביסודיות.
12. מורחים את התאים באופן שווה על גבי צלחות PIA הגדולות מכילות 300 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin. (חשוב: לצעד זה, עדיף להוסיף כמויות הולך וגדל של תערובת התאים להפריד צלחות (למשל פלייט 1: 10 μl, 2 פלייט: 50 μl, צלחת 3: 100 μl, צלחת 4: 500 μl, וכו ') .
13. דגירה הלילה בשעה 37° C.

2. זיהוי ובידוד של מושבות רירני

1. הסר את הצלחות מן החממה ולבחון למושבות רירני.
2. לבודד מושבה רירני יחידה ופס לבידוד על צלחות קטנות (100 OD x 10 מ"מ) עם PIA ו300 / מיליליטר מיקרוגרם של gentamycin.
3. דגירה הלילה בשעה 37 ° C.
4. חזור על שלב 2.2 על תרבות הלילה הקודמת.
5. חזור על שלבים 2.2-2.4 עוד פעמיים כדי לקבוע את היציבות של בודד רירני.
6. לאחר שלב בודד סופי, לחסן 4.5 מיליליטר של LB עם מושבה רירני יחידה ודגירה שבייקרה לילה בשעה 37 ° C.
7. למחרת, תווית 3 microcentrifuge צינורות עבור כל מוטציה רירני.
8. הכן שני 1.25 aliquots מיליליטר של תרבות הלילה ל -2 צינורות להפקת DNA גנומי וזיהוי של אתר הכנסת transposon (ראה פרוטוקול 3).
9. בנוסף, בארכיון בכל מוטציה רירני ידי pipetting 1 מיליליטר תרבות הלילה לתוך appropriatcryovial איליי שכותרת המכילה נפח שווה של 10% חלב דל שומן. חנות ב -86 ° C.

3. הגבלת gDNA עיכול וקשירה

1. לחלץ gDNA ממוטצית רירני באמצעות כל שיטה מועדפת (לדוגמא. פנול, כלורופורם, טור ספין, וכו ').
2. קבע את הריכוז של gDNA, לעכל כולל של 2 מיקרוגרם עם 1 μl של endonuclease ההגבלה סאלי, 0.5 μl של אלבומין בסרום שור, 5 μl של חיץ אנזים סאלי (100 mM NaCl, 50 מ"מ טריס-HCl, 10 מ"מ MgCl ₂ , 1 מ"מ Dithiothrietol (DTT), pH 7.9 בטמפרטורת חדר), והנפח המתאים של DH ₂ O להשיג בנפח כולל של 50 μl.
3. לעכל דנ"א לילה בשעה 37 ° C. (חשוב:. בהתאם ליעילות של אנזים ההגבלה, ייתכן שיהיה צורך להוסיף μl 1 נוסף כדי לעכל הלילה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות זאת בנוסף לתקציר בלילה.)
4. לטהר את DIGEה-DNA STED באמצעות כל שיטה מועדפת (לדוגמא טיהור agarose ג'ל, עמודות ספין) וelute עם 25 μl של חיץ.
5. ולקשור את ה-DNA מתעכל על ידי ערבוב 11 μl של DNA מטוהר עם ריכוז המועדף על ~ 10-20 ng / μl, 1.5 μl של קשירת חוצץ (330 pH מ"מ טריס-אצטט 7.5, 660 אצטט mM אשלגן, מגנזיום 100 אצטט מ"מ, 5 מ"מ DTT), 1.5 μl של 100 מ"מ ATP ואנזים דנ"א μl 1.
6. דגירה את התערובת ל15 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן להשבית את האנזים על ידי דוגרים ל15 דקות ב 70 ° C. (הערה: דוגרים את התערובת בטמפרטורת חדר למשך זמן ארוך יותר עשוי להגדיל את ההצלחה של קשירה).

4. PCR ההפוך (iPCR) ורצף ניתוח

1. בצע iPCR על מוצר קשירה באמצעות הפעולות הבאות קדימה לאחור פריימרים וthermocycling תנאים:
   קדימה פריימר (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
   -ההפוך פריימר (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
   Thermocycler קונדיtions:
   1. C ° 94 דקות 1.
   2. C ° 94 דקות 1.
   3. C ° 58 למשך 2 דקות.
   4. C ° 72 למשך 2 דקות.
   5. C ° 72 במשך 8 דקות.
   6. אחיזת C ° 10.
   חזור על השלבים 2-4 ל34 מחזורים.
   (הערה: ניתן לאחסן מוצרי Amplified iPCR ב 4 ° C.)
2. בצע ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה iPCR מוצלחת.
3. לבצע רצף על מוצר iPCR באמצעות פריימרים Gm3OUT וGm5OUT. אתר ההכנסה ואת הכיוון של himar1 ממופים החוצה.

תוצאות

כפי שמודגם באיור 1, וקטור transposon ספן מיני himar1, pFAC, מכיל שתי חזרות הפוכות 27 נ"ב עם אתרי החדרת ת"א איגוף קלטת התנגדות gentamycin aacC1, עם האמרגן שלה σ ⁷⁰ תלוי, ואתר מרובה שיבוט (MCS). בנוסף, וקטור pFAC מכיל גנים המקודדים את transposase הפעיל מאוד himar1, β-lactamase <...

Discussion

חשוב לציין כי בשיטה זו ניתן להשתמש במינים Pseudomonas אחרים עם השינויים הבאים: דגירה פ fluorescens ו פ putida ב30 מעלות צלזיוס, ופ stutzeri על 42 מעלות צלזיוס; פ stuzeri צריך להיות מתורבת על צלחות LB בתוספת 150 מיקרוגרם / מ"ל של gentamycin; על צעד 1.11, פ תאי stutzeri צריכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 ml Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific