Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilizzo Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesi Mariner Transposon-mediata

Riepilogo

Qui si descrive un protocollo con il mini-himar1 mariner trasposone-mediata mutagenesi per generare una libreria mutante inserimento ad alta densità per schermo, isolare ed identificare i regolatori alginato romanzo nel prototipo Pseudomonas aeruginosa ceppo PAO1.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo, batterio ambientale con versatili capacità metaboliche. P. aeruginosa è un batterio patogeno opportunista che stabilisce le infezioni polmonari croniche in pazienti con fibrosi cistica (CF). La sovrapproduzione di un polisaccaride capsulare chiamato alginato, noto anche come mucoidy, promuove la formazione di biofilm mucoide che sono più resistenti rispetto alle cellule planctoniche alla chemioterapia antibiotica e difese dell'ospite. Inoltre, la conversione dal nonmucoid al fenotipo mucoide è un marcatore clinico per l'insorgenza di infezione cronica in CF. Sovrapproduzione alginato di P. aeruginosa è un processo ergoniche che tassa pesantemente energia cellulare. Di conseguenza, la produzione di alginato è altamente regolamentato in P. aeruginosa. Per capire meglio regolamentazione alginato, si descrive un protocollo utilizzando il mini-himar1 trasposone mutagenesi per l'identificazione di regolatore alginato romanzos in un ceppo PAO1 prototipo. La procedura si compone di due fasi fondamentali. In primo luogo, abbiamo trasferito il trasposone mini-himar1 (pFAC) dall'host E. coli SM10/λpir in destinatario P. aeruginosa PAO1 via coniugazione biparental per creare una libreria di mutante inserimento ad alta densità, che sono stati selezionati su piastre di isolamento di Pseudomonas agar addizionato con gentamicina. In secondo luogo, abbiamo proiettato e isolate colonie mucoidi per mappare il sito di inserimento attraverso inversa PCR usando primer DNA puntano verso l'esterno dal cassetto gentamicina e sequenziamento del DNA. Usando questo protocollo, abbiamo identificato due nuovi regolatori di alginato, MUCE (PA4033) e kinB (PA5484), in ceppo PAO1 con una wild-type Muca che codifica per il fattore anti-sigma Muca per il regolatore di alginato maestro AlgU (ALGT, σ ²²⁾ . Questo protocollo mutagenesi ad alta produttività può essere modificato per l'identificazione di altri geni di virulenza legate causando variazione colony morfologia.

Introduzione

La capacità del opportunistica, patogeno Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa produrre in eccesso alginato è un fattore importante nella sua capacità di stabilire un biofilm. La sovrapproduzione di alginato è un fenotipo spesso indicato come mucoidy. L'isolamento di colonie mucoidi dal espettorati di individui affetti da fibrosi cistica (CF) è indicativo di una infezione cronica, ed è direttamente associata ad un declino generale della salute del paziente ^1. Attualmente, resta inteso che la regolazione e la produzione di alginato in P. aeruginosa si verifica principalmente a due operoni. Il primo è l'operone biosintetica alginato, che contiene 12 geni (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - algX - algL - Algi - algJ - algF - Alga), che sono responsabili per la sintesi e l'esportazione del polimero alginato di tutti periplasma al environme extracellularent ^2-5. Il secondo operone è un cluster di geni che inizia con il fattore sigma alternativo algU / T e continuando con muca, mucB, e mucD. AlgU / T è un regolatore positivo, mentre mucAB-D sono classificati come regolatori negativi della produzione alginato ^6-8. Inoltre, regolatori trascrizionali, come ALGB, AlgQ, ALGR, e RpoN, così come post-trascrizionale e modificazione post-traslazionale dal controllo repressione da cataboliti, l'attività chinasi (KinB) e proteolisi intramembrane, hanno anche dimostrato di essere coinvolti in alginato regolamentazione ^9-14.

Il trasposone vettore mini-himar1 noto come pFAC è stato originariamente creato nel laboratorio Dr. Mekalanos 'presso la Harvard Medical School ^15. Il plasmide pFAC consiste di un elemento trasponibile fiancheggiato da due ripetizioni invertite di 27 bps e una cassetta gentamicina resistenza nel mezzo (aacC1: 534 bp), un gene che codifica la hyperactive transposase mariner ^16, e un gene codificante β-lattamasi (bla) (Figura 1). Informazioni di sequenza per l'elemento trasponibile di pFAC è disponibile al numero di accesso GenBank: DQ366300 ^13. In pFAC, c'è un sito di clonazione multipla (MCS) dietro il gene aacC1 che viene utilizzato per l'identificazione del sito di inserzione cromosomico mediante PCR inversa. Uno dei principali vantaggi con l'utilizzo del trasposone mini-himar1 è alcuna fattori dell'ospite specifici sono necessari per il recepimento (mutagenesi). Inoltre, vi è grande abbondanza dei TA dinucleotidici siti di inserzione trovati in tutto il genoma del P. aeruginosa. Ad esempio, TA siti di inserzione dinucleotide si verifica 94.404 e 100.229 volte in PAO1 (6.264.404 bps, GenBank numero di accesso NC_002516.2) e PA14 (6.537.648 bps, il numero di accesso GenBank NC_008463) genomi, rispettivamente. A causa della abbondanza di TA dinucleotide nel genoma, mini-himar1 Trasposone può causare l'alta densità e mutagenesi casuale, che è particolarmente adatto per l'analisi di geni di virulenza e geni che sono altamente regolamentati. Teoricamente, il trasposone mini-himar1 può inserire in qualsiasi gene non essenziale all'interno del genoma di P. aeruginosa. Questo fornisce circa 18 TA siti di inserzione per fase di lettura aperta nel genoma PAO1.

Qui, descriviamo un protocollo con mini-himar1 trasposone-mediata mutagenesi per identificare nuovi regolatori di mucoidy in P. aeruginosa. Più specificamente, si biparentally coniugato il vettore pFAC contenente un trasposone mini-himar1 da E. coli SM10/λpir nel nonmucoid prototrofici ceppo PAO1. Dopo il trasposone è integrato nel genoma, il ceppo ricevente è in coltura su agar isolamento Pseudomonas (PIA) contenente triclosan che inibisce la crescita di E. coli. Così, una libreria di mutanti di P. aeruginosa può essere selezionato dalla crescita su PIA piastra integrata con gentamicina e la presenza del fenotipo mucoide. Nota, una vera trasposone-mediata contro un mutante integrazione avrà un fenotipo resistente e carbenicillina sensibile gentamicina. In questo studio, circa 80.000 mutanti inserimento di PAO1 sono stati isolati attraverso quattro coniugazioni separate. Abbiamo poi proiettato per isolati mucoidi, e determinato il sito di inserimento da enzimi di restrizione, la legatura e inversa PCR. Abbiamo eseguito analisi Southern blot utilizzando la cassetta di resistenza gentamicina come sonda per vedere il numero di inserimento per genoma. Abbiamo determinato che oltre il 90% dei mutanti ottenuti per coniugazione usando questo protocollo aveva solo una singola copia del himar1 nel genoma e visualizzato il fenotipo resistente e carbenicillina sensibile gentamicina. Un totale di 32 ceppi mucoidi sono stati identificati, 22 di loro sono stati mappati a diversi loci del P. aeruginosa PAO1cromosoma. Questo tasso di inserimento prevede una copertura adeguata per individuare alcuni nuovi regolatori di sovrapproduzione alginato.

Protocollo

1. Preparazione di ceppi batterici e biparental Coniugazione

1. Seminare E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml di Luria Broth (LB), completata con 15 mg / ml di gentamicina e posto in un incubatore agitazione durante la notte a 37 ° C.
2. Seminare P. aeruginosa ceppo PAO1 in 5 ml di LB, e posto in un incubatore agitazione per una notte a 42 ° C.
3. Misurare OD ₆₀₀ di culture durante la notte e mescolare quantità uguali di PAO1 ed E. coli pFAC tale che il volume finale è compreso tra 1-1,4 ml.
4. Miscela centrifugare a 6000 xg per 5 min.
5. Nel frattempo, asciugare piastre LB per la coniugazione: lasciare aperte le piastre in termostato a 37 ° C per 10-15 minuti.
6. Rimuovere tutti ma 50 ml di surnatante dalla miscela di cellule.
7. Risospendere il pellet di cellule nei rimanenti 50 ml di surnatante e pipetta su una piastra LB secco in una gocciolina compatto.
8. Posizionare con cautela la piastra in una cappa aspirante a secco (IMPONella documentazione, Nota: Non lasciare che le cellule si sviluppa su piastra, questo diminuiranno in modo significativo l'efficienza del coniugazione).
9. Una volta che la goccia è asciutto, capovolgere la piastra LB e incubare a 37 ° C per 4-6 ore.
10. Mentre la miscela cella è in incubazione, preparare grandi (150 OD x 15 mm), piastre PIA con 300 mg / ml di gentamicina. Prima dell'uso, rimuovere l'umidità residua ponendo in un incubatore a 37 ° C per 15-20 min.
11. Dopo l'incubazione della miscela di cellule è completa, raccogliere le cellule utilizzando un'ansa sterile inoculazione e in una provetta contenente 1 ml di LB e vortice, o pipetta, fino a completa dissoluzione.
12. Stendere le cellule in modo uniforme sulle grandi tavole PIA contengono 300 mg / ml di gentamicina. (IMPORTANTE: Per questo passaggio, è meglio aggiungere crescenti volumi della miscela di cellule per separare le piastre (ad es Tavola 1: 10 ml, Piatto 2: 50 microlitri, Tavola 3: 100 ml, Tavola 4: 500 microlitri, ecc) .
13. Incubare una notte a 37° C.

2. Rilevazione e isolamento delle colonie mucoidi

1. Rimuovere le piastre da incubatrice ed esaminare per le colonie mucoidi.
2. Isolare una singola colonia mucoide e strisciare per l'isolamento su piccoli piatti (100 OD x 10 mm) con PIA e 300 pg / ml di gentamicina.
3. Incubare una notte a 37 ° C.
4. Ripetere passo 2.2 sulla precedente cultura durante la notte.
5. Ripetere i passaggi 2,2-2,4 altre due volte per determinare la stabilità dell'isolato mucoide.
6. Al termine del passo isolare finale, inoculare 4,5 ml di LB con una singola colonia mucoide e incubare in shaker notte a 37 ° C.
7. Il giorno dopo, etichetta 3 tubi microcentrifuga per ogni mutante mucoide.
8. Preparare due 1,25 ml aliquote di cultura durante la notte in 2 tubi per l'estrazione del DNA genomico e identificazione del sito di inserzione del trasposone (vedi protocollo 3).
9. Inoltre, archiviare ogni mutante mucoid pipettando 1 ml di coltura durante la notte in un NECESSARIOely esageratamente marcato contenenti un volume uguale di latte scremato 10%. Conservare a -86 ° C.

3. gDNA restrizione Digestione e legatura

1. Estrarre gDNA dal mutante mucoide utilizzando qualsiasi metodo preferito (ad es. Fenolo-cloroformio, colonnine, ecc).
2. Determinare la concentrazione della gDNA, digerire un totale di 2 mg con 1 ml di endonucleasi di restrizione SalI, 0,5 ml di albumina di siero bovino, 5 microlitri di tampone SalI enzima (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl ₂ , 1 Dithiothrietol mM (DTT), pH 7,9 a temperatura ambiente), e il volume appropriato di dH ₂ O per ottenere un volume totale di 50 microlitri.
3. Digerire il DNA notte a 37 ° C. (IMPORTANTE:. Funzione dell'efficienza dell'enzima di restrizione, può essere necessario aggiungere un ulteriore 1 microlitri al pernottamento digest e incubare a 37 ° C per 1-2 ore Questo è in aggiunta al pernottamento digest.)
4. Purificare il DigeDNA STED utilizzando qualsiasi metodo preferito (ad esempio agarosio purificazione gel, colonne di rotazione) ed eluire con 25 microlitri di tampone.
5. Legare il DNA digerito miscelando 11 ml di DNA purificato con una concentrazione preferita di ~ 10-20 ng / ml, 1,5 ml di tampone di ligazione (330 mM Tris-acetato pH 7,5, 660 mM acetato di potassio, 100 mM di acetato di magnesio, 5 mM DTT), 1,5 ml di 100 mM ATP e 1 ml DNA ligasi.
6. Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente, e quindi inattivare l'enzima incubando per 15 min a 70 ° C. (Nota: L'incubazione la miscela a temperatura ambiente per più può aumentare il successo della legatura).

4. PCR inversa (IPCR) e analisi di sequenza

1. Eseguire IPCR sul prodotto legatura utilizzando il seguente forward e reverse primer e le condizioni di ciclo termico:
   -Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
   -Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
   Thermocycler Condizioni:
   1. 94 ° C per 1 min.
   2. 94 ° C per 1 min.
   3. 58 ° C per 2 min.
   4. 72 ° C per 2 min.
   5. 72 ° C per 8 min.
   6. 10 ° C attesa.
   Ripetere i passaggi 2-4 per 34 cicli.
   (NOTA: prodotti Amplified IPCR possono essere conservati a 4 ° C.)
2. Eseguire gel elettroforesi per confermare il successo di amplificazione IPCR.
3. Eseguire il sequenziamento del prodotto IPCR utilizzando i primer Gm3OUT e Gm5OUT. Il sito di inserzione e l'orientamento di himar1 vengono mappate.

Risultati

Come illustrato nella Figura 1, il mini-himar1 mariner trasposone vettore, pFAC, contiene due ripetizioni invertite 27 bp con siti di inserzione TA fiancheggianti la cassetta resistenza aacC1 gentamicina, con il suo promotore σ ^{70-dipendente,} e un sito di clonazione multipla (MCS). Inoltre, il vettore pFAC contiene i geni che codificano la transposase altamente attiva himar1, β-lattamasi (bla), e l'operone trasferimento tra. I siti di inserzi...

Discussione

È importante notare che questo metodo può essere utilizzato in altre specie Pseudomonas con queste alterazioni: incubare P. fluorescens e P. putida a 30 ° C, e P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri deve essere coltivato su piastre LB addizionato con 150 mg / ml di gentamicina, sul passo 1.11, pag cellule stutzeri devono essere trasferiti in 500 ml di LB invece di 1 ml. Inoltre, ci sono due passaggi critici per questo protocollo. In primo luogo, il ceppo ricev...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 ml Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific